基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒及其分型方法
【专利摘要】基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒及其分型方法，涉及单核苷酸多态性。试剂盒包括实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照；CYP2C19*3为NCBI所提供人10号染色体CYP2C19基因中的SNP位点。检测分型方法：采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA；采用所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒提供的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；根据检测到的荧光信号对人CYP2C19基因单核苷酸多态性位点CYP2C19*3进行分型。AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。
【专利说明】
基于AI IGI 〇探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒及其分型方法
技术领域
[00011本发明涉及单核苷酸多态性(SNP)，尤其是涉及一种基于AllGlo探针的CYP2C19*3 检测分型试剂盒及其分型方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一 种。SNPs在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达 300万个甚至更多。作为第三代遗传标志，SNP与人体许多表型差异、药物易感性与疾病易感 性密切相关。SNP在基因组中的大量存在，使其成为一个强有力的工具，在疾病定位与克隆、 药物的设计和测试以及生物学的基础研究中起了非常重要的作用。
[0003] 个体化诊断治疗是未来医学发展的大方向。将个体化的靶点定位于某个基因，甚 至是单个核苷酸，发现疾病的遗传标志物，将有助于根据每个患者的不同遗传背景来开展 疾病预防、诊断和治疗。基因的SNP是形成个体间差异的重要遗传学基础，通过SNP与疾病和 药物治疗的关联性分析，使得医生不仅可以通过所检测出的SNP预测、确定与疾病有关的基 因，同时也将能够事先把握患者个体对于某种药物的反应特点，并根据这一特点选择治疗 效果最好，不良反应等危险性最小的药物对患者进行精准治疗。
[0004] SNP在疾病的预防、诊断、治疗及个体化医学发展中扮演着重要的角色，因此准确 快速的进行SNP检测分型具有重大的意义。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接测序技术法、限制性片段长度多态性技术 (RFLP)、Tagman荧光探针法、扩增阻滞突变系统(ARMS)、高分辨熔解曲线分析法(HRM)等。其 中，直接测序法是目前最直观，准确性相对而言最高的SNP分型方法，但其步骤多而分散，成 本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测;限制性片段长度多态性技 术(RFLP)作为一种最早的DNA标记技术，对仪器要求低，只需要一台PCR仪以及电泳仪器即 可进行实验，但其实验操作繁琐，检测周期长，不适合大样本检测;Tagman荧光探针法准确 度较好，但其设计合成程序复杂，并且不适合多位点少量样本的分型，尤其是频率偏低的位 点；扩增阻滞突变系统(ARMS法)快速、简便，但是不能闭管操作，对基因多态性分析难以实 现高通量、自动化;高分辨熔解曲线分析法(HRM)具有简单、快速等优点，但该方法特异性不 足，仪器选择少。
[0006] AllGlo探针作为新一代的荧光探针，在具备TaqMan-MGB探针优点的基础上，大大 提高信噪比，减少背景荧光信号。目前，AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突变（Feng，Z.L.Yu，X.Y.Lu，Z.M.Geng，D.Y.Zhang，L.Chen，S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta，2011，412( 11-12) :1018-1021 )、侵袭性曲霉菌病（Wu，D.S.Shen，J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 氯吡格雷(波立维)是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于 急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠心病的一级二级预防，可以减少心血管疾病患者心脏病 发作、卒中以及死亡的风险。近年来的研究发现，氯吡格雷体内生物学功能的实现与细胞色 素酶P4502C19(CYP2C19)有重要的联系（Kazui M，Nishiya Y，Ishizuka T，Hagihara K, Farid ΝΑ,et al·(2010)Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite.Drug Metab Dispos 38:92-99)〇CYP2C19*3 是CYP2C19基因的一个SNP位点，在外显子4第636位发生G/A突变，产生了提前的终止密码， 蛋白合成终止，使CYP2C19酶活性丧失，进而降低氯吡格雷的药用效能(Hulot JS，Bura A， Villard Ε,Αζ?ζ? M,Remones V,et al.(2006)Cytochrome P4502C191oss-〇f-function polymorphism is a major determinant of clopidogrel responsiveness in healthy sub jects. Blood 108 :2244-2247)。2010年美国食品药品监督管理局（FDA)曾发出警示， CYP2C19*3基因携带者不能有效将氯吡格雷转化为活性产物，故不能像CYP2C19*1基因携带 者一样从氯吡格雷抗血小板的作用中获益。因此服用氯吡格雷的患者需先进行CYP2C19*3 检测分型（Administration.FaD.FDA Drug Safety Communication:Reduced effectiveness of Plavix(clopidogrel)in patients who are poor metabolizers of the drug.:U.S.Food and Drug Administration；2010[cited 2011Nov17]；[4screen] .Available from:http://www · fda · gov/Drugs/DrugSafety /) 〇 用药前对患者进行 CYP2C19*3的检测分型，能够为患者选择最佳的治疗用药，提供合适的治疗剂量，为临床用 药提供重要的参考依据。在个体化诊断与治疗快速发展的背景下，CYP2C19*3与药物代谢的 紧密联系使其成为了一个极具医学潜力的SNP位点，因此急需一种更快速高效的SNP分型方 法来满足精准医学的发展。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于针对现有检测SNP方法中使用的试剂盒和检测方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒。
[0009] 本发明的目的之二在于提供基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型方法。
[0010] 所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，包括实时荧光定量PCR试剂、 阳性对照及阴性对照；
[0011] 所述CYP2C19*3为美国国家生物技术信息中心（NCBI)所提供人10号染色体 CYP2C19基因中的SNP位点。
[0012] 所述实时荧光定量PCR试剂包括以下组份：10 X Taq缓冲液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、10μ mol/L CYP2C19*3的特异正向引物、lOymol/L CYP2C19*3的特异反向引物和AllGlo探针；10 XTaq缓冲液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013]所述CYP2C19*3的特异正向引物的核苷酸序列为：
[0014] SEQ ID N0·1:5，-GATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3，；
[0015] 所述CYP2C19*3的特异反向引物的核苷酸序列为：
[0016] SEQ ID NO^^^AAAATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-S^
[0017] 所述AllGlo探针为CYP2C19*3的特异探针，其核苷酸序列为：
[0018] SEQ ID N0.3：CYP2C19*3-G:MAR-CCCCCTGGATCCAG-MAR；
[0019] SEQ ID N0.4:CYP2C19*3-A:JUP-CCCCCTGAATCCAG-JUP。
[0020] 所述阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品；所述 阳性纯合对照品1为CYP2C19*3分型为GG的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为CYP2C19*3分 型为AA的DNA样品，所述阳性杂合对照品为CYP2C19*3分型为GA的DNA样品。
[0021 ]所述阴性对照为lmL的无核酶水。
[0022] 所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型方法，包括以下步骤：
[0023] 1)采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒提供的实时荧光定量 PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增；
[0025] 3)根据检测到的荧光信号对人CYP2C19基因单核苷酸多态性位点CYP2C19*3进行 分型。
[0026] 所述AllGlo探针可米用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探针，它拥有普通Taqman，Taqman_MGB及分子信标(molecular beacon)探针所有优点，克 服了目前这几种探针的最大弊端，它打破了传统Taqman-端报告基团一端淬灭基团的限 制，利用了美国AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的几种常见波长的特制焚 光染料，标记在寡核苷酸上面互为报告基团和粹灭基团，而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火温度)的化学基团，提高探针特异性，杂交特异性大大提高，在杂交水解之后两端标 记的染料又全部变为报告基团，提高荧光增量。
[0027] 所述AllGlo探针具有以下优势：
[0028] ①提高Tm值(可达10°C以上），探针更短可以达到15~16个碱基，可以适用A，T含量 比较高的序列设计探针；
[0029] ②加大了多重荧光定量的选择，因为每种染料即是报告基团又是淬灭基团，打破 传统Taqman探针因波长原因标记选择困难，不受淬灭基团波长限制；
[0030] ③大大提高信噪比，无背景信号，空间距离近，更好的淬灭效果；
[0031 ]④成本较低，价格仅相当于Taqman-MGB探针的一半，具有MGB探针所有优势。
[0032]本发明采用了 AllGlo探针技术，设计了特异性引物和相应的AllGlo探针，探针分 别标记2种特殊荧光基团(MAR、JUP)，并对该技术反应条件进行优化，建立了一种AllGlo探 针SNP检测分型方法，应用前景广阔。
[0033]本发明的有益效果如下：
[0034]本发明提供了一种基于AllGlo探针的SNP检测分型试剂盒和检测方法，其特异性 和敏感性高，可快速准确进行SNP分型，与现有的常见技术相比具有以下优势：
[0035] 1.与直接测序法相比，AllGlo探针在保持高特异性和敏感性的前提下，检测价格 比直接测序法更低廉，并且过程更简易耗时更短。
[0036] 2.与taqman-MGB探针相比，AllGlo探针采用相同的荧光基团，互为报告基团和淬 灭基团，一方面释放的荧光信号更强，另一方面本底信号更低;而且合成程序简单，价格仅 相当于Taqman-MGB的一半。
[0037] 3.与限制性片段长度多态性技术(RFLP)相比，基于AllGlo探针的SNP分型方法将 反应时间大大缩短，通量更大，并且敏感性与特异性要明显高于基于限制性酶切位点的SNP 分型方法。
[0038] 4.与扩增阻滞突变系统(ARMS)相比，基于AllGlo探针SNP分型方法检测灵敏度更 强，可以实现"闭管操作"，有效防止外界污染，具有良好的特异性和准确性。
[0039] 5 .与高分辨熔解曲线分析法(HRM)相比，基于A11G1 〇探针SNP分型方法特异性更 高，并且多种仪器可应用AllGlo探针进行SNP检测分型，可用仪器选择多，不需要特定技术 人员操作，应用范围更广阔。
[0040] 6.本发明建立了基于AllGlo探针进行CYP2C19*3的检测分型方法，适合人群进行 个体化的SNP检测分型，推动了 SNP在临床药物研究及个体化用药的发展。
【具体实施方式】 [0041 ] 实施例1
[0042] 本发明基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒包括以下组份：
[0043] 实时荧光定量PCR试剂、阳性对照及阴性对照。
[0044] ①实时荧光定量PCR试剂包括以下组份:10 X Taq缓冲液(10 X Taq缓冲液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl)、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、10ymol/L CYP2C19*3的特异正向引物、10 μ mol/L CYP2C19*3的特异反向引物和AllGlo探针。
[0045] ②阳性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品。所述阳 性纯合对照品1为CYP2C19*3分型为GG的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为CYP2C19*3分型 为AA的DNA样品，所述阳性杂合对照品为CYP2C19*3分型为GA的DNA样品。
[0046] ③阴性对照为lmL的无核酶水。
[0047] 实施例2
[0048] 外周血CYP2C19*3检测分型，包括以下步骤：
[0049] 1.收集EDTA抗凝外周血：
[0050] 抽取新鲜血液标本2mL装于EDTA抗凝管并分装多管，每管分装400~500yL，取200μ L用于DNA提取，其余全血标本置于-80 °C冻存。
[0051 ] 2.提取 DNA:
[0052]采用天根生物科技有限公司的生产的血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，按照操 作说明书进行样本(全血)DNA提取，200yLEDTA抗凝全血按照说明书操作进行，最后用50yL 的洗脱缓冲液TB溶解DNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度，取 纯度A260/A280比值在1.7~1.9之间，取浓度10~50ng/yL的已提取的DNA用于SNP分型检 测，其余的DNA均于-80 °C冻存。
[0053] 3.实时荧光定量PCR扩增：
[0054] 3.1将荧光定量PCR的各组分置于室温溶解，混匀后置于冰上。
[0055] 3.2配制卩0?反应混合液如表1。
[0056] 表1
[0058] 3.3于8联管中分装配制好PCR反应混合液，每管加入lyL的DNA，充分混匀，整个过 程在冰上进行，避免气泡的产生。每次实验设置一个阴性对照，设置一个阳性纯合对照品1， 一个阳性纯合对照品2和一个阳性杂合对照品。
[0059] 3.4检测在实时荧光定量PCR仪器上进行，可使用ABI7300,7500(美国Applied Biosystems公司）等多种仪器。
[0060] 3.5设置荧光定量PCR反应条件如表2。
[0061] 表 2
[0063] 4.结果分析与处理:应用ABI仪器自带软件进行结果分析。根据对照扩增结果，分 型产生三种基因型：
[0064] 第一种基因型:GG，与阳性纯合对照品1在同一轴上；
[0065] 第二种基因型:GA，与阳性杂合对照品在同一轴上；
[0066]第三种基因型:AA，与阳性纯合对照品2在同一轴上。
[0067] 实施例3.组织样本SNP检测分型
[0068] 1 ·组织样本处理：
[0069] 组织(脾组织用量应少10mg)应打碎处理为细胞悬液，然后lOOOOrpm(~11200Xg) 离心lmin，倒尽上清，加200yL缓冲液GA(天根DNA提取试剂盒DP304)，震荡至彻底悬浮；
[0070] 2.组织样本DNA提取和富集：
[0071]采用天根生物科技有限公司的生产的DNA提取试剂盒(DP304)，按照操作说明书进 行组织样本的DNA提取，最后用50yL的洗脱缓冲液TE溶解DNA，于核酸分光光度仪器Nano Drop2000上分别测定浓度和纯度；
[0072] 3.组织样本的SNP检测分型。
[0073]后续步骤参照实施例2的步骤3~4。
[0074] 可应用范围：
[0075]基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒及其检测方法可应用于人类组织样 本和血细胞CYP2C19*3的检测分型，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发 明的优点。
【主权项】
1. 基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于包括实时荧光定量PCR试 剂、阳性对照及阴性对照； 所述CYP2C19*3为美国国家生物技术信息中心所提供人10号染色体CYP2C19基因中的 SNP位点。2. 如权利要求1所述基于A1 lGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述实 时荧光定量PCR试剂包括以下组份：lOXTaq缓冲液、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL无核酶水、ΙΟμ mol/L CYP2C19*3的特异正向引物、lOymol/L CYP2C19*3的特异反向引物和AllGlo探针；10 X Taq 缓冲液包括l〇〇m mol Tris-HCl和500m mol KC1。3. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述 CYP2C19*3的特异正向引物的核苷酸序列为： SEQ ID NO.1：5;-GATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3;； 所述CYP2C19*3的特异反向引物的核苷酸序列为： SEQ ID NO^^^AAAATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-S^4. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述 AllGlo探针为CYP2C19*3的特异探针，其核苷酸序列为： SEQ ID N0.3：CYP2C19*3-G:MAR-CCCCCTGGATCCAG-MAR； SEQ ID N0.4:CYP2C19*3-A:JUP-CCCCCTGAATCCAG-JUP。5. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述阳 性对照包括：阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2、阳性杂合对照品；所述阳性纯合对照品1 为CYP2C19*3分型为GG的DNA样品，所述阳性纯合对照品2为CYP2C19*3分型为AA的DNA样品， 所述阳性杂合对照品为CYP2C19*3分型为GA的DNA样品。6. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述阴 性对照为1 mL的无核酶水。7. 基于A1 lGlo探针的CYP2C19*3检测分型方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 采用常规方法提取EDTA抗凝全血样本中的DNA; 2) 采用如权利要求1~6中任一所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒提供 的实时荧光定量PCR试剂将DNA进行实时荧光定量PCR扩增； 3) 根据检测到的荧光信号对人CYP2C19基因单核苷酸多态性位点CYP2C19*3进行分型。8. 如权利要求1所述基于AllGlo探针的CYP2C19*3检测分型试剂盒，其特征在于所述 AllGlo探针采用美国AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定量探针。
【文档编号】C12Q1/68GK105969841SQ201610083688
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年2月6日
【发明人】张忠英, 方宜臻
【申请人】厦门大学附属中山医院, 张忠英