调控花青素合成与代谢的小麦新基因TaMYB7D的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控花青素合成与代谢的小麦新基 因 TaMYB7D〇
【背景技术】
[0002] 花青素是植物中重要的次生代谢产物，参与了广泛的生物学过程（Beckwith et al.，2004 ;Downs and Siegelman，1963 ;Lo and Nicholson，1998 ;Vinterhalter et al.， 2007;Zhou and Singh，2002)。作为食物，花青素不仅是优良的食品添加剂，而且具有抗心 率失调，抗癌的功能，降低心血管疾病，肥胖症，糖尿病的发病率（Lietti et al.，1976)。因 此人们需要更多来自水果、蔬菜以及粮食中的花青素（Boyd，2000)，但由于饮食习惯和经济 方面的原因，水果和蔬菜并不能为人们提供足够的花青素 （Butelli et al.，2008)。
[0003] 植物体内花青素合成与代谢的控制主要是通过调控结构基因的表达量来实现的 (Davies and Schwinn，2003)。转录因子WD40、bHLH和MYB形成一个转录调控复合体，调控 着结构基因的表达量，从而控制花青素的合成与代谢（Hernandez et al.，2004)。
[0004] MYB类转录因子是一类DNA结合蛋白，它们在结构上都有一段保守的MYB结构域。 MYB结构域是一段序列特异的能够结合DNA的区域，约由52个氨基酸构成，呈现螺旋-转 角-螺旋的构象。根据MYB结构域数目的差异将MYB类转录因子分为，（1)单一 MYB结构域 汊1/2)蛋白；（2)2个重复1^8结构域〇?21?3)蛋白；（3)3个重复1^8结构域〇?11?21?3)蛋白。 植物中绝大多数的MYB蛋白有2个重复MYB结构域（R2R3) (Martin and Paz-Ares，1997)。 这些MYB蛋白调控了植物中多种生理过程，如毛状体发育（GhMYB109)(Suo et al.，2003)， 圆锥细胞发育（AmMYBMIXTA) (Sugimoto et al·，2000)，茎形态发生（AtMYB13) (Kirik et al.，1998)，赤霉素信号转导（AtMYB33, AtMYB65, AtMYBlOl) (Gocal et al.，2001)，脱水反 应与 ABA 调节（AtMYB2) (Abe et al·，2003 ;Urao et al·，1996)，色氨酸生物合成（ATRl) (Celenza et al.，2005)，调节细胞周期（AtCDC5) (Lin et al.，2007)等。其中的一个分支 调控了花青素合成代谢的生理过程，如ZmCl，PhAN2(Hsuchen and Coe，1973;Shimada et al.，2007) 〇
[0005] MYB类基因对花青素生物合成结构基因的调控一般需要bHLH基因家族成员的参 加。例如，ZmCl和ZmPL对花青素合成代谢的调节需要bHLH基因 ZmR或ZmB参加。ZmCl和 ZmR编码的蛋白通过与BZl (花青素合成代谢的结构基因）启动子的顺式元件直接结合，从 而实现对BZl基因表达的调控（Roth et al.，1991)。虽然单独的ZmCl蛋白能够结合到结 构基因启动子序列的转录元件上，但是只有ZmCl并不能产生转录活性。它还需要ZmR存在， 才能产生转录活性（Lloyd et al.，1992)。bHLH转录因子是通过激活某种未知的能够结合 到结构基因的CIS元件，或者通过从抑制因子上释放ZmCl，从而达到调控花青素合成的目 的（Heine et al.，2004)。也有极少数的MYB转录因子只要其自身过表达就能够诱导花青 素的合成，而不需要bHLH转录因子的协作，如VvMYBAI。利用基因枪介导的瞬时表达技术 单独将VvMYBAI在葡萄的胚性愈伤组织中表达时，能够诱导花青素的合成（Cutanda-Perez et al.，2009)。这一过程不依赖于bHLH转录因子。
[0006] 调控花青素合成的MYB类调控蛋白的DNA结合序列虽然高度相似，但具有特异性。 玉米的ZmCl和ZmR不能够诱导番前果实产生花青素 （Bovy et al.，2002)，而金鱼草中的 AmDel (bHLH) and AmROSEAl(MYB)确能够使得果实呈现紫色。玉米中花青素类化合物生物 合成需要两个早期结构基因 CHSXHI和一个后期结构基因 DFR的表达。这三个结构基因不 受ZmCl和ZmR或ZmCl和ZmB调控，而受单拷贝MYB基因 ZmP的调节（Grotewold et al.， 1991 ;Grotewoldet al.，1994)。研宄发现ZmP蛋白所结合的DNA序列为CCT/AACC，与动物 MYB蛋白的结合序列（C/TAA)有显著差别。P蛋白对DFR启动子激活的前提是有蛋白质的 结合位点。玉米的BZl启动子含有ZmCl结合点，可以被ZmCl激活，但不能被P蛋白活化 (Grotewold et al·，1991 ;Grotewold et al·，1994)。不同植物中的结构基因启动子序列 也有所差异。玉米ZmCl和ZmB基因能够诱导玉米悬浮细胞合成花青素，但是不能够诱导葡 萄胚性愈伤组织细胞产生花青素。这种调控花青素合成与代谢的MYB类转录因子的功能分 化给基因工程改变植物体内的花青素含量和认识自然中与花青素相关性状的变异提供了 机遇和挑战。在小麦中控制红粒性状的主效基因定位于3AL、3BL和3DL染色体，蓝粒性状 定位于4E染色体，紫粒性状定位于2AL和7BL染色体，紫杆性状定位于7BS和7DS，紫色胚 芽鞘定位于7AS，7BS和7DS染色体，紫色花药性状定位于7DS染色体上，紫色叶耳和叶基定 位于10、20、48、68染色体上（刘宝龙，2009)。更多1^8类转录因子的克隆与功能验证将为 解释自然界中颜色性状的差异，和基因工程改良作物提供更多的选择。
【附图说明】
[0007] 图1为PCR扩增Rc位点MYB基因电泳图；
[0008] 图2为高原115、中国春（CS)、Opata、W7984中Rc位点存在的MYB基因的基因组 序列；
[0009] 图3为保守引物TaMYB7-ATG和TaMYB7-TAA PCR扩增高原115、中国春、Opata以 及W7984胚芽鞘cDNA电泳图；
[0010] 图4为TaMYB7D编码区序列及推测的氨基酸序列（阴影部分为保守的R2R3-MYB 结构域，字体大一号的W为MYB结构域保守的色氨酸残基，横线部分表示与bHLH蛋白作用 的D/ELx2R/Kx 3Lx6Lx3Rg构元件，虚线部分为可能的转录激活区）
[0011] 图 5 为植物中 MYB 蛋白系统进化树（AmMIXTA，CAA55725 ;AmR0SEAl，ABB83826 ; AmR0SEA2, ABB83827 ;AmVEN0SA，ABB83828 ;AtCPC，NP_182164 ;AtETC，NP_171645 ;AtFLP， NP_563948 ；AtGLl, AAC97387 ；AtMYB12, ABB03913 ；AtMYB61, NP_172425 ；AtPAPl, ABB03879 ； AtTRY， NP_200132 ;AtTT2, Q9FJA2;AtWER， AAF18939 ;CaA， CAE75745 ;DcMYBl， BAE54312 ; FaMYBl，AAK84064 ;GMYB10, CAD87010 ;LeANTl，AAQ55181 ;MdMYBl-l，ABK58136 ;MdMYBl-2， ABK58137 ;MdMYBl-3, ABK58138 ;NtMYB2, BAA88222 ;PhAN2, AAF66727 ;Ph0D01，AAV98200 ; VvMYB5a, AAS68190 ；VvMYBAl, BAD18977 ；VvMYBA2, BAD18978 ；ZmCl, AAA33482 ；and ZmPL AAA19821 JaMYB-DL KP136432)；
[0012] 图6为植物中部分与花青素合成相关的MYB基因结构图（VvMYBAl，ABllllOl ; ZmCl, AF320613 ；MdMYBl, DQ222406 ；AtTT2, NC 003076 ；VvMYB5a, NC_012014. 3 ；and AtTRIPTYCHON，NC_003076. 8 ;TaMYB-7D，KP136432);
[0013] 图7为TaMYB_7D在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位示意图；
[0014] 图8为高原115不同时期的胚芽鞘TaMYB-7D及结构基因表达分析图（Light表示 光照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0015] 图9为Opata不同时期的胚芽鞘TaMYB_7A及结构基因表达分析图（Light表示光 照条件下，Dark表示暗处理条件下，数字2-6代表种子萌发后的天数）
[0016] 图10为小麦胚芽鞘中的瞬时表达示意图；
[0017] 图11为RIL群体胚芽鞘颜色与TaMYB_7D表达的连锁分析图。
【发明内容】
[0018] 本发明通过拟南芥和玉米中与花青素合成相关的MYB基因 AtTT2和ZmCl序列在 普通小麦基因组测序数据库、乌拉尔图小麦（AA)基因组数据库和节节麦（DD)基因组数据 库中进行同源搜索，7AS、7BS、7DS上各存在一个与MYB基因高度同源的重叠群序列。针对 7AS、7BS、7DS上MYB基因的特异引物设计MYB基因第7同源群的保守引物TaMYB7-ATG (A TGGGGAGGAGGGCGTGCTGTGCCAAGGA)和 TaMYB7-TAA(TTAACCGGCCATGTGCAGGGACTTGAGCC)，从 小麦品种高原115基因组中分离了 3个MYB基因并定位于7A、7B、7D染色体，即TaMYB-7A、 TaMYB-7B、TaMYB-7D，而白色胚芽鞘品种中国春和Opata中仅分离到TaMYB-7A。RT-PCR分析 表明小麦品种高原115紫色胚芽鞘中仅TaMYB_7D基因表达，而在小麦品种中国春和Opata 白色胚芽鞘中没有检测到Rc (紫色胚芽鞘性状位点）基因的表达。同时TaMYB-7D还在高 原115紫色种皮中表达，而在无花青素合成的根、茎、叶中不表达。生物信息学分析表明 TaMYB-7D仅含有1个内含子，其编码蛋白含有2个连续的MYB结构域，为典型的R2R3-MYB 蛋白。植物MYB蛋白系统进化分析表明TaMYB-7D从属于调控花青素生物合成的MYB基因 分支，与玉米中调控花青素代谢的ZmCl亲缘关系较近，具有MYB DNA结合域和转录激活结 构域。
[0019] 亚细胞定位分析表明TaMYB_7D蛋白主要定位于细胞核。瞬时表达功能验证表明 单一的TaMYB-7D能够诱导白色胚芽鞘细胞产生少量花青素，但是单一的ZmR或ZmCl不能 使白色胚芽鞘细胞产生花青素。TaMYB-7D能在玉米的ZmR协同作用下使胚芽鞘细胞产生