第4个外显子。
[0008] 进一步地，水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0009] 本发明提供了含有本发明所述水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的表达载 体。
[0010] 本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。
[0011] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备转基因植物中的应 用。
[0012] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在制备隐性雄性核不育的转 基因水稻中的应用。
[0013] 本发明提供了水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2在水稻改良育种、制种中的 应用。
[0014] 本发明还提供了检测水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记，该分子 标记是由以下引物对扩增得到，所述引物对的核苷酸序列为：
[0015] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0016] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）。
[0017] 本发明提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因水稻中的应用。
[0018] 本发明提供了上述分子标记在水稻种质资源改良中的应用。
[0019] 一种水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2的分子标记的方法，通过下述引物对 扩增待检植物基因组DNA，并检测扩增产物：
[0020] 所述引物对的核苷酸序列为：
[0021] 上游引物 2245_F :AGCTTCGGGGACGACAAGA (如 SEQ ID NO. 2 所示）
[0022] 下游引物 2245_R :TGCGTCATCGCCATGTACGT (如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0023] 如果用上述引物对能够扩增出比野生型93-11扩增产物短2bp的片段，则标志着 该待检植物存在水稻CYP704B2基因突变体cyp704B2-2。
[0024] 本发明提供的突变体优点如下：
[0025] 1)该突变体来源于籼稻骨干亲本品种93-11。该品种已完成了全基因组测序，对 水稻分子育种十分有利。
[0026] 2)文献"Li 等，2010， Cytochrome P450 family member CYP704B2catalyzes the ω-hydroxylation of fatty acids and is required for anther cut in biosynthesis and pollen exine formation in rice，Plant Cell，vol. 22:173-190" 中 的突变体为大片段缺失，不仅CYP704B2基因缺失，而且上游基因3' -端的258个碱基对也 被删除，因此带有潜在的附加效应。而本发明的突变发生在一个CYP704B2基因的第4个外 显子中2个碱基的缺失，使这一基因发生移码突变，转录提前终止，导致CYP704B2蛋白的C 端220个氨基酸缺失，不存在这一潜在的附加效应问题。
[0027] 3)因辐射诱变造成突变位点比野生型少2个碱基对，采用实验室常用的聚丙烯酰 胺凝胶电泳就能开展分子检测，不需要特别的检测技术和方法。
【附图说明】
[0028] 图1是实施例2中2245突变体和野生型的株型与穗型照片。
[0029] 图2是实施例3中2245突变体的显微镜照片。
[0030] 图3是实施例6中2245突变体CYP704B2基因的突变位点及蛋白质翻译终止位点 示意图。
[0031] 图4-a和图4-b组成实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因 DNA 序列的比对图。
[0032] 图5是实施例6中野生型93-11与2245突变体CYP704B2基因蛋白质序列的比对 图。
[0033] 图6是实施例7中野生型93-1U2245突变体CYP704B2基因扩增片段的电泳照片。
[0034] 图7是实施例8中2245X93-11组合匕群体中可育株和不育株CYP704B2基因突 变位点的PCR产物的电泳照片。
[0035] 图8是实施例9的杂交转育的技术路线图。
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038] 实施例1 :钴60辐射诱变突变体库
[0039] 选用籼稻骨干亲本品种93-11作为辐射处理的材料，该品种已完成了全基因组测 序，对水稻分子育种十分有利。
[0040] 2013年夏，于长沙钴60 (6tlCo)辐射93-11种子（Mci代）10公斤，7月种植于海南临 高田间，分单株收获M 1代种子，共收获约6500份种子。
[0041] 选取M1代种子3200个株系，每个株系种植50棵单株。2014年春季，种植于海南临 高田间。移栽后，在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期等经过仔细观察田间性状，筛查 株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，对各类型突变体单株收种保存作为特殊突变体。 每个株系收6个单株，作为突变体库资源保存。
[0042] 实施例2 :M2代种植与性状观察
[0043] 在M2代抽穗、开花期间，在田间对花药的形态进行观察，选取颜色浅白、形态小、花 粉量小等表现异常的花药在显微镜下进行进一步镜检。在编号为2245的家系中发现1株 育性异常的植株，该突变体在营养生长、抽穗期、穗型均与野生型没有明显区别，图1为该 突变体植株与野生型植株的株型（图1左侧）和穗型（图1右侧）对比照片，但花药比野 生型小，颜色浅黄，结实率很低，被选作候选突变体材料进行下一步研宄。
[0044] 实施例3 :花粉镜检，自交，异交
[0045] 通过数碘染着色与不着色花粉比例，统计花粉育性。在体式显微镜下观察2245突 变体小花形态，发现雌蕊与野生型无明显区别，花药比野生型小，颜色较浅。田间采集开花 期小花，用镊子取出花药，在碘-碘化钾溶液（0.6 % KI，0.3 % I2，w/w)中轻轻挤压花药，滴 在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察花粉碘染情况并拍照（图2)。野生型花粉多而染 成蓝黑色，而突变体则看不到花粉粒。
[0046] 同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而2245突变体不结实。用93-11和中 花11为突变体授粉，均可正常结实，得到F 1代种子。表明该突变体为雄性不育突变体，雌 性不受影响。
[0047] 对匕代自交得到F2代种子，种植F2代植株144株，将花药碘染后在显微镜下观察， 其中110株花粉正常碘染，且正常自交结实，34株无花粉，且自然结实率低，符合3:1分离， 表明该不育性状由单个隐性基因控制。
[0048] 实施例4 :叶片采样与DNA提取
[0049] 本项研宄采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：称取约0.1 g叶片，放入 离心管，加入600 μ L CTAB提取缓冲液，5 μ L RNase A，震荡分散，65°C水浴0.5hr，其间轻 摇2-3次；加入等体积氯仿/Tris-饱和酚（1: 1，v/v)，混勾，轻摇IOmin ;4°C 1000 Orpm离 心20min ;转移上清至新管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH值5. 2)、0. 6-1倍体积的冷异丙 醇；轻摇混匀，至絮状沉淀出现；4°C 1000 Orpm离心10min ;弃去上清，用体积百分含量70% 乙醇洗沉淀2次；风干，加入50 μ L I X TE溶解沉淀，-20°C保存。用Nanodrop2000检测DNA 浓度，稀释至l〇ng/L用作PCR模板。
[0050] 实施例5 :PCR反应与产物回收
[0051] 用候选基因0sCYP704B2基因的引物扩增93-11野生型和突变体DNA。
[0052] 用于扩增0sCYP704B2基因的引物对序列见下表1 :
[0053] 表1用于扩增0sCYP704B2的引物对序列
[0054]
[0055] PCR反应体系为：IyL IOX反应缓冲液，0.25yL dNTP，0.25yL正向引物和 0. 25yL反向引物，0. 5U Taq酶，I yL lOng/yL模板DNA，加超纯水将总体积补至10yL。 PCR反应程序为：94-98°C变性l_3min，然后执行以下循环：95°C变性20s，53-58°C复性 20s，72°C延伸30s，30-40个循环。循环结束后72°C补充延伸3-10min，结束反应。配置1. 5% 琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min ;采用市面DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。
[0056] 实施例6 :DNA序列分析
[0057] 将回收所得野生型与突变体的PCR产物DNA采用ABI3730测序仪进行测序，测序 引物分别使用正向引物与反向引物。使用常见DNA序列分析软件DNAman6. O对双向测序结 果进行拼接；2245突变体CYP704B2基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由1928个 碱基组成，将水稻CYP704B2基因的该突变体基因命名为cyp704B2-2。对野生型和突变体 序