一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用，属于水产动物分子营养代谢技术领域。其通过高通量测序和物信息学分析，筛选到调控团头鲂肝脏SIRT1基因的一个microRNA，所述的microRNA为miR?34a。还进行了分子生物学验证，结果显示miR?34a能有效促进团头鲂肝脏SIRT1基因的表达。本发明公开的miR?34a可以作为团头鲂糖代谢相关的分子标记，在团头鲂饲料糖利用和代谢调控中具有重要的实际应用价值。
【专利说明】
-种团头纺饲料糖利用和代谢调控分子标巧mi RNA及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种团头妨饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA及其应用，属于水 产动物分子营养代谢技术领域。
【背景技术】
[0002] 团头妨(Megalobrama amblyce地ala)是一种重要的经济鱼类，在中国淡水养殖系 统中，它具有重要的营养价值和经济价值。根据最新粮农组织渔业和水产养殖统计，我国团 头妨总产量于2014年已经达到78.3万吨。
[0003] 糖是有机体重要的能源和碳源，它能分解产生能量，供有机体生命活动需要，其代 谢的中间产物又可W转变为其他含碳化合物如氨基酸、脂肪、核巧酸等，为动物提供营养物 质。但相较哺乳动物，鱼类对糖的耐受能力相对较弱，摄食高糖饲料不利于鱼类的生长和对 饲料的利用。发明人在前期的研究中发现，翅嘴红銷、异育银娜、团头妨、青鱼长期摄食高水 平碳水化合物日粮会出现糖代谢酶活性下降、血糖持续偏高、应激蛋白表达上升等高糖不 耐受现象，甚至出现肝细胞肿大甚至病变等症状，引发营养代谢综合症。
[0004] MicroRNA(miRNA)是近年来在真核生物体内发现的长度约为22个核巧酸的内源性 小型非编码RNA，能够识别特定的目标mRNA，并在转录组后水平通过促进祀mRNA的降解或抑 制翻译过程而发挥调控基因表达的作用。近年，随着高通量测序技术和分子生物学技术的 发展，microRNAs(miRNAs)在哺乳动物膜岛素分泌、血糖水平和糖代谢中的调控作用逐渐被 确定。如，miR-144可W通过抑制IRSl(膜岛素受体基质1)的表达破坏膜岛素信号造成膜岛 素抵抗。miR-1加表达量的上升与血糖含量和膜岛素抵抗程度呈正相关。miR-30d也能够通 过祀向MAP4K4W及MAFA两个膜岛素转录抑制调控子，进而提高膜岛素的合成。miR-29a和 miR-29b通过减少MCTl的表达量，从而降低线粒体内的ATP与AW比例而导致膜岛素释放降 低。miR-96则能够直接抑制分泌颗粒的表达，从而减少膜岛素的释放。在哺乳动物II型糖尿 病模型研究中，基于组织和基于物种的两种不同方法筛选，通过功能聚类分析发现miR-34a 与膜岛素的释放不足、膜岛素抵抗W及细胞损伤有关，推测miR-34a可能对推进动物高糖代 谢具有重要作用。
[0005] 由于团头妨的基因组和转录组信息尚不完全清楚，因而其miRNA研究也很少。近五 年，不断有研究发现与团头妨生长发育、肌间骨生长、脂肪代谢等相关miRNAs，可见，miRNA 可能在团头妨的生长发育和营养调控过程中发挥了重要作用。在哺乳动物中，发现miR-34a 能够勒!向SIRTl(Silent Information Regulation 1)，通过对关键因子的憐酸化/去憐酸 化、乙酷化/去乙酷化的表观修饰，诱导或抑制膜岛素敏感组织中与代谢相关基因的表达， 是糖代谢的中屯、调节因子。
[0006] 本发明通过对团头妨肝脏组织进行高通量miRNA测序，筛选与团头妨肝脏糖代谢 相关的分子标记，经过生物信息学差异基因表达分析初步选定了调控SIRTl基因的 microRNA，命名为miR-Wa。进一步进行了分子生物学实验，验证结果显示本发明所述的 microRNA可W作为团头妨肝脏糖代谢调控的microRNA分子标记。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种团头妨饲料糖利用和代谢调控分 子标记miRNA及其应用。
[0008] 按照本发明提供的技术方案，一种团头妨饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA， 所述miRNA为miR-34a，具体序列如沈Q ID N0:1所示。
[0009] 所述miRNA的祀标基因是SIRTl，其为团头妨肝脏糖代谢关键基因，具体序列如SEQ ID NO: 2所示。通过巧光定量PCR法检测祀标基因 SIRTl，从而判断糖代谢程度。
[0010] PCR检测时，采用的特异性上游引物化rward primer如SEQ ID NO: 6所示；下游引 物Reverse primer如SEQ ID N0:7所示；所用的内参为团头妨0-actin，上游引物F'orward primer如沈Q ID NO:8所示；下游引物Reverse primer如沈Q ID NO:9所示。
[0011] 所述miR-34a在团头妨摄食高糖饲料后肝脏组织中高表达。采用实时巧光定量PCR 法检测团头妨肝脏组织中miRNA的表达。具体步骤为：（1)提取团头妨肝脏组织总RNA; (2)依 次连接上3'接头和5'RNA接头，RT-PCR反转录成单链CDNA; (3)采用巧光定量PCR试剂盒进行 miR-34a的扩增。
[0012] 所述巧光定量PC时式剂盒，具体包括:反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参 (团头妨5s rRNA)、巧光定量PCR反应液。
[OOK] PCR检测时，所采用的引物对如下：反转录引物RT primer的序列如SEQ ID N0:3所 示；上游引物F'orward primer序列如SEQ ID NO: 4所示；下游引物Reverse primer序列如 沈Q ID NO:5所示。
[0014] 上述的试剂盒应用于团头妨肝脏组织中miR-34a的定量检测。
[0015] 本发明首先选取摄食高糖日粮和适宜糖日粮的团头妨各3尾，送往测序公司进行 高通量small RNA测序，对测序结果进行数据分析，得到新的miRNAW及已知的miRNA,并对 所有的miRNA进行差异分析，对差异的miRNA进行祀基因预测，并对运些祀基因进行G0，KEGG 分析。结合研究目的，选择与糖代谢相关的miRNA进行qPCR验证，采用edgeR进行差异表达 miRNA表达分析，经过筛选，miR-34a作为其中的一个已知miRNA进行验证，序列为SEQ ID NOl，进一步WmiR-34a为研究对象，通过捜索miRanda，!"argetScan，RNAhybrid数据库，预测 出miR-34a调控的祀基因--SIRTl。
[0016] 根据上述的miRNA的序列和SIRTl的序列设计引物序列。
[0017] 采用RT-PCR方法检测5尾摄食高糖日粮团头妨、5尾摄食适宜糖日粮的团头妨肝脏 组织中miR-34a及SIRTl的表达情况，结果显示摄食高糖日粮团头妨肝脏组织中miR-34a的 表达明显高于摄食适宜糖日粮的团头妨肝脏组织，前者是后者的近4.29倍；同样，摄食高糖 日粮团头妨肝脏组织中SIRTl的表达明显高于摄食适宜糖日粮的团头妨肝脏组织，前者是 后者的近3.11倍。
[001引 miRNA对SIRTl基因表达的调控实验结果显示，miR-34a能很好的正调控基因 SIRTl。表明miR-34a可单独作为标志物应用于团头妨日粮高糖代谢的调控。
[0019]本发明的有益效果:本发明提供的团头妨肝脏组织miR-34a的茎环结构，可用于鱼 类miR-34a祀标基因的生物信息学分析。团头妨肝脏组织SIRTl基因序列，可用于鱼类SIRTl 基因的生物信息学分析及定量分析。miR-34a与团头妨日粮高糖代谢的分子调控有很好的 相关性，可用于团头妨日粮高糖利用相关的分子营养学中。本发明检测miR-34a表达水平的 巧光定量PC时式剂盒包含了从RNA提取到巧光定量实验所用的整套试剂，既方便使用，又保 证了结果的一致性。
【附图说明】
[0020] 图1是团头妨肝脏组织中miR-34a的茎环结构图。
[0021] 图2是Real-time PCR检测团头妨肝脏组织中miR-34a的相对表达量。
[0022] 图3是Real-time PCR检测团头妨肝脏组织中SIRTl的相对表达量。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1高通量转录组测序寻找团头妨肝脏组织中差异表达的microRNA
[0024] 选摄食高糖日粮（可消化糖为51%)和适宜糖日粮（可消化糖为34%)团头妨各3 尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min，然后储存于-80°C冰箱， 样本提取总RNA后依次连接上3 '接头和5 ' RNA接头，RT-PCR反转录成单链CDNA，进行PCR扩 增，筛选长度在140-15化P的片段构建Illumina测序文库，文库检测合格后，采用高通量测 序法进行团头妨肝脏组织小RNA测序。对获得的小RNA的Rawdata文库数据运用化St-QC 化1：化：//\￥丽.13；[0；[址01'1]1日1：；[。3.6日131'址日111.日。.址/91'0^'6。13/化319。/)软件对测序数据的质 量进行整体评估，并过滤低质量序列。miRNA前体的标志性发夹结构，能够用来预测新的 HiiRNAo
[0025] 通过对截取一定长度SRNA比对上的基因组序列，探寻其二级结构及Dicer酶切位 点信息、能量等特征，使用11111?麻预测软件組'日日9化1:19://3〇111'。日'〇'旨日.]1日1:/91'〇^'日。13/ mireap/)，获得miR-34a的茎环结构(具体如图1所示）。
[00%]由于每个样本存在测序量的差异，首先需要归一化每个样本中表达的miRNA tag 数(公式：归一化的表达量(TPM) =HiiRNA比对tag数/样品总测序量(M))，采用edgeR对两样 本进行差异分析，判断miRNA表达在两组样本中是否存在显著差异，基于检验结果选取FDR <0.05的miRNA为显著差异表达miRNA。通过分析最终挑选出表达差异明显的miR-34a，序列 为沈Q ID NO: 1，通过捜miRanda JargetScan,RNAhybrid数据库，预测出他调控的祀基因为 SIRTl，具体序列如沈Q ID NO: 2所示。
[0027] 实施例2Rea^time PCR检测团头妨肝脏组织中miR-34a的表达 [00%]随机选取摄食高糖日粮(可消化糖水平为51% )、摄食适宜糖日粮(可消化糖水平 为34%)的团头妨各5尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min。取 肝脏样品50-100mg，按照RNAiso Plus法（TaKaRa公司）抽提总RNA，WDNAase I酶处理过的 RNA W及RT液为模板，按照W下步骤完成miRNA定量PCR。
[00巧](DmiRNA反转录
[0030] 反应体系：在0.2mlPCR反应管中加入：
[0031] RT Primer
[0032] Total RNA(终浓度50化g)化L(根据浓度计算出X的具体数值）
[0033] 反应条件：
[0034] S化ge 1:将混匀的反应溶液置于65°C加热5min，之后放入冰中2min。
[0035] 在上述溶液中加入：
[0036]
[0037] 反应条件：Sl:age 2:16°C30min，42°C60min，85°C，5min。
[0038] (2)miRNA 实时巧光定量 qRT-PCR
[0039] 应用SYBR染料法，对miRNA采用实时定量检测。用团头妨5s rRNA作为定量内参。
[0040] 反应体系参照SYBR?Premix Ex TaqTME (Perfect Real Time)说明书，总反应 体系为25化：
[0041]
[0042] Real Time PCR反应程序：951：5111111;40循环：951：53,601：308
[0043] 最后，利用相对定量算法，按照目的基因的相对表达量计算公式为：Rel.Exp = 2 -A AU，获得miRNA相对表达量。
[0044] 具体对比数据如图2所示。
[0045] 表1团头妨肝脏miRNA-34a基因巧光定量PCR引物 [00461
[0047] 实施例3Rea^time PCR检测团头妨肝脏组织中SIRTl的表达 [004引随机选取摄食高糖日粮(可消化糖水平为51% )、摄食适宜糖日粮(可消化糖水平 为34%)的团头妨各5尾，无菌条件下分别取他们的肝脏组织，取出后速冻于液氮30min，取 肝脏样品50-100mg，按照RNAiso Plus法（TaKaRa公司）抽提总RNA，WDNAase I酶处理过的 RNAW及RT液为模板，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with 神NA Eraser Prime Scripl般RT reagent Kit(大连!"aKaRa公司）使用说明中SY服Green Assay用的操作方法， 进行RT反应，得到下一步反应所需cDNA。
[0049]团头妨肝脏SIRTlmRNA相对量采用SYBG't Primix Ex TaqTM II(Tli 脚aseH Plus化it(大连hkara公司），按照SYBR Green I嵌合巧光法进行Real Time PCR扩增反应 (ABI 7500巧光定量PCR，USA)，Real Time PCR反应体系为20化，反应条件为：Holding 31曰邑6(50°[2111；[]1;95°[3111；[]1);切。1;[叫31日邑6(95°[153;60°[603，循环40次）；1611:0111'￥6 stage(95°C15s，6(TC60s);Date collection(95°C30s，6(TC 15s)。团头妨肝脏SIRTlmRNA表 达水平计算W团头妨e-actin为内参，对得到的各样品Ct值进行均一化处理，应用各自的标 准曲线方法确定其相对水平。
[0050]具体对比数据如图3所示。
[0051 ]表2团头妨肝脏SIRTl基因巧光定量PCR引物 「nnco1
【主权项】
1. 一种团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，其特征是：所述miRNA为miR-34a，具体序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 如权利要求1所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，其特征是：所述 miRNA的靶标基因是SIRT1，其为团头鲂肝脏糖代谢关键基因，具体序列如SEQ ID N0:2所 不。3. 如权利要求1所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，其特征是:通过荧 光定量PCR法检测靶标基因 SIRT1，从而判断糖代谢程度。4. 如权利要求3所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，其特征是:PCR检测 时，采用的特异性上游引物Forward primer如SEQ ID N0:6所示；下游引物Reverse primer 如SEQ ID NO :7所示；所用的内参为团头鲂β-actin，上游引物Forward primer如SEQ ID N0:8所不；下游引物Reverse primer如SEQ ID N0:9所不。5. 如权利要求1所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA，其特征是：所述 miR-34a在团头鲂摄食高糖饲料后肝脏组织中高表达。6. 权利要求1所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA的应用，其特征是:采 用实时荧光定量PCR法检测团头鲂肝脏组织中miRNA的表达。7. 如权利要求6所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA的应用，其特征是具 体步骤为：（1)提取团头鲂肝脏组织总RNA; (2 )依次连接上3 '接头和5 ' RNA接头，RT-PCR反转 录成单链cDNA;(3)采用荧光定量PCR试剂盒进行miR-34a的扩增。8. 如权利要求7所述团头鲂饲料糖利用和代谢调控分子标记miRNA的应用，其特征是所 述荧光定量PCR试剂盒具体包括:反转录试剂、反转录引物、特异性引物、内参，即团头鲂5s rRNA、荧光定量PCR反应液； 具体引物对如下：反转录引物RT primer的序列如SEQ ID N0:3所示；上游引物Forward primer序列如SEQ ID N0:4所示；下游引物Reverse primer序列如SEQ ID N0:5所示。
【文档编号】C12Q1/68GK105861730SQ201610415841
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】缪凌鸿, 戈贤平, 刘波, 任鸣春, 孙盛明, 周群兰
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心