一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一条经突变和截短优化获得的与石房蛤毒素 特异性结合的高亲和力适配体，为样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中 和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除奠定了基础。
【背景技术】
[0002] 石房蛤毒素（Saxitoxin，STX)属于麻痹性贝类毒素家族，为胍胺类神经性毒素， 是目前已知的最强有力的小分子神经毒素之一。它来源于多种淡水蓝细菌和海洋甲藻，通 过食物链蓄积于贝类、蟹类等水产品中，主要通过阻断可兴奋细胞表面的钠离子通道，使细 胞膜失去极化状态，从而阻断神经肌肉的传导，导致人类和海洋动物产生麻痹性贝类中毒。 小鼠腹腔注射、静脉注射以及口服的半数致死量LD 5tl分别是S-IOyg kg'3.4yg kg<和 260 yg kg'世界各地都有包括STX在内的麻痹性贝类毒素分布，尤其是欧洲及北美一些 国家。我国东南沿海一带地区也经常发生食用有毒蛤类、螺类、贝类引发的人中毒事件。为 了保证人类的健康不受威胁，对石房蛤毒素进行监测显得尤为重要。联合国卫生组织和联 合国粮农组织规定及推荐的标准是80 μ gSTXeq/lOOg，即每一百克贝类软组织中PSP毒性 的STX当量不得高于80 μ g。
[0003] 人类多因误食含STX的贝类等海产品而发生中毒，中毒症状往往因食入的量不同 而不同。轻度中毒表现为恶心、呕吐、腹泻，局部皮肤有麻或刺痛感。重度中毒后，表现为神 经肌肉麻痹，随意肌无力，呼吸肌收缩无力，血压下降，心率减慢，心律失常，患者多感到身 体有漂浮感，严重中毒15min内就可死亡，STX中毒的死亡率约为10%左右。对STX中毒目 前没有特效药，临床上主要是采取催吐、洗胃，用活性炭吸附胃内的毒素。4-氨基吡啶可以 拮抗STX的毒性作用，起到治疗效果，但4-氨基吡啶毒副作用大，安全剂量范围小。
[0004] 鉴于STX的高危害性和分布的广泛性，世界各国均将其列为水产品安全检 验的必检项目。长期以来一直用于STX检测的方法是国际上公认的小鼠生物学分析 (Jellett, J. F. , Stewartm, J. E. , Laycock, Μ. V. Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II, gonyautoxin II plus III and decarba-moylsaxitoxin with the mouse neuroblastoma cell bioassay· Toxicol. In Vitrol995,9 :57 - 65.)〇然 而，为了减少动物的使用，我们仍需要建立快速，高通量的筛选方法，从而有效的监测STX。 对于一种快速检测方法而言，最关键的部分是STX的识别元件，如常用的抗体和受体等。然 而，目前常用的识别元件仍存在多种不足，例如，抗体的制备有限和动物的使用等。
[0005] 核酸适配体是从随机寡核苷酸序列库中经由SELEX(指数富集性配体系统进化， Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术筛选得到的一段 寡核苷酸序列。由于单链寡核苷酸序列容易形成发卡、假结、G-四连体等二级结构，故能 与靶分子如药物，蛋白质，其他无机或有机分子高亲和力特异性结合。相对于抗体，适配体 存在多种优势，包括其稳定性，低免疫原性，强组织渗透性，高一致性，不需要动物等，故适 配体作为分析识别元件在检测，诊断和治疗方面都很有前景。据报道，NHI研宄团队已经 通过SELEX技术筛选得到一条与STX特异结合的DNA适配体，APTSTX1，可以成为STX快速 高通量检测中候选的分析识别元件APTstxi的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示（Handy，S. M. , Yakesj B. J. , DeGrassej J. a, Campbell, K. , Elliott, C. T. , Kanyuckj K. M. , Degrassej S. L First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule 如1；[11.1'01；!_(3011.2013,61，30 - 37)。然而，关于该适配体的 亲和常数检测、优化及应用尚无相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体。本发明 的另一目的是提供该适配体在制备样品中痕量STX的分离富集试剂中、在制备石房蛤毒素 检测试剂或试剂盒中、在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中，以及在制备去除水体中 石房蛤毒素制剂中等多方面的应用。
[0007] 本发明的主要技术方案是：以APTstxi为基础，通过突变和截短的方法进行优化得 到一条特异性结合STX的高亲和力适配体，命名为M-30f。该寡核苷酸适配体可用于样品中 痕量STX的分离富集，STX的分析检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物的制 备，以及水体中毒素的去除。
[0008] 本发明的第一方面，是提供了一条与石房蛤毒素特异性结合的高亲和力适配体 (M-30f)，其核苷酸序列如下：
[0009] 5'-TTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACAGGTTCATTG-3'（SEQ ID NO :2)。
[0010] 本发明所述的寡核苷酸适配体，在其5'端或3'端可以进行FITC、氨基、生物素或 地高辛化学修饰。
[0011] 2013年，NHI研宄团队通过磁珠法筛选得到可以与小分子STX相结合的适配体 APTSTX1，APTstxi的核苷酸序列如下：
[0012] 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGTAGATGGCTC TAACTCTCCTCT-3'（SEQ ID N0:1)。
[0013] 本发明首先对APTsm进行突变，期望从中找到亲和力更高而并未通过SELEX筛选 出来的序列。我们设计了多条突变序列（包括单点突变及多点突变），将鸟嘌呤核苷酸任 一端或两端的核苷酸也突变为鸟嘌呤核苷酸，因为鸟嘌呤核苷酸为G-四联体结构所必需。 借助QGRS Mapper软件进行结构预测，我们将可能折叠成G-四联体结构的序列进行合成并 采用生物膜干涉的方法进行亲和力测定。与原始序列相比，其中部分序列亲和力得到提高， 而亲和力最高的是M-30，128nM，比APT sm提高了 30倍。在此基础上，我们对M-30进行进 一步截短，分别将两端的游离序列和茎-环结构逐个移除，并进行亲和力测定。通过对这些 截短序列的结构与亲和力之间的关系进行分析，我们发现其结合STX的核心序列是5'端的 两个茎-环结构。将其他多余的核苷酸移除后，我们得到M-30f，通过生物膜干涉的方法测 得其Kd值为133nM，保留了与STX的高亲和力。并且该适配体与STX的基因类似物GTX2, 3 并不结合，表现出与STX结合的高特异性。
[0014] 本发明的第二方面，是提供了上述适配体M-30f在制备样品中STX的分离富集试 剂中的应用。
[0015] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备石房蛤毒素检测试剂或试剂盒中的应 用。所述的试剂或试剂盒可用于快速检测水体或水产品中的STX。
[0016] 本发明还提供了上述适配体M_30f在制备预防或治疗石房蛤毒素中毒药物中的 应用。所述的药物也为中和石房蛤毒素钠离子通道抑制作用的药物、或为石房蛤毒素拮抗 剂等。所述的药物可以缓解、治愈石房蛤毒素中毒导致的恶心、呕吐、腹泻、神经肌肉麻痹、 呼吸无力、血压下降、心率减慢、心律失常等症状。
[0017] 本发明还提供了上述适配体M-30f在制备去除水体或水产品中石房蛤毒素制剂 中的应用。所述的制剂可以完全去除水体或水产品中的石房蛤毒素，或者降低水体或水产 品中石房蛤毒素的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的标准以 下。
[0018] 本发明通过多种方法，例如ELISA、细胞生物学分析和小鼠生物检测等，对M-30f 与STX之间的相互作用进行了研宄。研宄发现，M-30f不仅可以与STX结合，还能拮抗STX 的钠离子通道抑制活性。作为STX的分子识别元件，M-30f具有很好的实际应用前景，可以 用于样品中痕量STX的分离富集，石房蛤毒素的快速检测，中和石房蛤毒素钠离子通道抑 制作用的药物的制备，以及水体中毒素的去除。
[0019] 因此，本发明的M_30f面向实际应用具有巨大的潜力。
【附图说明】
[0020] 图1是全长序列M-30经mfold软件预测得到的二级结构。
[0021 ] 图2是M-30的截短序列的模拟二级结构图。
[0022] 图3是M-30f与STX的结合解离曲线。
[0023] 图4是采用ELISA的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
[0024] 图5是采用细胞学分析的方法对STX进行检测的标准曲线。 图6是采用细胞学分析的方法研宄M-30f与STX之间的相互作用的结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除 非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。
[0027] 实施例1.适配体APTstxi的突变
[0028] 首先，我们向APTsm序列中引入单点突变。我们将序列中鸟嘌呤核苷酸任意一端 的核苷酸突变为鸟嘌呤核苷酸。通过这种方法，我们得到了 22条单点突变的寡核苷酸序列， 突变的位点分别是 3, 6,8, 12,13, 15, 20, 22, 25, 30, 32, 37, 41，43, 48, 50, 55, 57, 58, 60, 61 和64。根据QGRS Mapper软件预测的结果，22条突变序列中有9条序列（M-6, M-8, M-12， M-13，M-15，M-20，M-22，M-30和M-32)可能形成G-四联体结构。我们将上述的9条序列合 成并采用生物膜干涉技术来评价它们的STX结合能力（见表1)。类似地，我们还引入了多 点突变，将鸟嘌呤核苷酸附近的两个或三个核苷酸替代为鸟嘌呤核苷酸，合成了 6条可能 形成G-四联体结构的序列，并通过生物膜干涉的方法评价其STX结合能力（见表2)。在得 到的众多突变序列中，M-30与STX的亲和力最高。
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