一种水稻cyp704b2基因突变体及其分子鉴定方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种水稻CYP704B2基因突变体 cyp704B2-2及其分子鉴定方法和应用。
【背景技术】
[0002] 植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的 617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细 胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突 变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子 体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传， 而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的ms2,玉米 的 ms45 和水稻的 mill 等（Aarts 等，1997，The Arabidopsis MALE STERILITY 2protein shares similarity with reductases in elongation/condensation complexes， Plant Journal，12:615-623 ;Albertsen，2006， Male tissue-preferred regulatory sequences of MS45 gene and method of using same，专利号：US7154024B2 ;Hong 等，2012，Somatic and reproductive cell development in rice anther is regulated by a putative glutaredoxin，Plant Cell，24:577-588); -些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南 芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecar pollen和gemini pollen (Oh等，2010， The SIDECAR POLLEN gene encodes a microspore-specific L0B/AS2 domain protein required for the correct timing and orientation of asymmetric cell division， Plant Journal，64:839_50 ;Park 等，1998， The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollenldisrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate，Development，125:3789_99);玉米上还克隆了一个抱子体显性核不 育基因 MS44 (Cigan and Albertsen，1998，Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants，US5750868) ;2)细胞质雄性不育则是由细胞 质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由 细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不 育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质 基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能（Chen and Liu， 2014， Male sterility and fertility restoration in crops， Annu Rev Plant Biol， 65:5. 1-5. 28)。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了 Rf-1，Rf-2, Rf-4, Rf-5等 基因 （Komori 等，2004，Map-based cloning of a fertility restorer gene, Rf-Ij in rice (Oryza sativa L )，Plant Journal，37:315-325 ;Itabashi 等，2011，The fertility restorer gene，Rf2,for Lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein， Plant Journal，65:359-367 ;Tang 等，2014， The rice restorer Rf4for wild-abortive cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein that functions in reduction of WA352 transcripts， Molecular Plant， 7:1497-500 ;Hu 等，2012, The rice pentatricopeptide repeat protein RF5restorers fertility in Hong-Lian Cytoplasmic male-sterile lines via a complex with the glycine-rich protein GRP162,Plant Cell，24:109-22) 〇
[0003] 水稻是我国的民族产业，杂交水稻对提高我国粮食产量发挥了重要作用。目前，我 国杂交水稻累计种植面积超过45亿亩，杂交水稻种植面积已经占到全国水稻种植面积的 55%左右。杂种水稻是选用两个遗传背景不同，同时性状又能互补的水稻品种，通过杂交产 生具有杂种优势的第一代杂交种用于生产。杂交水稻具有明显的杂种优势现象，主要表现 在生长旺盛，根系发达，穗大粒多，抗逆性强等方面。杂交水稻比常规稻增产达30%。目前 我国种植的杂交水稻可分为三系法杂交稻和两系法杂交稻。三系法杂交稻（三系杂交稻） 就是生产这种杂交稻需要三个水稻品系来完成：水稻质核互作雄性不育系、水稻细胞质雄 性不育保持系和水稻细胞质雄性不育恢复系。水稻质核互作雄性不育系（简称不育系，代 号A)有野败型，红莲型等多种细胞质类型。水稻细胞质雄性不育保持系（简称保持系，代号 B)是用来繁殖不育系一种水稻。其细胞核基因型与不育系相同，但含有可育细胞质基因，可 产生可育花粉，能够自交结实。由于保持系的核基因不含恢复基因，因此它给不育系授粉产 生的后代也是不育的。水稻细胞质雄性不育恢复系（简称恢复系，代号R)携带恢复基因， 能够修复细胞质雄性不育性，与不育系杂交产生的杂种（即杂交稻）正常可育。三系育种 法存在感病、品质差、育种效率低等问题。因受恢保关系的制约，95%的水稻资源不能用于 杂交育种。两系法杂交稻利用光温敏核不育突变体，其在长日高温条件下表现雄性不育，可 进行杂交制种，短日低温条件下表现雄性可育，可以自交繁殖。与三系法相比，两系法具有 显著的优越性：不育系与恢复系配组自由，选配优良组合几率大；不育系可一系两用。但是 两系法不育系易受光温环境影响，育种风险巨大。比如在制种期间遇上低温，不育系将转为 可育，产生自交种子，影响杂交种子的纯度；有的两系杂交种遇上高温则不育，影响结实率， 导致减产。因此，寻找新的雄性不育制种方法依然是作物育种上的重要研宄课题。
[0004] 利用人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在水稻上获得了 多种新的不育突变体。cyp704B2突变体是其中之一。这种突变体的花药不产生成熟花 粉粒。这个不育基因已克隆，为CYP704B2基因，属于P450家族，编码区有4个外显子，编 码一个 544 个氨基酸的蛋白（Li 等，2010，Cytochrome P450 family member CYP704B2 catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cutin biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190)〇 CYP704B2基因在减数分裂形成小孢子前后，在绒粘层和小孢子特异性表达。CYP704B2蛋白 参与脂肪酸代谢，而脂肪酸代谢产物是角质和孢粉素前体。CYP704B2的缺失突变，使孢粉素 合成转运受阻，无法正常形成小孢子外壁，小孢子进一步发育受阻，导致完全雄性不育；此 外还造成突变体花药表面角质缺失。cyp704B2突变体来源于粳稻品种9522的钴60辐射诱 变突变体，是由一段3102bp片断缺失引起的突变。该缺失片段包括CYP704B2基因的前部 1732bp，1112bp编码区上游的基因间序列，以及上游基因编码区3' -端的258bp序列。由 于这一突变删除了上游基因的部分序列，因此该突变体可能存在潜在的非目标性状变异， 可能为其利用带来不利影响。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2及其分子鉴定方 法和应用。
[0006] 本发明首先对籼稻品种93-11种子（MtlR )进行钴60辐射诱变处理，种植处理的 种子获M1代植株W1代植株自交产生种子（为11 2代），种植M2代植株，对112代植株进行形态 学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析， 在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研宄。
[0007] 本发明提供的水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其为水稻CYP704B2基因第 1267个碱基之后的2个G碱基缺失；该突变位点位于