一种狭鳕鱼皮素及其应用
【专利摘要】本发明公开一种狭鳕鱼素及其应用，属于生化技术领域，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；加水，混匀后升温至50～60℃，调节pH至7.0，加复合蛋白酶，酶解2～3小时；升温至60～90℃保持10分钟，使酶灭活；采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20～30分钟，收集酶解上清液；将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。本发明的鳕鱼皮素能预防由UVB辐射诱导所致的皮肤鳞状细胞癌，给药方法为皮肤外用，涂抹，不仅对零海拔有效，对高原人群也有效。
【专利说明】
一种狭鳕鱼皮素及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生化技术领域，特别涉及一种狭鳕鱼皮素及其应用。
【背景技术】
[0002] 皮肤鳞状细胞癌简称鳞癌，又名表皮癌，是发生于表皮或附属器细胞的一种恶性 肿瘤，癌细胞有不同程度的角化。多见于有鳞状上皮覆盖的部位，如皮肤、口腔、唇、食管、子 宫颈、阴道等处。此外，有些部位如支气管、膀胱、肾盂等处虽无鳞状上皮覆盖，但可通过鳞 状上皮化生而形成鳞状细胞癌。
[0003] 随着工业化的发展，目前环境污染严重，雾霾天气越来越多，人们皮肤非常容易被 空气中的有害物质污染，在这种空气中皮肤非常容易发生癌变，目前，市场上有不少品种的 药治疗皮肤病，价格昂贵，西药为主，负作用大。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种狭鳕鱼皮素及其应用，解决现有的预防皮肤鳞状细胞癌药物负 作用大的问题。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0006] 本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0007] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0008] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量20~40%的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加 入鳕鱼皮重量〇. 1~〇. 2%的复合蛋白酶，50~60°C的条件下酶解2~3小时;其中，加入的复 合蛋白酶是天然的蛋白酶；
[0009] 3)灭活:升温至60~90°C保持10分钟，使酶灭活；
[0010] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20~30分钟，收集酶解上清液；
[0011] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0012] 其中，优选地，组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。
[0013] 本发明并提供了狭鳕鱼皮素在制备预防皮肤鳞状细胞癌药物中应用。
[0014] 其中，优选地，所述药物配制成外用给药制剂。
[0015] 其中，优选地，所述外用给药制剂中狭鳕鱼皮素的含量为5~25%。
[0016] 为了更好的理解本发明的实质，下面提供本发明狭鳕鱼皮素预防UVB诱导的小鼠 皮肤癌药效学试验。
[0017] 实验方法：
[0018] 1紫外线UVB辐射昆明种无毛小鼠致皮肤癌模型的制备
[0019] (1)制备鼠固定器
[0020] 长宽高分别为：25cmxl8cmx3cm
[0021 ] (2)随机将昆明种无毛小鼠分为双蒸水涂抹未照射组，模型组，给药组(5 % CPWPS 组，20%CPWPS组，阳性对照组(5 %维生素 C组））5组，模型组13只，其他组各组5只，按设计方 案给药。背部外涂（1ml/只/天），用相同规格的毛刷蘸取药物均匀涂布于每只小鼠背部，尽 量保证涂布均匀。涂后避光2h后，将动物置于特制的鼠固定器内，暴露其背部相应部位皮 肤，置UVB特殊光源下，单次辐射剂量1 luw/cm2，单次辐射4h，每天辐照强度为180mJ/cm2，在5 周，10周，15周，20周，25周时分别取模型组两只无毛小鼠的皮肤，直至25周后，处死所有的 动物，取皮肤组织。
[0022] 2用相机记录各个时期老鼠皮肤的变化情况
[0023] 3HE 检测
[0024] 皮肤石蜡包埋:皮肤组织切下后4%多聚甲醛固定24小时，自来水冲洗12h，浸75% 乙醇lh，85 %乙醇lh，95 %乙醇lh，新的95 %乙醇再浸lh，100%酒精各浸lh，二甲苯5min，重 复一次，浸软蜡1.5h，硬蜡lh。将组织块放入模具中，倒入硬蜡包埋，硬蜡:软蜡=3:1，将冷 却好的腊块取出装在切片固定器上，切片机切成5um的组织块，把切好的切片在40°C温水中 展开，贴在载玻片上，晾干，60°C烤片3h后备用。
[0025] 1.HE染色：将烘干的切片浸入二甲苯1中脱蜡lOmin-将切片从二甲苯1移入二甲 苯2中浸泡lOmin-移入95%的酒精浸泡15min-移入95%的酒精2内浸泡5min-移入80% 的酒精内浸泡2min-蒸馏水洗净切片上的酒精-移入苏木精染液中染色5min-自来水洗 3min-0.5 %盐酸酒精溶液分化数秒，镜检着色程度-自来水充分洗净近20min-蒸馏水洗 两次-伊红染液染色2min-系列乙醇脱水，80%乙醇3〇8-95%乙醇3〇8-无水乙醇1内浸 泡2min-无水乙醇2内浸泡2min-透明，移入二甲苯1内浸泡2min-二甲苯2内浸泡2min- 中性树胶封片，显微镜观察。
[0026] 4免疫组织化学
[0027] 1.脱蜡，将切片放入二甲苯1内浸泡5min-二甲苯2内浸泡5min-100 %无水乙醇1 内浸泡3min-100%无水乙醇2内浸泡3min-95%乙醇1内浸泡3min-95%乙醇2内浸泡 3min-85 %乙醇内浸泡3min-75 %乙醇内浸泡3min-蒸馏水内浸泡3min。
[0028] 2.灭活内源性酶，用蒸馏水新鲜配制3 %H202，将配好的H202滴在玻片的各个组织 上，室温放置8min，PBS洗3次，每次3min。
[0029] 3.封闭蛋白间孔隙，滴加5%BSA封闭液，室温放置20min，甩去组织上的液体，不清 洗。
[0030] 4.孵育一抗，用PBS稀释一抗，PCNA，EGFR，P-AKT，AQP3，AQP9抗体的稀释倍数分别 为：1:200，1:500，1:100，1:300，1:300。每个组织滴加20ul，4°C过夜，PBS洗3次，每次3min。
[0031] 5.滴加二抗，每个组织滴加20ul，37°C lh后，PBS洗3次，每次3min。
[0032] 2.滴加 SABC，SABC与二抗结合，每个组织滴加20ul，37 °C放置30min，PBS洗4次，每 次5min〇
[0033] 6.DAB显色，A，B，C液各一滴，加入lml的蒸馏水内，混匀后加至切片，镜下控制反应 时间，5-30min后蒸馏水洗涤。
[0034] 7.苏木素染色，浸入苏木素内30s拿出脱水透明，75 %乙醇-85 %乙醇-95%乙醇 -95%乙醇-100%乙醇-100%乙醇内各浸泡30s-二甲苯内浸泡lmin-复染后自来水洗 4次。
[0035] 8.封片，中性树胶封片，晾干后显微镜观察。
[0036] 5肿瘤观察
[0037]随着持续的UVB照射，模型组前五周无毛鼠的皮肤干燥，弹性差，出现红斑，长鳞 肩，第十周，脱肩，掉毛，12周开始出现帽针尖大小丘疹，疑似肿瘤丘疹，20周丘疹进一步增 多，25周进而变成菜花样瘤体。模型组首次出现肿瘤的时间为UVB照射12周时，而阳性对照 组VC组首次出现为第13周，狭鳕鱼皮素两组出现肿瘤的时间均比阳性对照组晚，且25周时 平均每只老鼠身上的肿瘤个数较阳性对照组少。
[0038] 表1UVB照射无毛鼠后首次出现肿瘤的时间及肿瘤个数(25周时，n = 5)
[0041 ] 5.1UVB长期辐射后对无毛鼠皮肤影响的HE染色
[0042] HE的结果显示昆明种有毛小鼠皮肤组织结构完整，层次清晰，毛囊及汗腺丰富，昆 明种无毛小鼠皮肤组织表皮层较有毛小鼠薄，毛囊及汗腺较有毛小鼠少，其他均无不同， (由于正常组5，10，15，20，25周皮肤病理表现差距不大，实验则选择五周的正常皮肤作为对 照)UVB照射5周后，模型组无毛小鼠皮肤表皮层较正常组变厚，尤其是棘层;照射10周后，棘 层肥厚，表皮突不规则轻度向下延伸；照射15周后，角化过度更加明显，开始出现癌巢，表皮 内出现假性角囊肿；照射20周后，角化过度相对15周进一步明显，癌巢增多，黑色素轻微沉 积，细胞异型性;照射25周后，黑色素沉积明显，高度的角化过度，弥漫的异型性细胞，癌巢 进一步增多且明显，部分伴有鳞癌角珠。而各给药组较模型组均有不同程度的症状减轻。阳 性对照组与模型组比较癌巢少，而5 %的CPWPS组比模型组表皮增生增厚程度轻，角化程度 轻。20 %的CPWPS组症状最轻，无弥漫的异型性细胞，无鳞癌角珠。
[0043] 5.2UVB辐射无毛鼠后PCNA表达的变化
[0044] 在本实验中正常组无毛小鼠 PCNA的着色强度为浅黄色，用Image-Pro Plus
[0045] 6.0软件分析平均光密度值，25周时模型组无毛小鼠 PCNA的表达量明显升高，着色 强度为深褐色，与正常组相比，在皮肤癌模型中PCNA高表达(P〈0.05)，以上指标证明模型在 25周已形成，所以之后测的是25周各组蛋白表达情况。
[0046] 表2UVB辐射后PCNA的表达量化的平均光密度值
[0048] 5.3鳕鱼皮素下调UVB损伤后皮肤中EGFR蛋白表达
[0049] 25周时，正常组EGFR的平均光密度值为0.007，模型组的表达量为0.070，模型组与 正常组相比，表达量明显升高(P〈〇.05);与阳性对照VC组比较也有降低;与模型组比较，5% 和20 %的CPWPS组EGFR表达量明显降低(P〈0.05)，且低于5 % VC组，20 % CPWPS组EGFR的表达 量较5%的CPWPS也降低。
[0050] 5.4鳕鱼皮素下调UVB损伤后皮肤中P-AkT蛋白的表达
[0051 ] UVB照射25后，模型组P-AKT的表达量明显升高，较正常组(P〈0.05)，同时期与模型 组比较，5 % CPWPS的P-AKT表达量降低;提前加入20 % CPWPS预防的组经过25周UVB的照射后 P-AKT的表达较模型组明显降低，降低了49.8% (P〈0.05)，且明显低于VC组P-AKT的表达。 [0052] 5.5鳕鱼皮素抑制UVB损伤后皮肤中AQP3的表达
[0053] 模型组无毛鼠经过25周的照射后AQP3的表达显著上升，与正常对照组比较（P〈 0.05)，VC组较模型组比较，AQP3的表达量明显降低(P〈0.05); 5%CPWPS组与模型组比较， AQP3的表达量降低(P〈0.05);20% CPWPS组与模型组比较，AQP3的表达量显著降低，降低了 58.0%(卩〈0.05)，且低于5%〇卩冊3组。
[0054] 5.6鳕鱼皮素对UVB损伤后皮肤中AQP9表达的影响
[0055] 在UVB照射前给予各给药组相应剂量的涂抹，两小时后进行UVB照射，25周后模型 组无毛鼠与非UVB辐射组比较AQP9的蛋白表达量上升（P〈0.05)，但表达量低于AQP3，5 % CPWPS组与模型组比较，AQP9的表达量降低(？〈0.05);20%0?1?3组与模型组比较4〇?9的表 达量显著降低，降低了62.6% (P〈0.05)。
[0056] 6 结论
[0057] 1.模拟日光紫外线B长期慢性照射(单次辐射剂量10mJ/cm2)，成功建立昆明种无 毛小鼠皮肤癌的模型。
[0058] 2.动物实验结果显示，EGFR、AKT、AQP3、AQP9均参与了皮肤癌的发生过程，在肿瘤 形成中各蛋白表达量均升高，且首次发现AQP9在皮肤癌中高表达。
[0059] 3.狭鳕鱼皮素均对皮肤癌有预防作用，且20 %CPWPS的预防作用最好，其预防作用 可能与抑制EGFR、AKT、AQP3、AQP9蛋白的表达有关。
[0060] 4.本发明的鳕鱼皮素预防的是UVB辐射诱导所致的皮肤鳞状细胞癌，给药方法为 皮肤外用，涂抹，不仅对零海拔有效，对高原人群也有效。
【具体实施方式】
[0061 ]下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的内容仅仅是本发 明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0062] 实施例1
[0063]本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0064] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0065] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量30 %的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加入鳕 鱼皮重量〇. 15 %的复合蛋白酶，50~60°C的条件下酶解2.5小时；
[0066] 3)灭活:升温至75°C保持10分钟，使酶灭活；
[0067] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心25分钟，收集酶解上清液；
[0068] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0069]得到的狭鳕鱼素组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.90%，3000-5000Da，Al8.01%，1000-2999Da，A40.60%，500-999DaA 27.20%，〈500Da占7.31。
[0070] 实施例2
[0071 ]本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0072] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0073] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量20 %的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加入鳕 鱼皮重量〇. 1 %的复合蛋白酶，50~60 °C的条件下酶解2小时；
[0074] 3)灭活:升温至60°C保持10分钟，使酶灭活；
[0075] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20分钟，收集酶解上清液；
[0076] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0077]得到的狭鳕鱼素组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75 %以上。其中，〉 5000Da，A6.91%，3000-5000Da，Al8.00%，1000-2999Da，A40.65%，500-999DaA 27.17%，〈500Da占7.29%
[0078] 实施例3
[0079] 本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0080] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0081 ] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量40 %的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加入鳕 鱼皮重量〇. 2 %的复合蛋白酶，50~60 °C的条件下酶解3小时；
[0082] 3)灭活:升温至90°C保持10分钟，使酶灭活；
[0083] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心30分钟，收集酶解上清液；
[0084] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0085]得到的狭鳕鱼素组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.89%，3000-5000Da，Al8.02%，1000-2999Da，A40.55%，500-999DaA 27.23%，〈500Da占7.33%
[0086] 实施例4
[0087] 本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0088] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0089] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量25 %的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加入鳕 鱼皮重量0.13%的复合蛋白酶，50~60°C的条件下酶解2小时；
[0090] 3)灭活:升温至70°C保持10分钟，使酶灭活；
[0091 ] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心22分钟，收集酶解上清液；
[0092] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0093]得到的狭鳕鱼素组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.90%，3000-5000Da，Al8.01%，1000-2999Da，A40.64%，500-999DaA 27.18%，〈500Da占7.29%。
[0094] 实施例5
[0095] 本发明提供一种狭鳕鱼素，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成：
[0096] 1)原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆；
[0097] 2)酶解:加入鳕鱼皮重量35 %的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0，加入鳕 鱼皮重量〇. 18 %的复合蛋白酶，50~60°C的条件下酶解3小时；
[0098] 3)灭活:升温至80°C保持10分钟，使酶灭活；
[0099] 4)固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心28分钟，收集酶解上清液；
[0100] 5)干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。
[0101]得到的狭鳕鱼素组分中分子量小于3000Da的占组分总数的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.91%，3000-5000Da，Al8.00%，1000-2999Da，A40.62%，500-999DaA 27.19%，〈500Da占7.30%
[0102]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种狭鳕鱼素，其特征在于，它是以狭鳕鱼皮为原料、由以下步骤制备而成： 1) 原料预处理:将鳕鱼皮洗净、切碎，加水进行湿法打浆； 2) 酶解:加入鳕鱼皮重量20~40%的水，混匀后升温至50~60°C，调节pH至7.0,加入鳕 鱼皮重量〇. 1~〇. 2 %的复合蛋白酶，50~60 °C的条件下酶解2~3小时； 3) 灭活:升温至60~90 °C保持10分钟，使酶灭活； 4) 固液分离:采用离心机对鳕鱼皮酶解液离心20~30分钟，收集酶解上清液； 5) 干燥:将酶解上清液进行冷冻干燥成粉末，得狭鳕鱼素。2. 根据权利要求1所述的一种狭鳕鱼素，其特征在于，所述狭鳕鱼素组分中分子量小于 3000Da的占组分总数的75 %以上。3. 权利要求1的狭鳕鱼皮素在制备预防皮肤鳞状细胞癌药物中应用。4. 根据权利要求3所述的狭鳕鱼皮素在制备预防皮肤鳞状细胞癌药物中应用，其特征 在于，所述药物配制成外用给药制剂。5. 根据权利要求4所述的狭鳕鱼皮素在制备预防皮肤鳞状细胞癌药物中应用，其特征 在于，所述外用给药制剂中狭鳕鱼皮素的含量为5~25%。
【文档编号】A61K38/17GK105969831SQ201610322724
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】韩彦弢, 苗德森, 赵晨懿, 王春波, 张德岩, 赵雲琪
【申请人】青岛海博瑞克生物科技有限公司