重组微生物及其用途

重组微生物及其用途
【专利摘要】本发明提出了重组微生物及其用途，重组微生物包含异源核酸分子，异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。利用该重组微生物可以有效地用于以脂肪醛为原料制备脂肪醇。
【专利说明】重组微生物及其用途

【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】。具体而言，本发明涉及重组微生物及其用途。

【背景技术】
[0002]脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆剂用表面活性剂的原料之一,在洗漆剂、护肤品、化妆品、药品中有大量运用。脂肪醇最早是由鲸蜡制取的，所得的混合脂肪醇经磺化中和后成为硫酸盐，是最早的一种阴离子洗涤剂。其后开发利用来源比较丰富的椰子油、棕榈油和牛油为原料，水解所得脂肪酸再还原为醇，统称为天然脂肪醇。石油化学工业发展后，以石油产品为原料，生产的脂肪醇称为合成脂肪醇。近年来由于石油原料价格持续高涨，且依靠石油产品为原料的脂肪醇也大量消耗石油的储备量，在资源日益稀缺的今天，这种发展方式将会逐渐淘汰，因此，需要一种更环保、可再生的生产方式。
[0003]目前工业上已经有许多利用微生物生产发酵获得产品的成功实例，这种生产方式能不受环境、地理因素等条件的限制，适于工厂化生产、易于普及等特点。因此对生物能的开发正成为能源研究的热点领域，竞争日趋激烈。
[0004]然而，目前对于微生物发酵生产脂肪醇的研究仍有待深入。


【发明内容】

[0005]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。
[0006]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人首次发现醛还原酶能够对碳原子数为至少8的脂肪醛进行还原处理，并生成脂肪醇。
[0007]由此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组微生物，所述微生物包含异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。由此利用该重组微生物体内的异源核酸分子编码的蛋白质可以将脂肪醛还原成脂肪醇。进而可以实现利用微生物发酵生产脂肪醇。
[0008]另外，根据本发明上述实施例的重组微生物还可以具有下列附加技术特征:
[0009]根据本发明的一个实施例，所述异源核酸编码下列基因至少一种的表达产物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHK Saccharomyces cerevisiaeADH2λSaccharomyces cerevisiae ADH3、Saccharomyces cerevisiae ADH4ΛSaccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此可以在相应基因表达产物的作用下，将脂肪醛还原成脂肪醇。
[0010]根据本发明的一个实施例，所述具有醛还原酶活性的蛋白质具有如SEQ ID No:2、
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 所示的氨基酸序列。由此可以进一步提高异源核酸分子编码表达产物的效率，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪醇的效率。
[0011]根据本发明的一个实施例，所述异源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高重组微生物包含的异源核酸分子编码的蛋白质的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪醇的效率。
[0012]根据本发明的一个实施例，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种，任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种，任选地，所述微生物为酵母或大肠杆菌，任选地，所述微生物为毕赤酵母或酿酒酵母。由此可以进一步提高利用该微生物制备脂肪醇的效率，以便降低生产成本。
[0013]在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于重组微生物的系统，包括:适于转化微生物的载体，所述载体上携带有异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。由此，利用该系统可以有效地将异源核酸分子引入微生物细胞中，从而获得前面所述的重组微生物，进而可以利用该系统获得的重组微生物，还原脂肪醛合成脂肪醇。
[0014]在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备重组微生物的方法，该方法主要包括利用上述用于重组微生物的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。由此，通过该方法能够有效获得重组微生物，进而可以利用该方法获得的重组微生物，通过重组微生物中包含的异源核酸分子编码表达具有醛还原酶活性的蛋白，从而可以利用该蛋白还原脂肪醛合成脂肪醇。
[0015]在本发明的第四方面，本发明提出了一种生产脂肪醇的方法，该方法包括下列步骤:培养前面所述的重组微生物，以便利用所述重组微生物将脂肪醛还原成脂肪醇；以及分离所述脂肪醇。由此，可以利用该方法借助本发明实施例的重组微生物合成脂肪醇。
[0016]根据本发明的实施例，利用包含脂肪醛的培养基培养所述重组微生物。由此可以扩大原料脂肪醛的含量，以便进一步提高生产脂肪醇的效率。
[0017]在本发明的第五方面，本发明提出了一种用于生产脂肪醇的系统，其特征在于，包括:生物反应器，所述生物反应器中设置有前面所述的重组微生物和适于所述微生物生长的培养基，以便使所述微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；以及分离装置，所述分离装置与所述生物反应器相连，用于分离所述脂肪醇。由此，利用本发明的实施例的生产脂肪醇的系统，可以有效地实施前面所述的生产脂肪醇的方法，从而可以有效地用于制备脂肪醇。根据本发明的实施例，所述培养基中包含脂肪醛。由此使得该微生物可以利用培养基中含有的脂肪醛生产脂肪醇，由此可以扩大原料脂肪醛的含量，以便进一步提高生产脂肪醇的效率。
[0018]在本发明的第六方面，本发明提出了一种生产脂肪醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括利用醛还原酶对脂肪醛进行还原处理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子数为至少8。由此，可以有效地通过利用碳原子数为至少8，例如至少20个碳原子的脂肪醛作为底物来获得脂肪醇。根据本发明的实施例，该醛还原酶的形式并不受特别限制，既可以在细胞外作用，也可以在细胞内表达而发挥作用，还可以以固定化酶的形式发挥作用。
[0019]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0021]图1.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的ρΕΧΙΟΟ整合载体，将adhP基因克隆在PET28载体上。
[0022]图2.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PEXlOl整合载体示意图，将adhE基因克隆到pET28载体上。
[0023]图3.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PEX102整合载体示意图，将yqhD基因克隆到pET28载体上。
[0024]图4.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PRLllO整合载体示意图，将Acyl ACP reductase基因克隆到pET28载体上。
[0025]图5.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的pRLlll整合载体示意图，将Acyl ACP reductase基因和adhP基因克隆在酿酒酵母双表达质粒pESC-LEU载体上。
[0026]图6.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PRL112整合载体示意图，将Acyl ACP reductase基因克隆在毕赤酵母表达质粒pA0815载体上。
[0027]图7.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PRL113整合载体示意图，将adhP基因克隆在毕赤酵母表达质粒pA0815载体上。
[0028]图8.显示了根据本发明的一个实施例设计构建的PRL114整合载体示意图，将Acyl ACP reductase基因和adhP基因克隆在毕赤酵母表达质粒pA0815载体上。
[0029]图9.显示了根据本发明的一个实施例进行化学合成高纯度碳十六醛的GC-MS检测结果图。
[0030]图10.显示了根据本发明的一个实施例进行化学体外验证醛合成酶功能的GC-MS检测图。对照代表未加任何醛还原酶蛋白的空白对照组，AdhP代表加了 AdhP醛还原酶的实验组，AdhE代表加了 AdhE醛还原酶的实验组，YqhD代表加了 YqhD醛还原酶的实验组。
[0031]图11.显示了根据本发明的一个实施例检测Acyl ACP reductase还原酶产物的同位素标记TLC结果图。
[0032]图12.显示了构建的重组大肠杆菌RLllO进行诱导表达检测产物的GC-MS结果图。
[0033]图13.显示了构建的重组酿酒酵母RLlll进行诱导表达检测产物的GC-MS结果图。
[0034]图14.显示了构建的重组毕赤酵母RL112进行诱导表达检测产物的GC-MS结果图。

【具体实施方式】
[0035]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0036]在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0037]缩写及术语
[0038]提供下列关于术语和方法的解释以便更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的“包括”表示“包含”，单数形式的“一个”，除非上下明确的另外指出。例如，“包括一个细胞”指包含一个或者多个这类细胞，“包括醒还原酶”指包含一种或者多种醛还原酶肽以及本领域普通技术人员已知的其同等物，等等。术语“或者”是指陈述的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素，除非上下文明确的另外指出。例如“醛还原酶和含脂肪醛的底物。或者所述的微生物”是指醛还原酶、含脂肪醛的底物、含醛还原酶的微生物和含脂肪醛的微生物之间的任一组合。
[0039]除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者实验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例子只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的详细说明和权利要求，本发明的其他特征将是明显。
[0040]登录号:贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号是2011年3月I日由该数据库提供的。
[0041]酶分类号(EC):贯穿本说明书提供的EC编号来自京都基因与基因百科全书(Kyoto Encyclopedia o f Genes and Genomics)维护的 KEGG Ligand 数据库，这由东京大学部分资助。所述EC编号是2011年3月I日由该数据库提供的。
[0042]碳源:通常指适合作为原核生物或者简单真核生物细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于聚合物，糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽，等等。这些包括，例如，各种单糖诸如葡萄糖、低聚糖、多糖、纤维素质、木糖和阿拉伯糖，二糖，诸如蔗糖、饱和或者不饱和的脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。
[0043]可检测的:能够确定出现或者存在。例如，使用下面实施例子提供的方法，从发酵液中产物是可检测的。
[0044]DNA:脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，其包括大部分的有机体(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，其包括4种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，所述碱基上结合有脱氧核糖，而磷酸基与所述脱氧核糖连接。DNA分子中被称为密码子的是核苷酸三联体编码肽的氨基酸。术语密码子还指mRNA中3核苷酸的对应(和互补)序列,所述DNA序列被转录成所述mRNA。
[0045]内源的:当在本文中对核酸分子和特定的细胞或者微生物使用时，是指位于细胞内的核酸序列或者肽，其不是利用重组工程技术导入细胞的。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列诸如激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。
[0046]异源的:本文中对核酸分子和特定的细胞使用时，是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入细胞，则其被认为是异源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是异源的。例如，一旦从细胞X分离的完整编码序列被引入细胞Y，则该编码序列对细胞Y来说是异源核酸，即使X和Y是相同的细胞类型。
[0047]表达:基因的编码信息被转变为细胞的结构与功能诸如蛋白、转移RNA或者核糖体RNA的过程。表达的基因包括那些被转录为mRNA然后被翻译为蛋白的基因，以及那些被转录为RNA但不被翻译为蛋白的基因(例如，核糖体RNAs)。
[0048]发酵肉汤:包括任意支持微生物生命(即主动代谢碳的微生物)的培养基。发酵培养基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。
[0049]分离的:“分离的”生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)已经基本上从该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化，诸如其他染色体的和染色体外的DNA和RNA,以及蛋白。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括在宿主细胞中利用重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。
[0050]微生物:包括来自古细菌域、真细菌域和真核生物域的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状酵母、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语“微生物细胞”可以与“微生物”互换使用。
[0051]核酸分子:包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是正义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。
[0052]可操作的连接:当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作的连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或者表达，则所述启动子与所述编码序列为可操作的连接。通常，可操作连接的DNA序列是连接的，并且必要时在相同阅读框内连接两个蛋白编码区域。作为单个信使RNA串联转录的分离基因的结构被称为操纵子。因此将基因紧密相邻置于单个启动子的转录调节下，例如在质粒载体中，则构成合成操纵子。
[0053]ORF (开放阅读框):不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以被翻译为肽。
[0054]过表达:当基因的转录速率与其内源转录速率相比提高的时候。在一些实例中，过表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测过表达的方法是本领域公知的。例如可以利用RT-PCR评价转录的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝胶分析评价蛋白水平。
[0055]纯化的:术语“纯化的”并不需要绝对的纯度；它只是一个相对术语。因此，例如，纯化的生物燃料或其中间体是指比位于其细胞环境内的产物浓度更高的产物。
[0056]重组:重组核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工组合序列的两个另外分离的序列片段制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分离片段，诸如遗传工程技术，实现这种人工组合。重组还用于描述以下核酸分子，它们已经被人工处理，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物体中发现的相同。重组细胞或者微生物是包含异源核酸分子诸如重组核酸分子的细胞或者微生物。
[0057]转化或者重组细胞:例如通过分子生物学技术，已经被引入核酸分子(诸如编码醛还原酶的核酸分子)的细胞。转化包括能够将核酸分子引入这类细胞的所有技术，包括但不限于，利用病毒载体转染、接合作用、利用质粒载体转化、通过电穿孔的裸DNA引入、脂质体转染和颗粒枪加速。
[0058]在允许产物生成的条件下:任何允许微生物产生所需产物(诸如脂肪醇、烷烃、烯烃等)的发酵条件。发酵条件通常包括温度范围、通气水平和培养基选择，将上述条件组合时允许微生物生长。示例性培养基包括肉汤或者凝胶。通常，培养基包括碳源诸如葡萄糖、果糖、纤维素或者可以被微生物直接代谢的类似物，或者可以在培养基中使用促进代谢碳源的酶。为了确定培养条件是否允许产物生成，将微生物培养8、16或者24小时，收集并分析样品。例如，可以检测样品或者培养基(细胞在其中生长)的细胞中所需产物存在。当分析产物的存在时，可以使用下面实例提供的那些方法。
[0059]载体:作为引入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或者多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传成分。
[0060]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:发明人首次发现醛还原酶能够对碳原子数为至少8的脂肪醛进行还原处理，并生成脂肪醇。
[0061]由此，本发明提出了一种生产脂肪醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括利用醛还原酶对脂肪醛进行还原处理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子数为至少
8。由此，可以有效地通过利用碳原子数为至少8，例如至少20个碳原子的脂肪醛作为底物来获得脂肪醇。根据本发明的实施例，该醛还原酶的形式并不受特别限制，既可以在细胞外作用，也可以在细胞内表达而发挥作用，还可以以固定化酶的形式发挥作用。
[0062]根据本发明的实施例，本发明提出了一种重组微生物，该重组微生物包含异源核酸分子，该异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。由于该异源核酸分子编码的蛋白质具有醛还原酶的活性，因此该蛋白质可以是醛还原酶或者可以具有能够编码醛还原酶的功能等同体。因此该重组微生物具有将脂肪醛还原成脂肪酸的作用。
[0063]根据本发明的一个实施例，异源核酸编码下列基因至少一种的表达产物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHl> Saccharomyces cerevisiaeADH2、Saccharomyces cerevisiae ADH3>Saccharomyces cerevisiae ADH4、Saccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此上述基因可以编码的蛋白质均具有醛还原酶的活性，能够将脂肪醛还原为脂肪醇。同时上述基因编码的蛋白质均具有相同的功能，可以称为功能等同体，本文中所使用的术语“功能等同体”是指这样的一种基因，例如:其能够发挥与醛还原酶相同的功能，但在序列上与醛还原酶有所区别的基因，从而利用该功能等同体同样发挥醛还原酶的功能。因此根据本发明的具体实施例，上述基因的表达产物均具有醛还原酶的活性，因此具有将脂肪醛还原成脂肪醇的功能。
[0064]根据本发明的具体实施例，重组微生物可以利用脂肪醛合成脂肪醇，其中脂肪醛可以是微生物体内合成的脂肪醛，也可是异源添加的脂肪醛。因此，可以将这些脂肪醛用于生产脂肪醇类化合物，以便用于化工原料或者生物燃料。根据本发明的具体实施例，该微生物包括的异源核酸能够编码adhP基因或其功能类似物，该酶可以将脂肪醛还原生产脂肪醇。
[0065]根据本发明的一个实施例，重组微生物中包含的异源核酸分子具有下列所示的核苷酸序列，根据本发明的具体实施例，上述异源核酸分子可以为编码醛还原酶的基因adhp，其核苷酸序列如下:
[0066]atgaaggctgcagttgttacgaaggatcatcatgttgacgttacgtataaaacactgcgctcactgaaacatggcgaagccctgctgaaaatggagtgttgtggtgtatgtcataccgatcttcatgttaagaatggcgattttggtgacaaaaccggcgtaattctgggccatgaaggcatcggtgtggtggcagaagtgggtccaggtgtcacctcattaaaaccaggcgatcgtgccagcgtggcgtggttctacgaaggatgcggtcattgcgaatactgtaacagtggtaacgaaacgctctgccgttcagttaaaaatgccggatacagcgttgatggcgggatggcggaagagtgcatcgtggtcgccgattacgcggtaaaagtgccagatggtctggactcggcggcggccagcagcattacctgtgcgggagtcaccacctacaaagccgttaagctgtcaaaaattcgtccagggcagtggattgctatctacggtcttggcggtctgggtaacctcgccctgcaatacgcgaagaatgtctttaacgccaaagtgatcgccattgatgtcaatgatgagcagttaaaactggcaaccgaaatgggcgcagatttagcgattaactcacacaccgaagacgccgccaaaattgtgcaggagaaaactggtggcgctcacgctgcggtggtaacagcggtagctaaagctgcgtttaactcggcagttgatgctgtccgtgcaggcggtcgtgttgtggctgtcggtctaccgccggagtctatgagcctggatatcccacgtcttgtgctggatggtattgaagtggtcggttcgctggtcggcacgcgccaggatttaactgaagccttccagtttgccgccgaaggtaaagtggtgccgaaagtcgccctgcgtccgttagcggacatcaacaccatctttactgagatggaagaaggcaaaatccgtggccgcatggtgattgatttccgtcactaa (SEQ ID NO:1),
[0067]基因adhp编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0068]MKAAVVTKDHHVDVTYKTLRSLKHGEALLKMECCGVCHTDLHVKNGDFGDKTGVILGHEGIGVVAEVGPGVTSLKP⑶RASVAWFYEGCGHCEYCNSGNETLCRSVKNAGYSVDGGMAEECIVVADYAVKVPDGLDSAAASSITCAGVTTYKAVKLSKIRPGQWIAIYGLGGLGNLALQYAKNVFNAKVIAIDVNDEQLKLATEMGADLAINSHTEDAAKIVQEKTGGAHAAVVTAVAKAAFNSAVDAVRAGGRVVAVGLPPESMSLDIPRLVLDGIEVVGSLVGTRQDLTEAFQFAAEGKVVPKVALRPLADINTIFTEMEEGKIRGRMVIDFRH (SEQ ID NO:2)。
[0069]发明人惊奇地发现，当采用上述异源核酸分子时，所编码的醛还原酶可以将脂肪醛高效地还原为脂肪醇，进而可以进一步提高生产脂肪醇类化合物的效率。
[0070]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶adhE基因，具有如下核苷酸序列:
[0071]atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtaaaaaaagcccagcgtgaatatgccagtttcactcaagagcaagtagacaaaatcttccgcgccgccgctctggctgctgcagatgctcgaatcccactcgcgaaaatggccgttgccgaatccggcatgggtatcgtcgaagataaagtgatcaaaaaccactttgcttctgaatatatctacaacgcctataaagatgaaaaaacctgtggtgttctgtctgaagacgacacttttggtaccatcactatcgctgaaccaatcggtattatttgcggtatcgttccgaccactaacccgacttcaactgctatcttcaaatcgctgatcagtctgaagacccgtaacgccattatcttctccccgcacccgcgtgcaaaagatgccaccaacaaagcggctgatatcgttctgcaggctgctatcgctgccggtgctccgaaagatctgatcggctggatcgatcaaccttctgttgaactgtctaacgcactgatgcaccacccagacatcaacctgatcctcgcgactggtggtccgggcatggttaaagccgcatacagctccggtaaaccagctatcggtgtaggcgcgggcaacactccagttgttatcgatgaaactgctgatatcaaacgtgcagttgcatctgtactgatgtccaaaaccttcgacaacggcgtaatctgtgcttctgaacagtctgttgttgttgttgactctgtttatgacgctgtacgtgaacgttttgcaacccacggcggctatctgttgcagggtaaagagctgaaagctgttcaggatgttatcctgaaaaacggtgcgctgaacgcggctatcgttggtcagccagcctataaaattgctgaactggcaggcttctctgtaccagaaaacaccaagattctgatcggtgaagtgaccgttgttgatgaaagcgaaccgttcgcacatgaaaaactgtccccgactctggcaatgtaccgcgctaaagatttcgaagacgcggtagaaaaagcagagaaactggttgctatgggcggtatcggtcatacctcttgcctgtacactgaccaggataaccaaccggctcgcgtttcttacttcggtcagaaaatgaaaacggcgcgtatcctgattaacaccccagcgtctcagggtggtatcggtgacctgtataacttcaaactcgcaccttccctgactctgggttgtggttcttggggtggtaactccatctctgaaaacgttggtccgaaacacctgatcaacaagaaaaccgttgctaagcgagctgaaaacatgttgtggcacaaacttccgaaatctatctacttccgccgtggctccctgccaatcgcgctggatgaagtgattactgatggccacaaacgtgcgcteatcgtgactgaccgcttcctgttcaacaatggttatgctgatcagatcacttccgtactgaaagcagcaggcgttgaaactgaagtcttcttcgaagtagaagcggacccgaccctgagcatcgttcgtaaaggtgcagaactggcaaactccttcaaaccagacgtgattatcgcgctgggtggtggttccccgatggacgccgcgaagatcatgtgggttatgtacgaacatccggaaactcacttcgaagagctggcgctgcgctttatggatatccgtaaacgtatctacaagttcccgaaaatgggcgtgaaagcgaaaatgatcgctgtcaccaccacttctggtacaggttctgaagtcactccgtttgcggttgtaactgacgacgctactggtcagaaatatccgctggcagactatgcgctgactccggatatggcgattgtcgacgccaacctggttatggacatgccgaagtccctgtgtgctttcggtggtctggacgcagtaactcacgccatggaagcttatgtttctgtactggcatctgagttctctgatggtcaggctctgcaggcactgaaactgctgaaagaatatctgccagcgtcctaccacgaagggtctaaaaatccggtagcgcgtgaacgtgttcacagtgcagcgactatcgcgggtatcgcgtttgcgaacgccttcctgggtgtatgtcactcaatggcgcacaaactgggttcccagttccatattccgcacggtctggcaaacgccctgctgatttgtaacgttattcgctacaatgcgaacgacaacccgaccaagcagactgcattcagccagtatgaccgtccgcaggctcgccgtcgttatgctgaaattgccgaccacttgggtctgagcgcaccgggcgaccgtactgetgetaagatcgagaaactgctggcatggctggaaacgctgaaagctgaactgggtattccgaaatctatccgtgaagctggcgttcaggaagcagacttcctggcgaacgtggataaactgtctgaagatgcattcgatgaccagtgcaccggcgctaacccgcgttacccgctgatctccgagctgaaacagatcctgctggatacctactacggtcgtgattatgtagaaggtgaaactgcagcgaaaaaagaa gccgctccggctaaagctgagaaaaaagcgaaaaaatccgcttaa (SEQ ID No:3)，
[0072]上述醛还原酶adhE基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0073]MAVTNVAELNALVERVKKAQREYASFTQEQVDKIFRAAALAAADARIPLAKMAVAESGMGIVEDKVIKNHFASEYIYNAYKDEKTCGVLSEDDTFGTITIAEPIGIICGIVPTTNPTSTAIFKSLISLKTRNAIIFSPHPRAKDATNKAADIVLQAAIAAGAPKDLIGWIDQPSVELSNALMHHPDINLILATGGPGMVKAAYSSGKPAIGVGAGNTPVVIDETADIKRAVASVLMSKTFDNGVICASEQSVVVVDSVYDAVRERFATHGGYLLQGKELKAVQDVILKNGALNAAIVGQPAYKIAELAGFSVPENTKILIGEVTVVDESEPFAHEKLSPTLAMYRAKDFEDAVEKAEKLVAMGGIGHTSCLYTDQDNQPARVSYFGQKMKTARILINTPASQGGI⑶LYNFKLAPSLTLGCGSWGGNSISENVGPKHLINKKTVAKRAENMLWHKLPKSIYFRRGSLPIALDEVITDGHKRALIVTDRFLFNNGYADQITSVLKAAGVETEVFFEVEADPTLSIVRKGAELANSFKPDVIIALGGGSPMDAAKIMWVMYEHPETHFEELALRFMDIRKRIYKFPKMGVKAKMIAVTTTSGTGSEVTPFAVVTDDATGQKYPLADYALTPDMAIVDANLVMDMPKSLCAFGGLDAVTHAMEAYVSVLASEFSDGQALQALKLLKEYLPASYHEGSKNPVARERVHSAATIAGIAFANAFLGVCHSMAHKLGSQFHIPHGLANALLICNVIRYNANDNPTKQTAFSQYDRPQARRRYAEIADHLGLSAP⑶RTAAKIEKLLAWLETLKAELGIPKSIREAGVQEADFLANVDKLSEDAFDDQCTGANPRYPLISELKQILLDTYYGRDYVEGETAAKKEAAPAKAEKKAKKSA (SEQ ID No:4)0
[0074]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶yqhD基因，具有如下核苷酸序列:
[0075]atgaacaactttaatctgcacaccccaacccgcattctgtttggtaaaggcgcaatcgctggtttacgcgaacaaattcctcacgatgctcgcgtattgattacctacggcggcggcagcgtgaaaaaaaccggcgttctcgatcaagttctggatgccctgaaaggcatggacgtgctggaatttggcggtattgagccaaacccggcttatgaaacgctgatgaacgccgtgaaactggttcgcgaacagaaagtgactttcctgctggcggttggcggcggttctgtactggacggcaccaaatttatcgccgcagcggctaactatccggaaaatatcgatccgtggcacattctgcaaacgggcggtaaagagattaaaagcgccatcccgatgggctgtgtgctgacgctgccagcaaccggttcagaatccaacgcaggcgcggtgatctcccgtaaaaccacaggcgacaagcaggcgttccattctgcccatgttcagccggtatttgccgtgctcgatccggtttatacctacaccctgccgccgcgtcaggtggctaacggcgtagtggacgcctttgtacacaccgtggaacagtatgttaccaaaccggttgatgccaaaattcaggaccgtttcgcagaaggcattttgctgacgctaatcgaagatggtccgaaagccctgaaagagccagaaaactacgatgtgcgcgccaacgtcatgtgggcggcgactcaggcgctgaacggtttgattggcgctggcgtaccgcaggactgggcaacgcatatgctgggccacgaactgactgcgatgcacggtctggatcacgcgcaaacactggctatcgtcctgcctgcactgtggaatgaaaaacgcgataccaagcgcgctaagctgctgcaatatgctgaacgcgtctggaacatcactgaaggttccgatgatgagcgtattgacgccgcgattgccgcaacccgcaatttctttgagcaattaggcgtgccgacccacctctccgactacggtctggacggcagctccatcccggctttgctgaaaaaactggaagagcacggcatgacccaactgggcgaaaatcatgacattacgttggatgtcagccgccgtatatacgaagccgcccgctaa (SEQ ID No:5)，
[0076]上述醛还原酶yqhD基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0077]MNNFNLHTPTRILFGKGAIAGLREQIPHDARVLITYGGGSVKKTGVLDQVLDALKGMDVLEFGGIEPNPAYETLMNAVKLVREQKVTFLLAV GGGSVLDGTKFIAAAANYPENIDPWHILQTGGKEIKSAIPMGCVLTLPATGSESNAGAVISRKTTCDKQAFHSAHVQPVFAVLDPVYTYTLPPRQVANGVVDAFVHTVEQYVTKPVDAKIQDRFAEGILLTLIEDGPKALKEPENYDVRANVMWAATQALNGLIGAGVPQDWATHMLGHELTAMHGLDHAQTLAIVLPALWNEKRDTKRAKLLQYAERVWNITEGSDDERIDAAIAATRNFFEQLGVPTHLSDYGLDGSSIPALLKKLEEHGMTQLGENHDITLDVSRRIYEAAR (SEQ ID No:6)。
[0078]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶yjgB基因，具有如下核苷酸序列:
[0079]atgtcgatgataaaaagctatgccgcaaaagaagcgggcggagaactggaagtttatgagtacgatcccggtgagctgaggccacaagatgttgaagtgcaggtggattactgcgggatctgccattccgatctgtcgatgatcgataacgaatggggattttcacaatatccgctggttgccgggcatgaggtgattgggcgcgtggtggcactcgggagcgccgcgcaggataaaggtttgcaggtcggtcagcgtgtcgggattggctggacggcgcgtagctgtggtcactgcgacgcctgtattagcggtaatcagatcaactgcgagcaaggtgcggtgccgacgattatgaatcgcggtggctttgccgagaagttgcgtgcggactggcaatgggtgattccactgccagaaaatattgatatcgagtccgccgggccgctgttgtgcggcggtatcacggtctttaaaccactgttgatgcaccatatcactgctaccagccgcgttggggtaattggtattggcgggctggggcatatcgctataaaacttctgcacgcaatgggatgcgaggtgacagcctttagttctaatccggcgaaagagcaggaagtgctggcgatgggtgccgataaagtggtgaatagccgcgatccgcaggcactgaaagcactggcggggcagtttgatctcattatcaacaccgtcaacgtcagcctcgactggcagccctattttgaggcgctgacctatggcggtaatttccatacggtcggtgcggttctcacgccgctgtctgttccggcctttacgttaattgcgggcgatcgcagcgtctctggttctgctaccggcacgccttatgagctgcgtaagctgatgcgttttgccgcccgcagcaaggttgcgccgaccaccgaactgttcccgatgtcgaaaattaacgacgccatccagcatgtgcgcgacggtaaggcgcgttaccgcgtggtgttgaaagccgattattga (SEQ ID No -J),
[0080]上述醒还原酶yjgB基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0081]MSMIKSYAAKEAGGELEVYEYDPGELRPQDVEVQVDYCGICHSDLSMIDNEWGFSQYPLVAGHEVIGRVVALGSAAQDKGLQVGQRVGIGWTARSCGHCDACISGNQINCEQGAVPTIMNRGGFAEKLRADWQWVIPLPENIDIESAGPLLCGGITVFKPLLMHHITATSRVGVIGIGGLGHIAIKLLHAMGCEVTAFSSNPAKEQEVLAMGADKVVNSRDPQALKALAGQFDLIINTVNVSLDWQPYFEALTYGGNFHTVGAVLTPLSVPAFTLIAGDRSVSGSATGTPYELRKLMRFAARSKVAPTTELFPMSKINDAIQHVRDGKARYRVVLKADY (SEQ ID No:8)。
[0082]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶yiaY基因，具有如下核苷酸序列:
[0083]atggcatcttcaactttctttattccttctgtgaatgtcatcggcgctgattcattgactgatgcaatgaatatgatggcagattatggatttacccgtaccttaattgtcactgacaatatgttaacgaaattaggtatggcgggtgatgtgcaaaaagcactggaagaacgcaatatttttagcgttatttatgatggcacccaacctaacccaaccacggaaaacgtcgccgcaggtttgaaattacttaaagaaaataattgcgatagcgtgatttccttaggcggtggttctccgcatgactgtgcaaaaggtattgcgctggtggcagccaatggtggtgatatccgtgattatgaaggcgttgaccgctctgcaaaaccgcagctgccgatgatcgccatcaataccactgcgggtacagcatcagaaatgactcgtttctgcatcatcaccgacgaagcgcgtcacatcaaaatggcgattgttgataagcacgtgactccgctgctttctgtcaatgactcctcgctgatgatcggtatgccgaagtcactgaccgccgccactggtatggacgccttaacgcacgctatcgaagcgtatgtttctattgccgccacgccgatcactgacgcttgtgcactgaaagccgtgaccatgattgccgaaaacctgccgttagccgttgaagatggcagtaatgcgaaagcgcgtgaagcaatggcttatgcccagttcctcgccggtatggcgttcaataatgcttctctgggttatgttcatgcgatggcgcaccagctgggcggtttctacaacctgccacacggtgtatgtaacgccgttttgctgccgcatgttcaggtattcaacagcaaagtcgccgccgcacgtctgcgtgactgtgccgctgcaatgggcgtgaacgtgacaggtaaaaacgatgcggaaggtgctgaagcctgcattaacgccatccgtgaactggcgaagaaagtggatatcccggcaggcctacgcgacctgaacgtgaaagaagaagatttcgcggttctggcgactaatgccctgaaagatgcctgtggttttactaacccgatccaggcaactcacgaagaaattgtggcgatttatcgcgcagcgatgta (SEQ ID No:9)，
[0084]上述醛还原酶yiaY基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0085]MASSTFFIPSVNVIGADSLTDAMNMMADYGFTRTLIVTDNMLTKLGMAGDVQKALEERNIFSVIYDGTQPNPTTENVAAGLKLLKENNCDSVISLGGGSPHDCAKGIALVAANGGDIRDYEGVDRSAKPQLPMIAINTTAGTASEMTRFCIITDEARHIKMAIVDKHVTPLLSVNDSSLMIGMPKSLTAATGMDALTHAIEAYVSIAATPITDACALKAVTMIAENLPLAVEDGSNAKAREAMAYAQFLAGMAFNNASLGYVHAMAHQLGGFYNLPHGVCNAVLLPHVQVFNSKVAAARLRDCAAAMGVNVTGKNDAEGAEACINAIRELAKKVDIPAGLRDLNVKEEDFAVLATNALKDACGFTNPIQATHEEIVAIYRAAM (SEQ ID No:10)。
[0086]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶eutG基因，具有如下核苷酸序列:
[0087]atgcaaaatgaattgcagaccgcgctctttcaggcgttcgataccctgaatctgcaacgggtaaaaacatttagcgttccaccggtgacgctttgcggtccgggcgcggtgagcagttgcgggcagcaagcgcaaacgcgtgggctgaaacatctgttcgtgatggcagacagctttttgcatcaggcggggatgaccgccgggctgacgcgcagcctggctgttaaaggcatcgccatgacgctctggccatgtccggtgggcgaaccgtgcattaccgacgtgtgtgcagccgtggcgcagttgcgtgagtcaggctgtgatggggtgatcgcatttggcggcggctcggtgctggatgcggcgaaagccgtggcgttgctggtgacgaaccccgatagcacgctggcagagatgtcagaaaccagcgttctgcaaccgcgcttgccgctgattgccattccaacgaccgccggaaccggctctgaaaccaccaatgtaacggtgattatcgacgcggtgagcgggcgcaagcaggtgttagcccatgcctcgctgatgccggatgtggcgatcctcgacgccgcattgaccgaaggtgtgccgtcgcatgtcacggcgatgaccggcattgatgcgttaacccatgccattgaagcatacagcgccctgaacgctacaccgtttaccgacagcctggcgattggtgccattgcgatgattggcaaatcgctgccgaaagcggtgggctacggtcacgaccttgccgcgcgcgagagcatgttactggcttcatgtatggcgggaatggcgttttccagtgcgggtcttgggttgtgccacgcgatggcgcatcagccgggcgcggcgctgcatattccgcacggtctcgcgaacgccatgttgctgccaacggtgatggaatttaaccggatggtttgtcgtgaacgctttagtcagattggtcgggcactgcgaactaaaaaatccgacgatcgtgacgctattaacgcggtaagtgagetgattgcggaagttgggattggtaaacgactgggcgatgttggtgcgacatctgcgcattacggcgcatgggcgcaggccgcgctggaagatatttgtctgcgcagtaacccgcgtaccgccagcctggagcagattgtcggcctgtacgcagcggcgcaataa (SEQ ID No:11)，
[0088]上述醒还原酶eutG基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0089]MQNELQTALFQAFDTLNLQRVKTFSVPPVTLCGPGAVSSCGQQAQTRGLKHLFVMADSFLHQAGMTAGLTRSLAVKGIAMTLWPCPVGEPCITDVCAAVAQLRESGCDGVIAFGGGSVLDAAKAVALLVTNPDSTLAEMSETSVLQPRLPLIAIPTTAGTGSETTNVTVIIDAVSGRKQVLAHASLMPDVAILDAALTEGVPSHVTAMTGIDALTHAIEAYSALNATPFTDSLAIGAIAMIGKSLPKAVGYGHDLAARESMLLASCMAGMAFSSAGLGLCHAMAHQPGAALHIPHGLANAMLLPTVMEFNRMVCRERFSQIGRALRTKKSDDRDAINAVSELIAEVGIGKRLGDVGATSAHYGAWAQAALEDICLRSNPRTASLEQIVGLYAAAQ (SEQ ID No:12)。
[0090]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶fucO基因，具有如下核苷酸序列:
[0091]atgatggctaacagaatgattctgaacgaaacggcatggtttggtcggggtgctgttggggctttaaccgatgaggtgaaacgccgtggttatcagaaggcgctgatcgtcaccgataaaacgctggtgcaatgcggcgtggtggcgaaagtgaccgataagatggatgctgcagggctggcatgggcgatttacgacggcgtagtgcccaacccaacaattactgtcgtcaaagaagggctcggtgtattccagaatagcggcgcggattacctgatcgctattggtggtggttctccacaggatacttgtaaagcgattggcattatcagcaacaacccggagtttgccgatgtgcgtagcctggaagggctttccccgaccaataaacccagtgtaccgattctggcaatccccaccacagcaggcactgcggcagaagtgaccattaactacgtgatcactgacgaagaaaaacggcgcaagtttgtttgcgttgatccgcatgatatcccgcaggtggcgtttattgacgctgacatgatggatggtatgcctccagcgctgaaagctgcgacgggtgtcgatgcgctcactcatgctattgaggggtatattacccgtggcgcgtgggcgctaaccgatgcactgcacattaaagcgattgaaatcattgctggggcgctgcgaggatcggttgctggtgataaggatgccggagaagaaatagcgctcgggcagtatgttgcgggtatgggcttctcgaatgttgggttagggttggtgcatggtatggcgcatccactgggcgcgttttataacactccacacggtgttgcaaacgccatcctgctaccgcatgtcatgcgctataacgctgactttaccggtgagaagtaccgcgatatcgcgcgcgttatgggcgtgaaagtggaaggtatgagcctggaagaggcgcgtaatgccgctgttgaagcggtgtttgctctcaaccgtgatgtcggtattccgccacatttgcgtgatgttggggtacgcaaggaagacattccggcactggcgcaggcggcactgaatgatgtttgtaccggtggcaacccgcgtgaagcaacgcttgaggatattgtagagctttaccataccgcctggtaa (SEQ ID No: 13),
[0092]上述醛还原酶fucO基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0093]MMANRMILNETAWFGRGAVGALTDEVKRRGYQKALIVTDKTLVQCGVVAKVTDKMDAAGLAWAIYDGVVPNPTITVVKEGLGVFQNSGADYLIAIGGGSPQDTCKAIGIISNNPEFADVRSLEGLSPTNKPSVPILAIPTTAGTAAEVTINYVITDEEKRRKFVCVDPHDIPQVAFIDADMMDGMPPALKAATGVDALTHAIEGYITRGAWALTDALHIKAIEIIAGALRGSVAGDKDAGEEIALGQYVAGMGFSNVGLGLVHGMAHPLGAFYNTPHGVANAILLPHVMRYNADFTGEKYRDIARVMGVKVEGMSLEEARNAAVEAVFALNRDVGIPPHLRDVGVRKEDIPALAQAALNDVCTGGNPREATLEDIVELYHTAW (SEQ ID No:14)。
[0094]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为醛还原酶yd1基因，具有如下核苷酸序列:
[0095]atggatttttctttaactgaagaacaagaactgctgctggccagtattcgcgaactgattacgactaactttccggaagagtatttccgcacctgcgatcaaaacgggacatatccgcgtgagtttatgcgggcgctggcggataacggtatttccatgcttggcgtgccggaagaatttggtggtatccctgcggattacgtcacccaaatgctggcgcagatggaagtgtcaaaatgcggtgctccggcatttttaattaccaacggtcaatgtattcacagtatgcgccgtttcggttctgcagagcagctacgtaaaacggcagaaagcaccctggaaaccggcgaccccgcctatgccctggcgttgacggaaccaggtgctggctcagataacaacagtgccaccaccacttacacgcgtaaaaacggcaaggtttacatcaacggacagaaaacctttattaccggtgcgaaagagtacccgtatatgctggtgttggcgcgcgatccgcaaccgaaagatcccaaaaaagccttcaccctgtggtgggtcgactccagtaagcccggcattaagattaacccgctgcataaaatcggctggcatatgctcagcacctgcgaagtctatctcgacaacgtggaagttgaagagagcgacatggtgggcgaagaaggaatgggtttcctcaatgtgatgtacaactttgagatggagcgcctgatcaacgccgcgcgcagcaccggctttgccgaatgcgcctttgaagatgccgcccgctatgccaaccaacgtatcgcttttggtaagcccattggtcataaccagatgatccaggaaaaactggcgctgatggcgattaagattgacaacatgcgcaacatggtgctgaaagtggcatggcaagccgatcagcatcagtcactgcgcaccagcgcggcgctggcaaaactgtattgcgcacgtaccgcaatggaagtcattgatgatgcgattcaaatcatgggcggtctgggctataccgatgaagcgcgcgtctcccgcttctggcgtgatgtccgttgtgaacgtatcggcggcggtacagacgaaattatgatttacgtagcaggtcggcagatcctgaaagactatcagaacaaataa (SEQ ID No: 15),
[0096]上述醛还原酶yd1基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0097]MDFSLTEEQELLLASIRELITTNFPEEYFRTCDQNGTYPREFMRALADNGISMLGVPEEFGGIPADYVTQMLAQMEVSKCGAPAFLITNGQCIHSMRRFGSAEQLRKTAESTLE1DPAYALALTEPGAGSDNNSATTTYTRKNGKVYINGQKTFITGAKEYPYMLVLARDPQPKDPKKAFTLWWVDSSKPGIKINPLHKIGWHMLSTCEVYLDNVEVEESDMVGEEGMGFLNVMYNFEMERLINAARSTGFAECAFEDAARYANQRIAFGKPIGHNQMIQEKLALMAIKIDNMRNMVLKVAWQADQHQSLRTSAALAKLYCARTAMEVIDDAIQIMGGLGYTDEARVSRFWRDVRCERIGGGTDEIMIYVAGRQILKDYQNK (SEQ ID No:16)。
[0098]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADHl基因，具有如下核苷酸序列:
[0099]atgtctatcccagaaactcaaaaaggtgttatcttctacgaatcccacggtaagttggaatacaaagatattccagttccaaagccaaaggccaacgaattgttgatcaacgttaaatactctggtgtctgtcacactgacttgcacgcttggcacggtgactggccattgccagttaagctaccattagtcggtggtcacgaaggtgccggtgtcgttgteggcatgggtgaaaacgttaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaaatggttgaacggttcttgtatggcctgtgaatactgtgaattgggtaacgaatccaactgtcctcacgctgacttgtctggttacacccacgacggttctttccaacaatacgctaccgctgacgctgttcaagccgctcacattcctcaaggtaccgacttggcccaagtcgcccccatcttgtgtgctggtatcaccgtctacaaggctttgaagtctgctaacttgatggccggtcactgggttgctatctccggtgctgctggtggtctaggttctttggctgttcaatacgccaaggctatgggttacagagtcttgggtattgacggtggtgaaggtaaggaagaattattcagatccatcggtggtgaagtcttcattgacttcactaaggaaaaggacattgtcggtgctgttctaaaggccactgacggtggtgctcacggtgtcatcaacgtttccgtttccgaagccgctattgaagcttctaccagatacgttagagctaacggtaccaccgttttggtcggtatgccagctggtgccaagtgttgttctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccatctctattgttggttcttacgtcggtaacagagctgacaccagagaagctttggacttcttcgccagaggtttggtcaagtctccaatcaaggttgtcggcttgtctaccttgccagaaatttacgaaaagatggaaaagggtcaaatcgttggtagatacgttgttgacacttctaaataa (SEQ ID No:17),
[0100]上述ADHl基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0101]MSIPETQKGVIFYESHGKLEYKDIPVPKPKANELLINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPVKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAAHIPQGTDL.AQVAPILCAGITVYKALKSANLMAGHWVAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGEGKEELFRSIGGEVFIDFTKEKDIVGAVLKATDGGAHGVINVSVSEAAIEASTRYVRANGTTVLVGMPAGAKCCSDVFNQVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSTLPEIYEKMEKGQIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:18)。
[0102]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH2基因，具有如下核苷酸序列:
[0103]atgtctattccagaaactcaaaaagccattatcttctacgaatccaacggcaagttggagcataaggatatcccagttccaaagccaaagcccaacgaattgttaatcaacgtcaagtactctggtgtctgccacaccgatttgcacgcttggcatggtgactggccattgccaactaagttaccattagttggtggtcacgaaggtgccggtgtcgttgteggcatgggtgaaaacgttaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaaatggttgaacggttcttgtatggcctgtgaatactgtgaattgggtaacgaatccaactgtcctcacgctgacttgtctggttacacccacgacggttctttccaagaatacgctaccgctgacg ctgttcaagccgctcacattcctcaaggtactgacttggctgaagtcgcgccaatcttgtgtgctggtatcaccgtatacaaggctttgaagtctgccaacttgagagcaggccactgggcggccatttctggtgctgctggtggtctaggttctttggctgttcaatatgctaaggcgatgggttacagagtcttaggtattgatggtggtccaggaaaggaagaattgtttacctcgctcggtggtgaagtattcatcgacttcaccaaagagaaggacattgttagcgcagtcgttaaggctaccaacggcggtgcccacggtatcatcaatgtttccgtttccgaagccgctatcgaagcttctaccagatactgtagggcgaacggtactgttgtcttggttggtttgccagccggtgcaaagtgctcctctgatgtcttcaaccacgttgtcaagtctatctccattgtcggctcttacgtggggaacagagctgataccagagaagccttagatttctttgccagaggtctagtcaagtctccaataaaggtagttggcttatccagtttaccagaaatttacgaaaagatggagaagggccaaattgctggtagatacgttgttgacacttctaaataa (SEQ ID No: 19),
[0104]上述ADH2基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0105]MSIPETQKAIIFYESNGKLEHKDIPVPKPKPNELLINVKYSGVCHTDLHAWH⑶WPLPTKLPLVGGHEGAGVVVGMGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELGNESNCPHADLSGYTHDGSFQEYATADAVQAAHIPQGTDL.AEVAPILCAGITVYKALKSANLRAGHWAAISGAAGGLGSLAVQYAKAMGYRVLGIDGGPGKEELFTSLGGEVFIDFTKEKDIVSAVVKATNGGAHGIINVSVSEAAIEASTRYCRANGTVVLVGLPAGAKCSSDVFNHVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSSLPEIYEKMEKGQIAGRYVVDTSK (SEQ ID No:20)。
[0106]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH3基因，具有如下核苷酸序列:
[0107]atgttgagaacgtcaacattgttcaccaggcgtgtccaaccaagcctattttctagaaacattcttagattgcaatccacagctgcaatccctaagactcaaaaaggtgtcatcttttatgagaataaggggaagctgcattacaaagatatccctgtccccgagcctaagccaaatgaaattttaatcaacgttaaatattctggtgtatgtcacaccgatttacatgcttggcacggcgattggccattacctgttaaactaccattagtaggtggtcatgaaggtgctggtgtagttgtcaaactaggttccaatgtcaagggctggaaagtcggtgatttagcaggtatcaaatggctgaacggttcttgtatgacatgcgaattctgtgaatcaggtcatgaatcaaattgtccagatgctgatttatctggttacactcatgatggttctttccaacaatttgcgaccgctgatgctattcaagccgccaaaattcaacagggtaccgacttggccgaagtagccccaatattatgtgctggtgttactgtatataaagcactaaaagaggcagacttgaaagctggtgactgggttgccatctctggtgctgcaggtggcttgggttccttggccgttcaatatgcaactgcgatgggttacagagttctaggtattgatgcaggtgaggaaaaggaaaaacttttcaagaaattggggggtgaagtattcatcgactttactaaaacaaagaatatggtttctgacattcaagaagctaccaaaggtggccctcatggtgtcattaacgtttccgtttctgaagccgctatttctctatctacggaatatgttagaccatgtggtaccgtcgttttggttggtttgcccgctaacgcctacgttaaatcagaggtattctctcatgtggtgaagtccatcaatatcaagggttcttatgttggtaacagagctgatacgagagaagccttagacttctttagcagaggtttgatcaaatcaccaatcaaaattgttggattatctgaattaccaaaggtttatgacttgatggaaaagggcaagattttgggtagatacgtcgtcgatactagtaaataa (SEQ ID No:21)，
[0108]上述ADH3基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0109]MLRTSTLFTRRVQPSLFSRNILRLQSTAAIPKTQKGVIFYENKGKLHYKDIPVPEPKPNEILINVKYSGVCHTDLHAWHGDWPLPVKLPLVGGHEGAGVVVKLGSNVKGWKV⑶LAGIKWLNGSCMTCEFCESGHESNCPDADLSGYTHDGSFQQFATADAIQAAKIQQGTDLAEVAPILCAGVTVYKALKEADLKAGDWVAISGAAGGLGSLAVQYATAMGYRVLGIDAGEEKEKLFKKLGGEVFIDFTKTKNMVSDIQEATKGGPHGVINVSVSEAAISLSTEYVRPCGTVVLVGLPANAYVKSEVFSHVVKSINIKGSYVGNRADTREALDFFSRGLIKSPIKIVGLSELPKVYDLMEKGKILGRYVVDTSK(SEQ ID No:22)。
[0110]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH4基因，具有如下核苷酸序列:
[0111]atgtcttccgttactgggttttacattccaccaatctctttctttggtgaaggtgctttagaagaaaccgctgattacatcaaaaacaaggattacaaaaaggctttgatcgttactgatcctggtattgcagctattggtctctccggtagagtccaaaagatgttggaagaacgtgacttaaacgttgctatctatgacaaaactcaaccaaacccaaatattgccaatgtcacagctggtttgaaggttttgaaggaacaaaactctgaaattgttgtttccattggtggtggttctgctcacgacaatgctaaggccattgctttattggctactaacggtggggaaatcggagactatgaaggtgtcaatcaatctaagaaggctgctttaccactatttgccatcaacactactgctggtactgcttccgaaatgaccagattcactattatctctaatgaagaaaagaaaatcaagatggctatcattgacaacaacgtcactccagctgttgctgtcaacgatccatctaccatgtttggtttgccacctgctttgactgctgctactggtctagatgctttgactcactgtatcgaagcttatgtttccaccgcctctaacccaatcaccgatgcctgtgctttgaagggtattgatttgatcaatgaaagcttagtcgctgcatacaaagacggtaaagacaagaaggccagaactgacatgtgttacgctgaatacttggcaggtatggctttcaacaatgcttctctaggttatgttcatgcccttgctcatcaacttggtggtttctaccacttgcctcatggtgtttgtaacgctgtcttgttgcctcatgttcaagaggccaacatgcaatgtccaaaggccaagaagagattaggtgaaattgctttgcatttcggtgcttctcaagaagatccagaagaaaccatcaaggctttgcacgttttaaacagaaccatgaacattccaagaaacttgaaagaattaggtgttaaaaccgaagattttgaaattttggctgaacacgccatgcatgatgcctgccatttgactaacccagttcaattcaccaaagaacaagtggttgccattatcaagaaagcctatgaatattaa (SEQ ID No:23)，
[0112]上述ADH4基因编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0113]MSSVTGFYIPPISFFGEGALEETADYIKNKDYKKALIVTDPGIAAIGLSGRVQKMLEERDLNVAIYDKTQPNPNIANVTAGLKVLKEQNSEIVVSIGGGSAHDNAKAIALLATNGGEI⑶YEGVNQSKKAALPLFAINTTAGTASEMTRFTIISNEEKKIKMAIIDNNVTPAVAVNDPSTMFGLPPALTAATGLDALTHCIEAYVSTASNPITDACALKGIDLINESLVAAYKDGKDKKARTDMCYAEYLAGMAFNNASLGYVHALAHQLGGFYHLPHGVCNAVLLPHVQEANMQCPKAKKRLGEIALHFGASQEDPEETIKALHVLNRTMNIPRNLKELGVKTEDFEILAEHAMHDACHLTNPVQFTKEQVVAIIKKAYEY (SEQ ID No:24)。
[0114]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH5基因，具有如下核苷酸序列:
[0115]atgccttcgcaagtcattcctgaaaaacaaaaggctattgtcttttatgagacagatggaaaattggaatataaagacgtcacagttccggaacctaagcctaacgaaattttagtccacgttaaatattctggtgtttgtcatagtgacttgcacgcgtggcacggtgattggccatttcaattgaaatttccattaatcggtggtcacgaaggtgctggtgttgttgttaagttgggatctaacgttaagggctggaaagtcggtgattttgcaggtataaaatggttgaatgggacttgcatgtcctgtgaatattgtgaagtaggtaatgaatctcaatgtccttatttggatggtactggcttcacacatgatggtacttttcaagaatacgcaactgccgatgccgttcaagctgcccatattccaccaaacgtcaatcttgctgaagttgccccaatcttgtgtgcaggtatcactgtttataaggcgttgaaaagagccaatgtgataccaggccaatgggtcactatatccggtgcatgcggtggcttgggttctctggcaatccaatacgcccttgctatgggttacagggtcattggtatcgatggtggtaatgccaagcgaaagttatttgaacaattaggcggagaaatattcatcgatttcacggaagaaaaagacattgttggtgctataataaaggccactaatggcggttctcatggagttattaatgtgtctgtttctgaagcagctatcgaggcttctacgaggtattgtaggcccaatggtactgtcgtcctggttggtatgccagctcatgcttactgcaattccgatgttttcaatcaagttgtaaaatcaatctccatcgttggatcttgtgttggaaatagagctgatacaagggaggctttagatttcttcgccagaggtttgatcaaatctccgatccacttagctggcctatcggatgttcctgaaatttttgcaaagatggagaagggtgaaattgttggtagatatgttgttgagacttctaaatga (SEQ ID No:25)，
[0116]上述ADH5基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0117]MPSQVIPEKQKAIVFYETDGKLEYKDVTVPEPKPNEILVHVKYSGVCHSDLHAWHGDWPFQLKFPLIGGHEGAGVVVKLGSNVKGWKVGDFAGIKWLNGTCMSCEYCEVGNESQCPYLDGTGFTHDGTFQEYATADAVQAAHIPPNVNLAEVAPILCAGITVYKALKRANVIPGQWVTISGACGGLGSLAIQYALAMGYRVIGIDGGNAKRKLFEQLGGEIFIDFTEEKDIVGAIIKATNGGSHGVINVSVSEAAIEASTRYCRPNGTVVLVGMPAHAYCNSDVFNQVVKSISIVGSCVGNRADTREALDFFARGLIKSPIHLAGLSDVPEIFAKMEKGEIVGRYVVETSK (SEQ ID No:26)。
[0118]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH6基因，具有如下核苷酸序列:
[0119]atgtcttatcctgagaaatttgaaggtatcgctattcaatcacacgaagattggaaaaacccaaagaagacaaagtatgacccaaaaccattttacgatcatgacattgacattaagatcgaagcatgtggtgtctgcggtagtgatattcattgtgcagctggtcattggggcaatatgaagatgccgctagtcgttggtcatgaaatcgttggtaaagttgtcaagctagggcccaagtcaaacagtgggttgaaagtcggtcaacgtgttggtgtaggtgctcaagtcttttcatgcttggaatgtgaccgttgtaagaatgataatgaaccatactgcaccaagtttgttaccacatacagtcagccttatgaagacggctatgtgtcgcagggtggctatgcaaactacgtcagagttcatgaacattttgtggtgcctatcccagagaatattccatcacatttggctgctccactattatgtggtggtttgactgtgtactctccattggttcgtaacggttgcggtccaggtaaaaaagttggtatagttggtcttggtggtatcggcagtatgggtacattgatttccaaagccatgggggcagagacgtatgttatttctcgttcttcgagaaaaagagaagatgcaatgaagatgggcgccgatcactacattgctacattagaagaaggtgattggggtgaaaagtactttgacaccttcgacctgattgtagtctgtgcttcctcccttaccgacattgacttcaacattatgccaaaggctatgaaggttggtggtagaattgtctcaatctctataccagaacaacacgaaatgttatcgctaaagccatatggcttaaaggctgtctccatttcttacagtgctttaggttccatcaaagaattgaaccaactcttgaaattagtctctgaaaaagatatcaaaatttgggtggaaacattacctgttggtgaagccggcgtccatgaagccttcgaaaggatggaaaagggtgacgttagatatagatttaccttagtcggctacgacaaagaattttcagactag (SEQ ID No:27)，
[0120]上述ADH6基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0121]MSYPEKFEGIAIQSHEDWKNPKKTKYDPKPFYDHDIDIKIEACGVCGSDIHCAAGHWGNMKMPLVVGHEIVGKVVKLGPKSNSGLKVGQRVGVGAQVFSCLECDRCKNDNEPYCTKFVTTYSQPYEDGYVSQGGYANYVRVHEHFVVPIPENIPSHLAAPLLCGGLTVYSPLVRNGCGPGKKVGIVGLGGIGSMGTLISKAMGAETYVISRSSRKREDAMKMGADHYIATLEEGDWGEKYFDTFDLIVVCASSLTDIDFNIMPKAMKVGGRIVSISIPEQHEMLSLKPYGLKAVSISYSALGSIKELNQLLKLVSEKDIKIWVETLPVGEAGVHEAFERMEKGDVRYRFTLVGYDKEFSD (SEQ ID No:28)。
[0122]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自酿酒酵母醛还原酶ADH7基因，具有如下核苷酸序列:
[0123]atgctttacccagaaaaatttcagggcatcggtatttccaacgcaaaggattggaagcatcctaaattagtgagttttgacccaaaaccctttggcgatcatgacgttgatgttgaaattgaagcctgtggtatctgcggatctgattttcatatagccgttggtaattggggtccagtcccagaaaatcaaatccttggacatgaaataattggccgcgtggtgaaggttggatccaagtgccacactggggtaaaaatcggtgaccgtgttggtgttggtgcccaagccttggcgtgttttgagtgtgaacgttgcaaaa gtgacaacgagcaatactgtaccaatgaccacgttttgactatgtggactccttacaaggacggctacatttcacaaggaggctttgcctcccacgtgaggcttcatgaacactttgctattcaaataccagaaaatattccaagtccgctagccgctccattattgtgtggtggtattacagttttctctccactactaagaaatggctgtggtccaggtaagagggtaggtattgttggcatcggtggtattgggcatatggggattctgttggctaaagctatgggagccgaggtttatgcgttttcgcgaggccactccaagcgggaggattctatgaaactcggtgctgatcactatattgctatgttggaggataaaggctggacagaacaatactctaacgctttggaccttcttgtcgtttgctcatcatctttgtcgaaagttaattttgacagtatcgttaagattatgaagattggaggctccatcgtttcaattgctgctcctgaagttaatgaaaagcttgttttaaaaccgttgggcctaatgggagtatcaatctcaagcagtgctatcggatctaggaaggaaatcgaacaactattgaaattagtttccgaaaagaatgtcaaaatatgggtggaaaaacttccgatcagcgaagaaggcgtcagccatgcctttacaaggatggaaagcggagacgtcaaatacagatttactttggtcgattatgataagaaattccataaatag (SEQ ID No:29)，
[0124]上述ADH7基因编码的蛋白具有下列所不的氣基酸序列:
[0125]MLYPEKFQGIGISNAKDWKHPKLVSFDPKPFGDHDVDVEIEACGICGSDFHIAVGNWGPVPENQILGHEIIGRVVKVGSKCHTGVKI⑶RVGVGAQALACFECERCKSDNEQYCTNDHVLTMWTPYKDGYISQGGFASHVRLHEHFAIQIPENIPSPLAAPLLCGGITVFSPLLRNGCGPGKRVGIVGIGGIGHMGILLAKAMGAEVYAFSRGHSKREDSMKLGADHYIAMLEDKGWTEQYSNALDLLVVCSSSLSKVNFDSIVKIMKIGGSIVSIAAPEVNEKLVLKPLGLMGVSISSSAIGSRKEIEQLLKLVSEKNVKIWVEKLPISEEGVSHAFTRMES⑶VKYRFTLVDYDKKFHK (SEQ ID No:30)。
[0126]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自Saccharomyces kluyveri醒还原酶ADHl基因，具有如下核苷酸序列:
[0127]atgtctgctccacaaatcccagaaactcaaaaggccgttatcttctacgaaaatggtggtgaattgcaatacaaagacatcccagtcccaaagcctaagtccaatgaaatcttgatcaacatcaagtactccggtgtctgccacaccgacttgcacgcctggaagggtgactggccattgccaaccaagttgcctttagtcggtggtcacgagggtgctggtatcgttgtcggcatgggtgaaaacgtcaagggctggaagatcggtgactacgccggtatcaagtggttgaacggttcttgtatgtcctgtgaatactgtgaattgtccaacgaatccaactgtccagacgccgacttgtccggttacactcacgacggttctttccaacaatacgccactgctgacgccgtccaagccgccagaatcgctccaggtaccgacttggccgaagttgccccagtcttgtgtgccggtatcactgtgtacaaggccttgaagtctgccaacttgagagccggtgaatgggttgccatctccggtgcttgtggtggtctaggttctttggccatccaatacgccaaggccatgggttaccgtgttctaggtatcgacggtggtgacgaaaaggccgctttgttcaaggaattgggcggtgaagtgtttatcgatttcaccaagaccaaggacgtcgtcaaggctgtcgtcgacgccactaacggtggtgcccacggtgtcatcaacgtttctgtctctgaagccgctatcgaggcctctaccgtgtactgtagagccaacggtaccgttgtcctggtcggtttgccaggcggtgccaagtgtaagtctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccatctccattgtcggttcttacgtcggtaacagagctgacaccagagaagccttggactttttctccagaggtttggtcaagtctccaatcatgattgtcggtttgtccgaattgccaagcatttacgaaaagatggaaaagggtgccattgtcggtagatacgttgtcgacacctccaaataagctcctttcacgccttgatagaagtgatgagcacgctt (SEQ ID No:31)，
[0128]其编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0129]MSAPQIPETQKAVIFYENGGELQYKDIPVPKPKSNEILINIKYSGVCHTDLHAWKGDWPLPTKLPLVGGHEGAGIVVGMGENVKGWKIGDYAGIKWLNGSCMSCEYCELSNESNCPDADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAARIAPGTDLAEVAPVLCAGITVYKALKSANLRAGEWVAISGACGGLGSLAIQYAKAMGYRVLGIDGGDEKAALFKELGGEVFIDFTKTKDVVKAVVDATNGGAHGVINVSVSEAAIEASTVYCRANGTVVLVGLPGGAKCKSDVFNQVVKSISIVGSYVGNRADTREALDFFSRGLVKSPIMIVGLSELPSIYEKMEKGAIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:32)。
[0130]根据本发明的一个实施例，上述异源核酸还可以编码下列基因表达的产物，该基因可以为来自Saccharomyces kluyveri醒还原酶ADH2基因，具有如下核苷酸序列:
[0131]atgtctgcttcccaaatcccagaaactcaaaaggccgttattttctacgaaaacggcggtgaattgcaatacaaggatatcccagtcccaaagccaaagtccaatgaaatcttgatcaatgtcaagtactccggtgtctgccacaccgacttgcacgcctggaagggtgactggccattgccaaccaagttgcccctggtcggtggccacgagggtgccggtgtcgttgtcgccattggtgaaaacgtcaagggctggaagatcggcgactacgccggtatcaagtggttgaacggttcctgtatggcttgtgaatactgtgagttgtccaacgaatccaactgtccagaagccgacttgtccggttacacccacgacggttctttccaacagtacgctaccgccgacgctgtgcaggcggccagaatccctgctggcaccgacttggccgaagttgccccagtcttgtgtgccggtatcaccgtgtacaaggccttgaagtctgccaacttgagagccggtgaatgggttgccatctccggtgcttgtggtggtctaggttctttggccatccaatacgccaaggccatgggttaccgtgttctaggtatcgacggtggtgacgaaaaggccgctttgttcaatgagttgggcggtgaagtgtttatcgatttcaccaagaccaaggacgttaccaaggccgtcatcgatgccaccaacggtggtgcccacggtgtcatcaacgtttccgtctccgaagccgctatcgaggcctctaccgtgtactgtagagccaacggtaccgttgtcctggtcggtttgccaggtggtgccaagtgtaagtctgatgtcttcaaccaagtcgtcaagtccacgaccattgtcggttcctacgtcggtaacagagctgacaccagagaagccttggactttttcgccagagggttggtcaagtctccaatcaaggttgtcggtttgtccgaattgccaagcatttacgaaaagatgcaaaagggtgccattgtcggtagatacgttgtcgacacttccaaatga (SEQ ID No:33)，
[0132] 其编码的蛋白具有下列所示的氨基酸序列:
[0133]MSASQIPETQKAVIFYENGGELQYKDIPVPKPKSNEILINVKYSGVCHTDLHAWKGDWPLPTKLPLVGGHEGAGVWAIGENVKGWKI⑶YAGIKWLNGSCMACEYCELSNESNCPEADLSGYTHDGSFQQYATADAVQAARIPAGTDLAEVAPVLCAGITVYKALKSANLRAGEWVAISGACGGLGSLAIQYAKAMGYRVLGIDGGDEKAALFNELGGEVFIDFTKTKDVTKAVIDATNGGAHGVINVSVSEAAIEASTVYCRANGTVVLVGLPGGAKCKSDVFNQVVKSTTIVGSYVGNRADTREALDFFARGLVKSPIKVVGLSELPSIYEKMQKGAIVGRYVVDTSK (SEQ ID No:34)。
[0134]根据本发明的一个实施例，上述重组的微生物其类型并不受特别限制，根据本发明的具体实施例，该微生物可以为真核微生物，也可以为原核微生物。例如，根据本发明的具体示例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体或者病毒和酵母，可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的具体实施例，上述微生物优选采用大肠杆菌或酵母，还可以优选为毕赤酵母或者酿酒酵母。由此可以进一步提高利用该微生物制备得到的重组微生物的性能，以便进一步提高利用该重组微生物制备脂肪醇的效率。
[0135]适于转化微生物的系统、制备重组微生物的方法
[0136]根据本发明的一个实施例，可以通过常规的分子生物学方法获得上述微生物。由此，在本发明的第二方面，本发明还提出了一种适于转化微生物的系统。利用该系统可以通过常规的方法，将异源核酸分子引入微生物细胞中，从而得到重组微生物，该重组微生物适于制备脂肪醇类化合物。根据本发明的具体实施例，该系统具体可以包括:适于转化微生物的载体，该载体上携带有异源核酸分子，该异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。由此，可以通过常规的分子生物学手段，将该携带有异源核酸分子的载体引入到微生物中，从而可以在微生物细胞中表达该异源核酸，从而编码具有醛还原酶活性的蛋白质。进一步可以通过在微生物细胞内表达醛还原酶基因或其功能等同体，从而发挥醛还原酶的生物活性，进而催化脂肪醛还原为脂肪醇。
[0137]根据本发明的一个实施例，异源核酸编码下列基因至少一种的表达产物:Escherichia coli adhP、Escherichia coli adhE、Escherichia coli yqhD、Escherichiacoli yjgB、Escherichia coli yiaY、Escherichia coli eutG、Escherichia coli fucO、Escherichia coli yd1、 Saccharomyces cerevisiae ADHl> Saccharomyces cerevisiaeADH2、Saccharomyces cerevisiae ADH3、Saccharomyces cerevisiae ADH4>Saccharomycescerevisiae ADH5、 Saccharomyces cerevisiae ADH6、 Saccharomyces cerevisiae ADH7、Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。由此可以在相应基因表达产物的作用下，将脂肪醛还原成脂肪醇。
[0138]根据本发明的一个实施例，具有醛还原酶活性的蛋白质具有如SEQ ID No:2、4、6、
8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列。由此可以进一步提高异源核酸分子编码表达产物的效率，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪醇的效率。
[0139]根据本发明的一个实施例，异源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高重组微生物包含的异源核酸分子编码的蛋白质的酶活性，从而进一步提高利用该微生物制备脂肪醇的效率。
[0140]根据本发明的实施例，上述适于转化微生物的系统，可以转化的微生物的类型并不受特别限制。可以为真核微生物，也可以为原核微生物。其类型并不受特别限制。例如，根据本发明的实施例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母。可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，上述微生物优选采用酵母和大肠杆菌，根据本发明的具体示例，上述微生物优选酿酒酵母、毕赤酵母和大肠杆菌作为生产生物燃料的微生物。
[0141]根据本发明的具体实施例，该适于转化微生物的系统可以进一步包括表达调控序列(启动子，增强子，等等)，以指导所编码基因产物的合成，优选启动子，更优选IPTG-诱导型启动子。所述核酸序列的至少之一被设置在所述IPTG-诱导型启动子的控制之下。由此，可以通过在IPTG-诱导型启动子的控制下，由此容易通过启动子的调控，表达目的蛋白，从而实现脂肪醇的合成。根据本发明的实施例，可以用于本发明的启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根据使用的宿主/载体系统，表达载体可以使用大量合适的转录和翻译控制元件中的任意一种，包括组成型和诱导型启动子，转录增强子元件，转录终止子，等等(参见例如，Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:156-544,1987,通过参照并入本文)。
[0142]根据本发明的具体实施例，用于原核宿主细胞的合适启动子包括，但不限于能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和IacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α -淀粉酶和Σ特异性启动子，杆菌噬菌体启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322i3-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。关于原核启动子的综述可参见Glick，J.1nd.Microb1l.1:277,1987 ；ffatson et al., Benjamin Cummins(1987);和 Sambrook et al.,上文，通过参照并入本文。
[0143]根据本发明的实施例，该适于转化微生物的系统可以进一步包括表达调控序列(启动子，增强子，等等)，以指导所编码基因产物的合成，优选启动子，更优选AOX-诱导型启动子。所述核酸序列的至少之一被设置在所述甲醇诱导型启动子的控制之下。由此，可以通过在AOX-诱导型启动子的控制下，由此容易通过启动子的调控，表达目的蛋白，从而实现脂肪醇的合成。根据本发明的实施例，可以用于本发明的启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。
[0144]根据本发明的实施例，用于真核宿主内使用的合适真核启动子的非限制性实例来源于病毒，包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子；疱疹病毒的TK启动子；SV40早期启动子；Rous肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子；酵母gal4基因启动子；IgG启动子和AOX启动子。
[0145]根据本发明的实施例，合适的诱导型启动子包括不限于:受体蛋白、代谢物或者化学制品影响的启动子。具体地，包括:牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pol III启动子、四环素诱导型CMV启动子以及来自trp和Iac操纵子的启动子。
[0146]根据本发明的一些实施例，前述的核酸序列可以被连接到组成型启动子上。因而利用该系统转化微生物所得到的重组微生物能够持续地表达醛还原酶基因，从而代谢合成脂肪醇。
[0147]借助上述适于转化微生物的系统转化微生物的方法，并不受特别限制，可以为诸如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导等等，可以将异源核酸序列稳定地或者瞬时引入宿主细胞，所述异源核酸序列参与产生脂肪醇、生物燃料或其中间物。根据本发明的实施例，对于稳定转化，异源核酸序列还包括选择性标志物，诸如，抗生素抗性，例如新霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素的抗性，弥补营养缺陷型的基因等等。
[0148]由此，在本发明的第三个方面，本发明还提供了一种获得重组微生物的方法，该方法包括使用前面适于转化微生物的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。由此，根据本发明实施例，所得到的重组微生物中具有了异源核酸分子，该异源核酸分子可以编码具有具有醛还原酶活性的蛋白质。关于这些异源核酸序列，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。
[0149]根据本发明的具体实施例，将上述异源核酸序列引入宿主细胞的酶的顺序和数量并不受特别限制。既可以是同时引入到微生物细胞中，也可以是依次引入到微生物细胞中。根据本发明的实施例，可以将各个异源核酸序列设置在同一个载体上，也可以设置在不同的载体上，例如各个核酸序列包含在不同的载体上。这些载体可以是本领域中任何已知的表达载体。合适的表达载体包括，但不限于，病毒载体，诸如杆状病毒载体，曬菌体载体，诸如噬菌体载体，质粒，噬菌体，粘粒，cosmids,细菌人工染色体，病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体:牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒，等等)，基于Pl的人工染色体，酵母质粒，酵母人工染色体，和任意对目的特定宿主具有特异性的其他载体(诸如大肠杆菌、Pseudomonas pi sum和酿酒酵母)。根据本发明的实施例，表达载体上可以进一步包括一种或者多种选择标记基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。所述选择标记基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或者生长必需的蛋白。没有转化包含选择标记基因的载体的宿主细胞将不会在培养基中存活。通常的选择标记基因编码以下蛋白: (a)提供对抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素，新霉素，甲氨喋呤或者四环素，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要营养物，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可选的实施方式中，选择标记基因是提供氨苄青霉素或者卡那霉素抗性(用于原核宿主细胞，诸如大肠杆菌)的基因。
[0150]生产脂肪醇的方法和系统
[0151]在本发明的第四个方面，本发明还提出了一种生产脂肪醇的方法。该方法包括下列步骤:培养前面所述的重组微生物，以便利用该重组微生物将脂肪醛还原成脂肪醇，以及分离该脂肪醇。根据本发明的具体实施例，利用包含脂肪醛的培养基培养该重组微生物，由此该重组微生物可以利用自身体内产生的脂肪醛合成脂肪醇，也可以利用培养基中的脂肪醛合成脂肪醇，又可以扩大原料脂肪醛的含量，以便进一步提高制备脂肪醇的效率。由此，该方法可以借助本发明实施例的重组微生物合成脂肪醇。本领域技术人员可以通过对微生物以及所采用的核酸的载体进行分析，能够获得最适合的培养条件。
[0152]根据本发明的一个实施例，所采用的微生物的类型不受特别限制，根据本发明的具体实施例，上述微生物可以为真核微生物，也可以为原核微生物。例如，根据本发明的具体实施例，可以采用的微生物包括但不限于细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体或者病毒和酵母，可以为上述微生物的至少一种。根据本发明的实施例，优选采用毕赤酵母、酿酒酵母及大肠杆菌，以便用于生产脂肪醇。这是因为对于这些微生物而言，易于遗传修饰，易于控制生长、产生以及减少或者消除降低生物合成途径效率的副反应。此外，这种重组微生物可以直接利用可再生能源以脂肪醛作为合成脂肪醇的底物，不需要专门的储存或运输方法。
[0153]在本发明的第五个方面，本发明还提供了一种用于生产脂肪醇的系统。根据本发明的实施例，该系统包括:生物反应器和分离装置，生物反应器中设置有前面所述的重组微生物和适于该重组微生物生长的培养基，以便使重组微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；分离装置与生物反应器相连，用于分离脂肪醇。由此利用该生产脂肪醇的系统，可以有效地实施前面所述的生产脂肪醇的方法，从而可以有效地用于制备脂肪醇。
[0154]根据本发明的具体实施例，培养基中包含脂肪醛，由此生物反应器中的重组微生物可以利用自身体内产生的脂肪醛生产脂肪醇，也可以了利用培养基中含有的脂肪醛生产脂肪醇，由此利用含有脂肪醛的培养基培养重组微生物，可以进一步提高底物脂肪醛的含量，以便进一步提高脂肪醇的生产效率。
[0155]本发明的优点是在微生物中引入异源基因构建一条合成肪醇的代谢途径，不需要通过过多的化学合成反应，减少了环境的污染，也减少了对石油储量的消耗。同时，由于微生物生长速度快，便于进行遗传操作，其抗污染性能优异，且人工可以调节其生长速度和防止其肆意生长破坏环境，种种因素表明改造微生物进行工业生产脂肪醇是切实可行的。
[0156]下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
[0157]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0158]下面对本发明实施例中所采用制备脂肪醇的一般方法进行描述，其中，图1-8中提供了实施例中所涉及的主要载体的示意图。
[0159]实施例1构建重组微生物转化系统的方法
[0160]1、可转化大肠杆菌的系统构建
[0161]用Qiagen 公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit 纯化获得大肠杆菌BL21基因组DNA。利用表1中的引物序列，通过PCR的方法扩增出大肠杆菌的adhP，adhE和yqhD基因并克隆在载体PET28上，分别构建为质粒ρΕΧΙΟΟ，ρΕΧΙΟΙ和pEX102 (图1_3)。将所用的Acyl ACP reductase酶按照序列进行全合成并通过NcoI和BamHI克隆在pET28上,构建可以合成脂肪醛的表达载体PRLl 10 (图4)。
[0162]Acyl ACP reductase 酶的序列如下:
[0163] ATGGGCTTCGGATTGATCGGTCACTTGACCTCCCTTGAGCAGGCCCGTGACGTCTCCCGTCGTATGGGTTATGATGAGTACGCCGACCAGGGTTTGGAGTTCTGGTCCTCTGCTCCACCACAGATTGTCGACGAGATCACCGTCACTTCTGCCACCGGAAAGGTCATCCACGGACGTTACATCGAGTCCTGCTTCTTGCCAGAGATGTTGGCTGCCAGACGTTTCAAGACCGCCACCCGTAAGGTCTTGAACGCCATGTCTCACGCCCAGAAACACGGAATTGACATCTCCGCCTTGGGAGGATTCACCTCTATCATCTTCGAGAATTTCGACTTGGCTTCCTTGCGTCAGGTCCGTGACACCACCCTTGAGTTCGAGAGATTCACTACCGGAAACACCCATACCGCCTACGTCATTTGCCGTCAGGTCGAGGCTGCTGCTAAGACCTTGGGAATCGACATCACCCAGGCCACTGTCGCTGTCGTTGGAGCTACCGGAGACATCGGTTCTGCTGTCTGCCGTTGGTTGGAT

【权利要求】
1.一种重组微生物，其特征在于，所述微生物包含异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重 组微生物，所述异源核酸编码下列基因至少一种的表达产物:
Escherichia coli adhP、
Escherichia coli adhE、
Escherichia coli yqhD、
Escherichia coli yjgB、
Escherichia coli yiaY、
Escherichia coli eutG、
Escherichia coli fucO、
Escherichia coli yd1、
Saccharomyces cerevisiae ADHl、
Saccharomyces cerevisiae ADH2、
Saccharomyces cerevisiae ADH3、
Saccharomyces cerevisiae ADH4、
Saccharomyces cerevisiae ADH5、
Saccharomyces cerevisiae ADH6、
Saccharomyces cerevisiae ADH7、 Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述具有醛还原酶活性的蛋白质具有如 SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 34 所示的氨基酸序列;所述异源核酸分子具有SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种， 任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种， 任选地，所述微生物为酵母或者大肠杆菌， 任选地，所述微生物为毕赤酵母或酿酒酵母。
5.一种用于重组微生物的系统，其特征在于，包括: 适于转化微生物的载体，所述载体上携带有异源核酸分子，所述异源核酸分子编码具有醛还原酶活性的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的系统，所述异源核酸编码下列基因至少一种的表达产物: Escherichia coli adhP、
Escherichia coli adhE、
Escherichia coli yqhD、
Escherichia coli yjgB、Escherichia coli yiaY、
Escherichia coli eutG、
Escherichia coli fucO、
Escherichia coli yd1、
Saccharomyces cerevisiae ADHl、
Saccharomyces cerevisiae ADH2、
Saccharomyces cerevisiae ADH3、
Saccharomyces cerevisiae ADH4、
Saccharomyces cerevisiae ADH5、
Saccharomyces cerevisiae ADH6、
Saccharomyces cerevisiae ADH7、 Saccharomyces kluyveri ADHl、以及 Saccharomyces kluyveri ADH2， 所述具有醛还原酶活性的蛋白质具有如SEQ ID No:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列， 所述异源核酸分子具有 SEQ ID No:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31或33所示的核苷酸序列， 所述微生物为选自真核微生物和原核微生物的至少一种， 任选地，所述微生物为选自细菌、真菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体、立克次体、病毒和酵母的至少一种， 任选地，所述微生物为酵母或者大肠杆菌， 任选地，所述微生物为毕赤酵母或酿酒酵母。
7.一种制备重组微生物的方法，其特征在于，利用权利要求5或6所述的系统转化微生物，以便获得所述重组微生物。
8.—种生产脂肪醇的方法，其特征在于，包括下列步骤: 利用含有脂肪醛的培养基作为底物，将微生物与所述底物接触，以便制备得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛来自外源加入或者由所述微生物产生，所述脂肪醛的碳原子数至少为8个； 任选地，所述醛还原酶为纯化后的蛋白、所述微生物体内自身表达产生的蛋白的至少一种； 任选地，所述微生物为权利要求1-4任一项所述的重组微生物； 任选地，利用包含脂肪醛的培养基培养所述微生物。
9.一种用于生产脂肪醇的系统，其特征在于，包括: 生物反应器，所述生物反应器中设置有权利要求1-4任一项所述的重组微生物和适于所述微生物生长的培养基，以便使所述微生物利用脂肪醛合成脂肪醇；以及分离装置，所述分离装置与所述生物反应器相连，用于分离所述脂肪醇， 任选地，所述培养基中包含脂肪醛。
10.一种生产脂肪醇的方法，其特征在于，包括利用醛还原酶对脂肪醛进行还原处理，以便得到脂肪醇，其中，所述脂肪醛的碳原子数为至少8。
【文档编号】C12M1/00GK104164397SQ201310184420
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2013年5月17日
【发明者】刘然 申请人:武汉臻智生物科技有限公司