专利名称：一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用的制作方法
一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用。
背景技术：
长薄鳅为中国特有鱼类，主要分布在长江中上游及其支流。长薄鳅是鳅科鱼类中生长最快、个体最大的一种，其体色艳丽，肉味鲜美，是一种既可观赏又可食用的名优经济鱼类，具有重要的开发价值。由于长江上游大型水水利工程的梯级开发，过度捕捞，环境污染等原因，长薄鳅资源量急剧的减少，已被列入《中国物种红色名录》。随着长薄鳅种质保护和恢复、增殖放流及人工养殖工作的开展，分子生物学领域的研究工作也不断的深入，准确的掌握长薄鳅的遗传变异水平对其种群恢复和资源增值有着十分重要的意义。
微卫星标记(SSR, Simple Sequence Repeat)具有等位基因数目多、重复性好、呈共显性等优点，开发微卫星分子标记，是构建分子遗传图谱、检测遗传多样性、研究遗传结构和基因流，进而实施分子辅助育种的有效工具。但现有的技术中，还没有报道过长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记。该技术在国内外均属于空白。发明内容
本发明的目的是提供一种条带清晰、多态性高的，可以在长薄鳅中应用的四碱基重复单元的微卫星分子标记。
本发明所采用的技术方案是:
一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，包括以下步骤:
( I)长薄鳅基因组DNA微卫星序列的获得:
利用生物素四碱基重复探针和长薄鳅基因组酶切片段杂交，然后采用磁珠富集法获取长薄鳅基因组中的四碱基重复单元微卫星片段，经过克隆、阳性鉴定后进行测序，最终筛选出的13个多态性高的微卫星位点，用SSRHunter软件查找四碱基重复次数大于5的微卫星DNA序列；
(2)微卫星引物的设计:
在四碱基重复单元微卫星侧翼，用软件PRMER3.0设计引物，引物长度为18-25bp，GC含量30-70% ，退火温度大于50°C，扩增片段的长度为100_350bp ；
(3)微卫星标记标记引物的检测:
对设计的微卫星标记引物进行PCR扩增，反应在MJ-100PCR仪上进行，扩增程序为:94°C预变性2分钟，35个循环，最后72°C延伸10分钟。反应体系为:正反引物各0.2μΜ，0.2mM dNTP, IXPCR Buffer, 2.0mM Mg2+，Taq 酶 0.5U, 10_50ngDNA 模板，用蒸馏水补足到总体积到10 μ I。模板为随机挑选的6个长薄鳅样本。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，银染观察微卫星条带多态性情况，最后得到13对条带清晰、多态性高的长薄鳅微卫星分子标记。
优选地，所述步骤(3)中，35个循环的条件为94°C变性40秒，52_65°C退火30秒，72°C延伸40秒。
进一步地，所述13对长薄鳅微卫星分子标记，可以为长薄鳅分子辅助育种提供有力工具，同时有助于长薄鳅遗传学和分子生物学的进一步研究。
本发明具有以下优点:
本发明是一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，利用该构建方法得到的13对引物能在长薄鳅样本中扩展出条带清晰、多态性高的微卫星条带。本发明开发的微卫星分子标记，可以为长薄鳅分子辅助育种提供有力工具，同时有助于长薄鳅遗传学和分子生物学的进一步研究。
图1为本发明实施例中Lef3位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图2为本发明实施例中Lef4位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图3为本发明实施例中Lef5位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图4为本发明实施例中Lef7位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图5为本发明实施例中LeflO位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图6为本发明实施例中Lefll位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图7为本发明实施例中Lef 14位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图8为本发明实施例中Lef 17位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图9为本发明实施例中Lef23位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图10为本发明实施例中Lef24位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图11为本发明实施例中Lef31位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图12为本发明实施例中Lef35位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图13为本发明实施例中Lef 39位点的微卫星引物扩增24个长薄鳅DNA的银染图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，包括以下步骤:
( 1)长薄鳅基因组DNA微卫星序列的获得:
利用生物素四碱基重复探针和长薄鳅基因组酶切片段杂交，然后采用磁珠富集法获取长薄鳅基因组中的四碱基重复单元微卫星片段，经过克隆、阳性鉴定后进行测序，最终筛选出的13个多态性高的微卫星位点，用SSRHunter软件查找四碱基重复次数大于5的微卫星DNA序列。筛选出的13个多态性高的微卫星位点如下所述:
>Lef3
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编号重复元件重复次数起始位置
ITATC972
>Lef4
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编号重复元件重复次数起始位置
ITCTA1840
>Lef5
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编号重复元件重复次数起始位置
ITCTG9175
>Lef7
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编号重复元件重复次数起始位置
ITCTA21187
>LeflO
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编号重复元件重复次数起始位置
ITGTC6204
2TCTA20226
>Lefll
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编号重复元件重复次数起始位置
1GATA25227
>Lefl4
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编号重复元件重复次数起始位置
1GATA7240
>Lefl7
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编号重复元件重复次数起始位置
1GATA18125
>Lef23
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编号重复元件重复次数起始位置 1GAAA558 2AGAC1277 3AGAC10129
>Lef24
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编号重复元件重复次数起始位置
IAGAT10108
>Let31
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编号重复元件重复次数起始位置
IGATA1363
2 AGAC5114
>Let35
CGTGGATAATAAGGATCAGCTAGGCTAACTGTGACAGCGTGGGCCAATTTTCCGGCCTGCTGAGTCTGTAAGGAGTTTCTCTGGAACACACGACTGGAGCCGGGGAGTTTTCAATGGAGTGTTTGTGTGAGAGAAGAACGCACAGGGTTCAGAGTGAGAGTTTGTGAAAAAAACAAGGGCAGCTTGTTTTACAACTCCATCTTTTCTCCCCCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAGGTAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGACAGATGAACAAACAGAGCAAACCTACAGATGTCTTCCTCATAATGGCTTACTCTTATTCTACCT
编号重复元件重复次数起始位置
ICTAT23212
2 AGAC7310
>Let39
CGTTGAGAGTGCAAAACCTAAAATATAAATATTACAAAGGTATGTAAAAAATGAATAATAACACAAATATCTCTATTATATATCTGTAATTTCTACCATGGATAAACAGATACACACATGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGATATATGATAAACACAAGCGCACAGCAGGGAAAGTGCAGGTAGGGAGGGGCGAAATCGAACCTCATTGGT
编号重复元件重复次数起始位置
I GATA20123
(2)微卫星引物的设计:
在四碱基重复单元微卫星侧翼，用软件PRMER3.0设计引物，引物长度为18-25bp，GC含量30-70%，退火温度 大于50°C，扩增片段的长度为100_350bp ；
(3)微卫星标记引物的检测:
对设计的微卫星标记引物进行PCR扩增，反应在MJ-100PCR仪上进行，扩增程序为:94°C预变性2分钟，35个循环(94°C变性40秒，52-65 °C退火30秒，72°C延伸40秒)，最后72°C延伸10分钟。反应体系为:正反引物各0.2 μ M，0.2mM dNTP, IXPCR Buffer, 2.0mMMg2+，Taq酶0.5U, 10_50ngDNA模板，用蒸馏水补足到总体积到10 μ I。模板为随机挑选的6个长薄鳅样本。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，银染观察微卫星条带多态性情况，最后得到13对条带清晰、多态性高的长薄鳅微卫星标记引物，如表I所述。
表113对长薄鳅四碱基重复单元微卫星标记引物
权利要求
1.一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)长薄鳅基因组DNA微卫星序列的获得: 利用生物素四碱基重复探针和长薄鳅基因组酶切片段杂交，然后采用磁珠富集法获取长薄鳅基因组中的四碱基重复单元微卫星片段，经过克隆、阳性鉴定后进行测序，最终筛选出的13对多态性高的微卫星位点，用SSRHunter软件查找四碱基重复次数大于5的微卫星DNA序列； (2)微卫星引物的设计: 在四碱基重复单元微卫星侧翼，用软件PRMER3.0设计引物，引物长度为18-25bp，GC含量30-70%，退火温度大于50°C，扩增片段的长度为100-350bp ； (3)微卫星标记标记引物的检测: 对设计的微卫星标记引物进行PCR扩增，反应在MJ-100PCR仪上进行，扩增程序为:94°C预变性2分钟，35个循环，最后72°C延伸10分钟。反应体系为:正反引物各0.2 μ M，0.2mM dNTP, IXPCR Buffer, 1.5-2.5mMMg2+，Taq 酶 0.5U, 10_50ngDNA 模板，用蒸馏水补足到总体积到 ο μ I。模板为随机挑选的6个长薄鳅样本。用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测，银染观察微卫星条带多态性情况，最后得到13对条带清晰、多态性高的长薄鳅微卫星分子标记。
2.根据权利要求1所述的长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，35个循环的条件为94°C变性40秒，52-65°C退火30秒，72°C延伸40秒。
3.一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的应用，其特征在于，所述13对长薄鳅微卫星分子标记，可以为长薄鳅分子辅助育种提供有力工具，同时有助于长薄鳅遗传学和分子生物学的进一步研究 。
全文摘要
本发明公开了一种长薄鳅四碱基重复单元微卫星分子标记的构建方法及其应用，属于分子生物学DNA标记技术与应用领域。该微卫星分子标记的构建方法包括长薄鳅微卫星四碱基重复单元富集文库的构建，微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，根据长薄鳅四碱基重复核心序列，在其两端设计特异性引物，经PCR扩增检测，最终筛选得到了13对多态性高的微卫星分子标记。本发明主要应用于长薄鳅资源监测、遗传多样性分析、遗传图谱构建和分子辅助育种等方面。
文档编号C12Q1/68GK103173442SQ20131007029
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者刘红艳, 熊飞 申请人:江汉大学