生产异丁醇的重组微生物及方法

生产异丁醇的重组微生物及方法
【专利摘要】本发明提供了用于生产异丁醇的重组大肠杆菌以及其在生产异丁醇中的应用，其中所述重组大肠杆菌中吡啶核苷酸转氢酶和NAD激酶同时被激活。
【专利说明】生产异丁醇的重组微生物及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生产异丁醇的重组微生物，具体是重组大肠杆菌，以及使用所述重组大肠杆菌生产异丁醇的方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前全球的运输燃料主要是从石油中提炼的汽油和柴油。然而石油是一种不可再生的资源，现有的全球石油储备预计还可以再维持三十至五十年。随着全球石油储备的逐渐减少，石油价格在最近几年飞速增长，直接导致全球能源紧张。另外，石油大量使用造成了温室气体的大量排放，使全球气候变暖，造成非常严重的环境危机。
[0003]生物质是一种可再生的清洁资源。通过生物制造法，生物质可以被转化为可再生的代替能源(Werpy et al., 2004 ；Perlack et al., 2005)。近几十年来,生物能源的研究开发主要集中在乙醇，丁醇，沼气，氢气，生物柴油(Ingram et al., 1999 ；Lee et al., 2008 ；Vasudevan and Briggs, 2008)等。其中，乙醇被认为是目前最有可能代替汽油运输燃料的可再生能源。巴西自上世纪七十年代起就大力发展乙醇生物制造技术，由于其国内丰富的甘蔗产量，目前其国内汽车运输燃料已经以乙醇为主(Macedo et al.，2008)。
[0004]异丁醇与乙醇相比，更适合作为汽油的替代品，原因是:能量密度接近于汽油；蒸气压低，容易与汽油混合；与乙醇相比，可以和汽油高浓度混合，而不需要特殊的适应装置；可以使用现有石油管道进行运输等(Connor and Liao, 2009) 0另外，异丁醇在化工市场上也有很多用途，目前主要用于生产润滑油添加剂、表面涂料、粘合剂等复合溶剂，同时还可以用于生产邻苯二甲酸酯类增塑剂(Connor and Liao, 2009) 0目前异丁醇每年的市场需求有50万吨左右。
[0005]某些天然微生物能够生产异丁醇，但其产量很低(Chen et al., 2011) ? Dupont公司最早开展了构建重组大肠杆菌生产`异丁醇的研究(PCT/US2006/041602)。随后，美国加州大学洛杉矶分校James Liao课题组以及美国Gevo公司也进行了相关的研究(Atsumi et al.2008 ；Atsumi et al.,2009 ；Baez et al.,2011 ；PCT/US2008/053514 ；PCT/US2008/082159)。通过在大肠杆菌中引入外源的酮酸脱羧酶和醇脱氢酶，能够将氨基酸代谢的中间物2-酮基异戊酸转化为异丁醇(图1)。Liao课题组通过在大肠杆菌中过表达乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的酮酸脱羧酶基因(KivD)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醇脱氢酶基因(adh)来生产异丁醇；过表达芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的乙酰乳酸合成酶基因(alsS)、大肠杆菌自身的乙酰轻酸还原异构酶基因(ilvC)和二羟酸脱水酶基因(ilvD)能提高异丁醇的产量；敲除醇脱氢酶基因(adhE)、乳酸脱氢酶基因(IdhA)、富马酸还原酶基因(frd)、转录调控因子(fnr)、磷酸乙酰转移酶基因(Pta)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)能进一步提高异丁醇的产量。最终构建的重组大肠杆菌使用丰富培养基在24小时内能生产7.7g/L的异丁醇(Smithet al.,2011)。当前，本领域还需要能够以高产量生产异丁醇的重组微生物。
【发明内容】

[0006]本发明人发现同时增强大肠杆菌中的吡啶核苷酸转氢酶和NAD激酶，能够提高大肠杆菌生产异丁醇的产量和转化率。
[0007]在一个方面，本发明提供了一种用于生产异丁醇的重组大肠杆菌，其包含2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶，其特征在于所述大肠杆菌中吡啶核苷酸转氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性同时被增强，并且任选地，选自所述2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶中的1、2、3、4或5种酶的活性被增强。
[0008]不希望受任何理论约束，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)是异丁醇合成途径中的关键辅因子，NADPH的来源有三种:磷酸戊糖途径，三羧酸循环和吡啶核苷酸转氢酶。好氧条件下大肠杆菌生物合成所需要的35-45%的NADPH来源于磷酸戊糖途径，20-25%的NADPH来源于参与到三羧酸循环(TCA循环)的异柠檬酸脱氢酶，另外的35%-45%的NADPH来源于吡啶核苷酸转氢酶(Sauer et al.，2004)。磷酸戊糖途径和三羧酸循环在厌氧条件下通常是没有活性的(Bastian et al.，2011)，因此能提供NADPH的只有吡啶核苷酸转氢酶。厌氧条件下细胞产生的还原力类型大部分是NADH。为了高效生产异丁醇，必须要解决辅因子不平衡(cofactor imbalance)的问题。吡唳核苷酸转氢酶有两种类型:一种是膜结合蛋白PntAB，它在将质子转入胞内的过程中可以将NADP+还原为NADPH，也同时将NADH氧化为NAD+ ;另一种是可溶性蛋白UdhA，它的功能主要是将过多的NADPH转化为NADH。为了使吡啶核苷酸转氢酶能持续地工作，NAD+需要被再次转化为NADP+。NAD激酶是细胞内唯一的生产NADP库的酶，在维持胞内的还原力平衡中起到重要作用(Shi etal.,2009 ；Kawai et al.,2001)?
[0009]在本文中，酶的活性“增强”是指提高微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性，增强活性可以通过 本领域已知的任何合适方法实现，例如过表达，包括但不限于提高所述基因或等位基因的拷贝数，修饰指导或控制基因表达的核苷酸序列，使用强启动子或使用编码具有高活性相应酶的基因或等位基因，及任选地组合这些措施。通过增强措施，相应蛋白质的活性或浓度一般比起始微生物水平提高至少10%，20，30%，40%, 50%,60 %，70 %，80 %，90 %，100 %，150 %，200 %，300 %，400 % 或 500 %，或者直至 1000 %，2000 %，3000 %，4000 %、10000 % 或者 20000 %。
[0010]过表达通常是指与起始菌株(亲代菌株)或者野生型菌株(如果其是起始菌株)相比核糖核酸、蛋白质(多肽)或酶的胞内浓度或活性增加。起始菌株(亲代菌株)是指对其进行导致过表达处理的菌株。
[0011]拷贝数可以通过在微生物的胞质中复制的质粒而增加。迄今为止，现有技术对于不同的微生物描述了大量质粒，所述质粒可用于设定基因拷贝数的希望的增加量。适于埃希氏菌属的质粒在例如 Molecular Biology, Labfax (Ed.:T.A.Brown, Bios Scientific,Oxford,UK, 1991)中描述。拷贝数也可通过将所需基因的额外一或多个拷贝整合入微生物的染色体中而增加。
[0012]基因表达可进一步通过使用强启动子增加，所述启动子与被表达的基因功能性连接。优选使用比天然启动子更强的启动子，所述天然启动子是存在于野生型或者亲代菌株中的启动子。迄今为止，本领域具有许多可利用的方法。长期以来已知适于埃希氏菌属的启动子。其包括传统启动子Iac启动子、trp启动子、杂种启动子tac和trc、噬菌体λ的匕和Pk启动子。也可以将多个启动子放置在希望的基因的上游或者与被表达的基因功能性连接，以此实现表达增加。
[0013]过表达也可以通过增加激活物蛋白的表达或者降低或关闭阻抑物蛋白的表达而实现。
[0014]所提及的过表达措施可以适当方式相互组合。因此，可以例如组合使用合适的启动子及增加拷贝数。关于DNA的操纵、DNA的消化和连接、转化体的转化和选择的指导可见于已知 Sambrook 等编著的手册“Molecular Cloning:A Laboratory Manual，，，SecondEdition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。表达或者过表达的程度可以通过测量从基因中转录的mRNA的量、通过确定多肽的量以及通过确定酶活性而确定。
[0015]在一个实施方案中，本发明重组大肠杆菌中编码所述2-酮酸脱羧酶和乙酰乳酸合成酶的基因对于所述重组大肠杆菌是外源的。所述外源2-酮酸脱羧酶基因和乙酰乳酸合成酶基因可以是来自任何微生物例如乳球菌、芽孢杆菌等的相应基因。在一个实施方案中，所述2-酮酸脱羧酶选自乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶、鼠伤寒沙门氏菌2-酮酸脱羧酶和乙酰丁酸梭菌2-酮酸脱羧酶，优选乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶。在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶选自枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶、肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶和乳酸乳球菌乙酰乳酸合成酶，优选枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶。在进一步的实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述2-酮酸脱羧酶和乙酰乳酸合成酶之一或二者的活性被增强。
[0016]在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中可以存在外源醇脱氢酶编码基因，例如乳酸乳球菌的醇脱氢酶编码基因(例如adhA)。
[0017]所述外源2-酮酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和/或乙酰乳酸合成酶基因可以本领域已知的任何合适方式例如以质粒形式、或者整合入基因组中的形式存在于所述大肠杆菌中。在一个实施方案中，所述外源基因整合入所述重组大肠杆菌的基因组中。在一个实例中，所述外源2-酮酸脱羧酶基因`(例如kivD)被整合到所述大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点。在一个实例中，所述外源醇脱氢酶基因被整合到所述大肠杆菌染色体的富马酸还原酶编码基因frd位点。在一个实例中，所述外源乙酰乳酸合成酶基因(例如alsS)被整合到所述大肠杆菌染色体的丙酸激酶编码基因tdcD位点和乳酸脱氢酶编码基因IdhA位点。
[0018]本发明所述“整合”可以通过本领域已知的任何方法实现。例如，在一个实施方案中，将酶编码基因通过同源重组方法(Court et al.,2002 ；Thomason et al.，2003)整合入大肠杆菌的基因组中。在一个实施方案中，所述整合入基因组中的酶编码基因置于合适的启动子例如上述强启动子的控制下。
[0019]在进一步的实施方案中，所述外源基因可以置于合适的启动子控制之下，例如任何适用于在大肠杆菌中表达的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是具有SEQ ID NO:
1、2、3、4、5或75所示序列的启动子。例如，将所述2-酮酸脱羧酶编码基因置于SEQID NO:1所示的启动子控制之下，将醇脱氢酶编码基因置于SEQ ID NO:75所示的启动子控制之下和/或将乙酰乳酸合成酶编码基因置于SEQ ID NO:1或5所示的启动子控制之下。
[0020]在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶的活性也被增强。[0021]在一个实施方案中，本发明所述酶的活性增强是通过过表达酶编码基因实现的。在一个实施方案中，所述过表达可以通过增加基因拷贝数、使用强启动子等实现，例如将所述酶的编码基因序列置于强启动子的控制之下和/或增加所述酶编码基因的一或多个拷贝。在进一步的实施方案中，所述酶编码基因的一或多个拷贝和任选存在的启动子核苷酸序列整合入所述重组大肠杆菌的基因组中，或者将包含所述酶编码基因的质粒导入所述重组大肠杆菌中。
[0022]在一个实施方案中，本发明所述强启动子选自SEQ ID NO:1-5任一所示的启动子。例如，在本发明的重组大肠杆菌中:(a)乙酰羟酸还原异构酶基因(例如ilvC)编码序列置于SEQ ID NO:3所示启动子的控制之下；和/或(b) 二羟酸脱水酶基因(例如ilvD)编码序列置于SEQ ID NO:1所示启动子的控制下；和/或(c)吡啶核苷酸转氢酶基因(例如pntAB)编码序列置于SEQ ID NO:1、3、4或5所示启动子的控制下；和/或(d)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶基因(例如yfjB)编码序列置于SEQ ID N0:2、3或4所示启动子的控制下。在一个实施方案中，本发明的所述吡唳核苷酸转氢酶是PntAB蛋白。
[0023]在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其包含:
[0024](a)活性增强的乙酰羟酸还原异构酶(例如其编码基因如ilvC)；
[0025](b)活性增强的二羟酸脱水酶(例如其编码基因如ilvD)；
[0026](c)来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶(例如其编码基因如kivD)；
[0027](d)来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶(例如其编码基因如alsS);并且所述重组大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB基因置于SEQ ID NO:5所示的启动子控制之下以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因yfjB置于SEQ ID NO:4所示的启动子控制之下。
[0028]在一个的实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中选自如下的一或多种内源性酶的活性被降低、例如被失活:乳酸脱氢酶`、丙酮酸甲酸裂解酶、富马酸还原酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、丙酸激酶、甲酸乙酰基转移酶和甲基乙二醛合酶。
[0029]在进一步的实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中编码内源性乳酸脱氢酶(例如IdhA)、丙酮酸甲酸裂解酶(例如pflB)、富马酸还原酶(例如frd)、磷酸乙酰转移酶(例如pta)、乙酸激酶(例如ackA)、乙醇脱氢酶(例如adhE)、丙酸激酶(例如tdcD)、甲酸乙酰基转移酶(例如tdcE)和/或甲基乙二醛合酶(例如mgsA)的基因的一或多个(例如全部)被弱化，例如被敲除。
[0030]在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其包含:
[0031](a)大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶编码基因ilvC，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA位点并且置于SEQ ID NO:3所示的启动子的控制下；
[0032](b)大肠杆菌的二羟酸脱水酶编码基因ilvD，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ ID NO:1所示的启动子的控制下；
[0033](c)乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶编码基因kivD，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ ID NO:1所示的启动子控制之下；
[0034](d)乳酸乳球菌的醇脱氢酶编码基因adhA，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的富马酸还原酶编码基因frd位点并且置于SEQ ID NO:75所示的启动子控制之下；
[0035](e)枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS，其被分别整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酸激酶编码基因tdcD位点和乳酸脱氢酶编码基因IdhA位点(即一个拷贝的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS被整合到tdcD位点，同时一个拷贝的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS被整合到IdhA位点)并且分别置于SEQ ID NO:1和5所示的启动子控制之下；
[0036]并且所述重组大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB基因的原始启动子被替换为SEQ ID NO:1、3、4或5所示的启动子；以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因yfjB基因的原始启动子被替换为SEQ ID NO:2、3或4所示的启动子；以及
[0037]所述重组大肠杆菌的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB、富马酸还原酶编码基因frd、丙酸激酶编码基因tdcD、甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE、乳酸脱氢酶编码基因ldhA、磷酸乙酰转移酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因ackA和乙醇脱氢酶编码基因adhE被敲除。
[0038]在另一个方面，本发明提供了本发明所述重组大肠杆菌在生产异丁醇中的应用。
[0039]在另一个方面，本发明提供了使用本发明所述重组大肠杆菌生产异丁醇的方法，所述方法包括:发酵培养本发明的重组大肠杆菌，分离并收获异丁醇。
[0040]重组大肠杆菌产生异丁醇的条件是本领域技术人员已知的任何培养大肠杆菌以及生产异丁醇所需的发酵条件。本发明所述发酵可以是厌氧发酵或有氧发酵。
[0041 ] 所述发酵可以 在有氧条件下例如在空气中进行。为了保持这些条件，氧气或含氧混合气例如空气可充入培养物。
[0042]所述发酵可以在厌氧例如无氧或者微氧条件下进行，例如通过通入氮气或其它合适气体进行。在一个实施方案中，本发明的无氧或者微氧发酵使用厌氧小瓶进行。
[0043]在一个实施方案中，所述好氧发酵的空气通气量为0.1-3.0L/min.L,例如0.1L/min.L、0.2L/min.L、0.3L/min.L、0.4L/min.L、0.5L/min.L、0.6L/min.L、0.7L/min.L、0.8L/min.L、0.9L/min.L、1.0L/min.L、1.5L/min.L、2.0L/min.L、2.5L/min.L 或 3.0L/min.L。
[0044]所述大肠杆菌的发酵温度可以是本领域已知的任何合适温度。在一个实施方案中，所述大肠杆菌的发酵在25°C -39°C，例如25°C、30°C、37°C或39°C下进行。
[0045]为了调节培养基或者培养物的pH值，可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或者酸性化合物如磷酸或硫酸。在一个实施方案中，用于所述大肠杆菌的发酵系统的 pH 值为 6.0-8.0，例如 6.0,6.5,7.0,7.5 或 8.0。
[0046]在一个实施方案中，所述大肠杆菌的发酵时间为24小时-144小时,例如24小时、48小时、72小时、96小时、120小时或144小时。
[0047]本发明所述重组大肠杆菌还可以使用简单无机盐培养基来发酵生产异丁醇，从而降低生产成本和下游分离提取成本。在一个实施方案中，用于本发明所述大肠杆菌的培养基可以是本领域已知的任何适合的培养基。在一个实施方案中，所述培养基是由溶于水的以下成分组成的培养基:葡萄糖、KH2PO4' K2HPO4' (NH4)2HPO4' MgSO4.7H20 和 CaCl2.2H20 ；FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20, ZnCl2, Na2MoO4.2H20 和 MnCl2.4H20。
[0048]在一个实施方案中，所述培养基成分的含量为:[0049]葡萄糖为50g/L_150g/L，例如 50g/L、100g/L 或 150g/L ；
[0050]KH2PO4 为 0.5g/L-5g/L，例如 0.5g/L、I g/L 或 5g/L ；
[0051]K2HPO4 为 0.5g/L-10g/L，例如 0.5g/L、lg/L、5g/L 或 lOg/L ；
[0052](NH4)2HPO4 为 lg/L-lOg/L，例如 lg/L、3g/L 或 lOg/L ；
[0053]MgSO4.7H20 为 0.lg/L_5g/L，例如 0.1 g/L, I g/L 或 5g/L ；
[0054]CaCl2.2H20 为 0.lg/L_5g/L，例如 0.1 g/L, I g/L 或 5g/L ；
[0055]FeCl3.6H20 为 0.2 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.2 μ g/L、1.5 μ g/L 或 5 μ g/L ；
[0056]CoCl2.6Η20 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;
[0057]CuCl2.2Η20 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;
[0058]ZnCl2 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L、0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ；
[0059]Na2MoO4.2H20 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L,0.1 μ g/L 或 5 μ g/L ;和
[0060]MnCl2.4H20 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L,例如 0.05 μ g/L、0.2 μ g/L 或 5 μ g/L。
[0061]在一个实施方案中，本发明所述重组大肠杆菌的发酵可以首先在种子培养基中培养，然后将种子原液接种于发酵培养基中。所述种子培养基的成分组成可以与发酵培养基相同。在一个实施方案中，所述种子原液接种发酵培养基的接种量的体积百分比为0.01% -10%，例如 0.01%,0.3%或 10%。
[0062]本发明重组大肠杆菌发酵生产的异丁醇可以通过本领域已知的任何方法进行分离和纯化。例如参见(Atsumi et al., 2008 ；Inokuma et al., 2010 ；Baez et al.,2011)。
[0063]在另一个方面，本发明提供了一种制备用于生产异丁醇的重组大肠杆菌的方法，包括(a)将编码2-酮酸脱羧酶和乙酰乳酸合成酶的核酸序列导入包含醇脱氢酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶的大肠杆菌中，并且(b)同时增强该大肠杆菌中吡啶核苷酸转氢酶PntAB和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性。
[0064]在一个实施方案中，本发明所述吡啶核苷酸转氢酶PntAB编码基因的原始启动子和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因(例如yfjB)的原始启动子被替换为SEQ IDNO:1、2、3、4或5所示的启动子。在一个实施方案中，所述吡啶核苷酸转氢酶PntAB编码基因的原始启动子被替换为SEQ ID NO:1、3、4或5所示的启动子。在一个实施方案中，本发明所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因的原始启动子被替换为SEQ IDNO:2、3或4所示的启动子。所述替换可以通过同源重组进行。
[0065]在一个实施方案中，所述2-酮酸脱羧酶选自乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶、鼠伤寒沙门氏菌2-酮酸脱羧酶和乙酰丁酸梭菌2-酮酸脱羧酶，优选乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶。
[0066]在一个实施方案中，所述乙酰乳酸合成酶选自枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶、肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶和乳酸乳球菌乙酰乳酸合成酶，优选枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶。
[0067]在一个实施方案中，所述方法包括增强乙酰羟酸还原异构酶和/或二羟酸脱水酶的活性。在一个实施方案中，所述酶的活性增强是通过过表达酶编码基因实现的。
[0068]在一个实施方案中，将所述酶的基因编码序列置于强启动子的控制之下和/或增加所述酶编码基因的一或多个拷贝来进行过表达。在一个实施方案中，将所述酶编码基因的一或多个拷贝和任选存在的启动子核苷酸序列整合入所述重组大肠杆菌的基因组中，或者将包含所述酶编码基因的质粒导入所述重组大肠杆菌中。[0069]在一个实施方案中，所述强启动子选自SEQ ID NO:1_5任一所示的启动子。
[0070]在一个实施方案中，本发明提供了一种制备用于生产异丁醇的重组大肠杆菌的方法，包括:(a)将编码乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶(例如kivD基因编码序列)和枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶(例如alsS基因编码序列)的核酸序列导入包含醇脱氢酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶的大肠杆菌中，(b)将额外拷贝的编码大肠杆菌乙酰羟酸还原异构酶(例如ilvC基因编码序列)和二羟酸脱水酶(例如ilvD基因编码序列)的核酸序列导入该大肠杆菌中；和(C)将该大肠杆菌中吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因的启动子分别置换为SEQ ID NO:5和4所示的启动子。在一个实施方案中，所述方法包括将编码外源醇脱氢酶例如乳酸乳球菌醇脱氢酶(例如adhA)的基因序列导入上述大肠杆菌中。
[0071]在一个实施方案中，所述方法包括降低、例如失活所述大肠杆菌中选自如下的一或多种内源性酶的活性:(i)乳酸脱氢酶；(ii)丙酮酸甲酸裂解酶；(iii)富马酸还原酶；(iv)磷酸乙酰转移酶；(V)乙酸激酶；(vi)乙醇脱氢酶；(vii)丙酸激酶；(viii)甲酸乙酰转移酶；和(ix)甲基乙二醛合酶。
[0072]在一个实施方案中，所述方法包括敲除所述大肠杆菌中选自如下的一或多种内源性酶的编码基因:(i)乳酸脱氢酶(例如ldhA) ；(ii)丙酮酸甲酸裂解酶(例如pflB)；(iii)富马酸还原酶(例如frd) ； (iv)磷酸乙酰转移酶(例如pta) ； (v)乙酸激酶(例如ackA) ; (vi)乙醇脱氢酶(例如adhE) ； (vii)丙酸激酶(例如tdcD) ； (viii)甲酸乙酰转移酶(例如tdcE);和(ix)甲基乙二醒合酶(例如mgsA)。
[0073]在一个实施方案中，本发明提供了一种制备用于生产异丁醇的重组大肠杆菌的方法，包括:(a)将大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶编码基因ilvC整合到所述重组大肠杆菌染色体的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA位点并且置于SEQ ID NO:3所示的启动子的控制下；(b)将大肠杆菌的二羟酸脱水酶编码基因ilvD整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ ID NO:1所示的启动子的控制下；(c)将乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶编码基因kivD整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ IDNO:1所示的启动子控制之下；(d)将乳酸乳球菌的醇脱氢酶编码基因adhA整合到所述重组大肠杆菌染色体的富马酸还原酶编码基因frd位点并且置于SEQ ID NO:75所示的启动子控制之下；(e)将枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS分别整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酸激酶编码基因tdcD位点和乳酸脱氢酶编码基因IdhA位点(即一个拷贝的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS被整合到tdcD位点，同时一个拷贝的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS被整合到IdhA位点)，并且分别置于SEQ ID NO:1和5所示的启动子控制之下；并且将所述重组大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶编码基因PntAB基因的原始启动子替换为SEQID NO:1、3、4或5所示的启动子以及将烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸激酶编码基因yfjB的原始启动子替换为SEQ ID NO:2、3或4所示的启动子；以及敲除重组大肠杆菌的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB、富马酸还原酶编码基因frd、丙酸激酶编码基因tdcD、甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE、乳酸脱氢酶编码基因ldhA、磷酸乙酰转移酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因ackA和乙醇脱氢酶编码基因adhE。
[0074]本发明中所述2-酮酸脱羧酶是指催化a-酮异戊酸转变为异丁醛和0)2的酶。优选的 2-酮酸脱羧酶的 EC 编号是 4.1.1.72 (Enzyme Nomenclature 1992, AcademicPress, San Diego),可得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(GenBank No:AAS49166,AY548760)、鼠伤寒沙门氏菌(GenBank No:NP_461346)和乙酸丁酸梭菌(GenBank No:NP_149189, NCJDO1988)。
[0075]本发明中所述醇脱氢酶是指催化醛转变为醇的酶。在本发明一个实施方案中，所述醇脱氢酶是指催化异丁醛转变为异丁醇的酶。本发明优选的醇脱氢酶的EC编号是1.1.1.265 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego),但是也可以是分类为其他的醇脱氢酶(特别地如EC 1.1.1.1或1.1.1.2)。
[0076]本发明中所述乙酰乳酸合成酶是指能够催化丙酮酸转变为乙酰乳酸和CO2的酶。优选的乙酸乳酸合成酶的EC编号为2.2.1.69 (Enzyme Nomenclature 1992, AcademicPress, San Diego)。这些酶可以得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌(GenBankNo:CAB15618, Z99122)、肺炎克雷伯氏菌(GenBank No:AAA25079, M73842)和乳酸乳球菌(GenBankNo:AAA25161, L16975)。
[0077]本发明中所述乙酰羟酸还原异构酶是指能够通过使用NADPH作为电子供体催化乙酰乳酸转变为2，3_ 二羟基异戊酸的酶。优选的乙酰羟酸还原异构酶的EC编号是1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego),其可以得自大量微生物，包括但不限于大肠杆菌(GenBank No:NP_418222，NC_000913)、酿酒酵母(GenBank No:NP_013459，NC_001144)、Methanococcus maripaludis(GenBank No:CAF30210, BX957220)和枯草芽孢杆菌(GenBank No:CAB 14789，Z99118)。
[0078]本发明中所述二羟酸脱水酶是指催化2，3_ 二羟基异戊酸转变为a-酮异戍酸的酶。优选的二轻酸脱水酶的EC编号为4.2.1.9 (Enzyme Nomenclature 1992,Academic Press, San Diego)。这种酶可以得自大量微生物，包括但不限于大肠杆菌(GenBank No:YP_026248, `NC_000913)、酿酒酵母(GenBank No:NP_012550, NC_001142)、M.maripaludis (GenBank No:CAF29874, BX957219)和枯草芽孢杆菌(GenBank No:CAB14105, Z99115)。
[0079]本发明中所述吡啶核苷酸转氢酶是指催化NADH与NAD+之间相互转换、同时实现NADP+与NADPH之间相互转换的酶，反应的同时将质子从胞外泵入胞内。优选的吡啶核昔酸转氢!酶的 EC 编号为 1.6.1.2 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, SanDiego)。这种酶可以得自大量生物，包括但不限于大肠杆菌(GenBank No:NC_000913.2)、Rhodospirillum rubrum(GenBank No:NC_017584.1)、Entamoeba histolytica(GenBankNo:Nff_001914887.1)和 Caenorhabditis elegans(GenBank No:Chromosome:X ；NC_003284.8)。
[0080]本发明中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶是指可以将NAD+磷酸化为NADP+的酶。优选的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的EC编号为2.7.1.23 (Enzyme Nomenclature1992, Academic Press, San Diego)。这种酶可以得自大量微生物,包括但不限于大肠杆菌(GenBank No:NC_000913.2)，酿酒酵母(GenBank No =Chromosome:V ；NC_001137.3)、Methanocaldococcus jannaschii (GenBank No:NC_000909.1)和枯草芽抱杆菌(GenBankNo:NC_004350.2)。
[0081]本发明所述酶编码“基因”的核苷酸序列可以得自各种公开出版物、专利申请、专利、参考文献、数据库等，例如2-酮酸脱羧酶编码基因kivD(GenBank No:AAS49166,AY548760)、醇脱氢酶编码基因 adhA (GenBank No:NP_267964.1，NC_002662.1)、乙酰乳酸合成酶编码基因alsS(GenBank No:CAB15618, Z99122)、乙酰羟酸还原异构酶编码基因 ilvC(GenBank No:NP_418222, NC_000913)、二羟酸脱水酶编码基因 ilvD(GenBank No:YP_026248, NC_000913)、吡啶核苷酸转氢酶编码基因 pntAB(GenBank No:NC_000913.2)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因yfjB (GenBank No:ACA76736.1)、乳酸脱氢酶编码基因 IdhA(GenBank N0.:YP_001725238.1，NC_010468.1)、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因 pflB (GenBank N0.:ACA78322.1)、富马酸还原酶编码基因 frd (frdA GenBank No:ACA79460.1，frdB GenBank No:ACA79461.1，frdC GenBank No:ACA79462.1，frdDGenBank No:ACA79463.1)、磷酸乙酰转移酶编码基因 pta (GenBank No:ACA77021.1)、乙酸激酶编码基因ackA(GenBank No:ACA77022.1)、乙醇脱氢酶编码基因adhE(GenBank No:ACA78022.1)、丙酸激酶编码基因tdcD (GenBank No:ACA76259.1)、甲酸乙酰基转移酶编码基因 tdcE (GenBank No:ACA76260.1),以及甲基乙二醒合酶编码基因 mgsA (GenBank No:ACA78263.1)。
[0082]本发明所述“任选地”或“任选存在的”是指可以存在或不存在。例如，所述“任选地，选自所述2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶中的1、2、3、4或5种酶的活性被增强”是指本发明所述大肠杆菌具有活性增强的吡啶核苷酸转氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶，而该重组大肠杆菌中的2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶中的1、2、3、4或5种酶的活性也可以被增强，或者也可以不被增强。
[0083]本文所述“外源”的基因是指在大肠杆菌中不是以天然状态存在的基因，其通过基因转移技术引入所述大肠杆菌中。
[0084]文中术语“弱化”是指降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性，例如使用弱启动子，或使用编码具有低活性的基因或等位基因，或失活相应基因或酶(蛋白质)，及任选地组合这些措施。通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质活性或浓`度的0-50 %，0-25 %，0-10 %或0-5 %。
[0085]所述酶的失活可以通过本领域已知的任何合适方法实现，例如敲除编码基因、基因突变、使用抑制剂例如SiRNA等。在一个实施方案中，所述酶的失活是通过同源重组敲除了编码基因而实现的。
[0086]本发明的所述重组微生物可以连续培养，如在WO 05/021772中所述；或者非连续地分批进行培养(分批培养)或者补料分批培养或者重复补料分批培养，以产生希望的有机化合物例如异丁醇。关于用于大肠杆菌的培养基的描述可以见American Society forBacteriology的Manual of Methods for General Bacteriology(Washington D.C., USA,1981)所述。术语“培养基”、“发酵培养基”或者“种子培养基”可互换使用。
[0087]本发明所述的同时增强吡啶核苷酸转氢酶和NAD激酶的重组大肠杆菌异丁醇好氧和厌氧发酵的产量和转化率均提高。此外，本发明可以将异丁醇代谢途径中的关键基因整合到大肠杆菌基因组中，并使用组成型调控元件对这些基因的表达进行调控，从而可以获得遗传稳定的重组大肠杆菌。【专利附图】

【附图说明】:
[0088]图1:异丁醇合成途径
[0089]图2:吡啶核苷酸转氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶催化的生化反应示意图
[0090]图3:大肠杆菌ATCC 8739到重组大肠杆菌AS108的构建示意图
[0091]图4:敲除乳酸脱氢酶基因(IdhA)所需质粒的构建示意图
[0092]图5:大肠杆菌XZ-TllO的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*(SEQIDNO:75)，乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因和大肠杆菌的二羟酸脱水酶基因在菌株XZ-T010中的整合示意图
[0093]图6:乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因和大肠杆菌的二羟酸脱水酶基因在菌株AS18中的表达调控不意图
[0094]图7:质粒pXZ112和pXZ116的示意图；
[0095]图8:大肠杆菌ATCC 8739以及激活了 PntAB和YfjB的工程菌生产异丁醇的产量和转化率。
【具体实施方式】
[0096]本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
[0097]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0098]实施例1、重组大肠杆菌AS18的构建
[0099]重组大肠杆菌AS18的构建，分为以下六个步骤(图3):
[0100](1)乳酸脱氢酶基因IdhA的敲除
[0101]乳酸脱氢酶基因IdhA(GenBank No:YP_001725238.1，NC_010468.1)的敲除采用两步同源重组的方法，共以下六步(图4):
[0102]第一步，以大肠杆菌ATCC 8739 (来自ATCC)基因组DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down，扩增大肠杆菌ATCC8739的乳酸脱氢酶编码基因IdhA及其上下游各400个左右喊基。引物序列为:
[0103]XZ-ldhA-up:GATAACGGAGATCGGGAATG(SEQ ID NO:7),
[0104]XZ-ldhA-down:CTTTGGCTGTCAGTTCACCA(SEQ ID NO:8)。
[0105]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0106]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0107]扩增产物包含乳酸脱氢酶基因IdhA及其上下游各400个左右碱基，并将其克隆到pEASY-Blunt克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)上。克隆体系为:lul PCR扩增产物、I μ I pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟；42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm, 37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15yg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PEASY-Blunt上插入了乳酸脱氢酶基因及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZOOl (图4)。
[0108]第二步，以pXZOOl质粒DNA为模板，使用引物XZ-ldhA-l/XZ-ldhA_2扩增出一段DNA片段，引物序列为:
[0109]XZ-1dhA-1:TCTGGAAAAAGGCGAAACCT(SEQ ID NO:9),
[0110]XZ-ldhA-2:TTTGTGCTATAAACGGCGAGT(SEQ ID NO:10)。
[0111]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0112]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸2分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0113]PCR扩增产物包含pEASY-Blunt载体和乳酸脱氢酶编码基因上下游各400个左右喊基。
[0114]第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。以pBM002质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)为模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR扩增cat-sacB片段。引物序列为:
[0115]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0116]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0117]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0118]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0119]连接体系为:10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 连接缓冲液(NEB 公司)，I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 μ I。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17yg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZOOl中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ002(图4)。
[0120]第四步，以PXZ002质粒DNA为模板，使用弓丨物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出DNA片段I。
[0121]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0122]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0123]DNA片段I包含乳酸脱氢酶编码基因IdhA上游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、乳酸脱氢酶编码基因IdhA下游400个左右碱基。
[0124]将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将pKD46质粒(Datsenko and Wanner,2000)通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌ATCC8739 (Morrison, 1977)，然后将DNA片段I电转至带有PKD46的大肠杆菌ATCC8739。
[0125]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌ATCC8739的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3859bp的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-TOOI。
[0126]第五步，将第二步得到的pXZOOl质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，自连得到的质粒用于第二次同源重组。
[0127]具体步骤如下:将第二步的PCR扩增产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCRExtration KU，购自BioMIGA生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2 μ I 10ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、1 μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μ 1，37°C 反应 30 分钟；加入 I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5 μ I连接产物加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒pXZ003(图4)。
[0128]第六步，以pXZ003质粒DNA为模板，用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down扩增出DNA片段II。
[0129]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0130]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0131]DNA片段II用于第二次同源重组。首先将PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-TOOl (Morrison, 1977)，然后将 DNA 片段 II 电转至带有 pKD46 质粒的 XZ-T001。
[0132]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的XZ-T001的电转化感受态细胞(Doweretal.,1988);将50 感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-ldhA-up/XZ-ldhA-down进行验证，正确的菌落扩增产物为763bp的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T002，得到菌株XZ-T002 (表I)。
[0133](2)丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB的敲除
[0134]在菌株XZ-T002中敲除丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB (GenBank No:ACA78322.1)，操作步骤共以下六步:
[0135]第一步，以大肠杆菌ATCC 8739基因组DNA为模板，使用引物XZ_pf lB_up/XZ-pf IB-down (SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16)，扩增大肠杆菌 ATCC8739 的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB及其上下游各400个左右碱基。
[0136]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10 [0137]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0138]将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系为:1 U I PCR扩增产物、I U IpEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50 u I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟；42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 u I LB培养基，200rpm, 37°C孵育I小时。取200 yl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15i!g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PEASY-Blunt上插入了丙酮酸甲酸裂解酶编码基因及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为PXZ015。
[0139]第二步，以pXZ015 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ_pflB-l/XZ-pf 1B-2 (SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18)进行PCR扩增，扩增产物包含pEASY-Blunt载体和丙酮酸甲酸裂解酶编码基因上下游各400个左右喊基。
[0140]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0141]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0142]第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。以pBM002质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)为模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR扩增cat-sacB片段。引物序列为:
[0143]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0144]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0145]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0146]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0147]连接体系为:10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的cat-sacB DNA片段，2μ I10ΧΤ4 连接缓冲液(NEB 公司)，I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 μ I。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ015中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ016。
[0148]第四步，以pXZ016质粒DNA为模板，使用引物XZ_pflB-up/XZ-pflB-down扩增出DNA片段I。
[0149]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0150]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0151]DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB上游400个左右碱基、cat-sacBDNA片段、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB下游400个左右碱基。
[0152]将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株XZ-T002 (Morrison，1977)，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株XZ-T002。
[0153]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌XZ-T002的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，37 °C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-pf ΙΒ-up/XZ-pf IB-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3909b p的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T003。
[0154]第五步，将第二步得到的pXZ015质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，进行自连，自连得到的质粒用于第二次同源重组。[0155]具体步骤如下:将第二步的PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCRExtration KU，购自BioMIGA生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物，加A2u I 10XT4连接缓冲液(NEB公司)、I yl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20ii 1，37°C 反应 30 分钟；加入 I ii I T4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5 ill连接产物加入50 u I Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 ill LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15i!g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，得到质粒PXZ017。
[0156]第六步，以pXZ017质粒DNA为模板，用引物XZ-pflB-up/XZ-pflB-down扩增出DNA片段II，DNA片段II用于第二次同源重组。 [0157]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0158]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0159]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的XZ-T003的电转化感受态细胞(Doweretal.,1988);将50 感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-pf lB-up/XZ-pf IB-down进行验证，正确的菌落扩增产物为879bp的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T004，得到菌株XZ-T004 (表I)。
[0160]敲除pflB基因所构建的质粒见表3,使用的引物序列见表2。
[0161](3)富马酸还原酶编码基因frd的敲除
[0162]在菌株XZ-T004中敲除富马酸还原酶编码基因frdABCD (frdA GenBank No:ACA79460.1，frdB GenBank No:ACA79461.1，frdC GenBank No:ACA79462.1，frdDGenBankNo:ACA79463.1)，操作步骤共以下六步:
[0163]第一步，以大肠杆菌ATCC 8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-frdB_up/XZ-frdC-down (SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)，扩增大肠杆菌 ATCC8739 的富马酸还原酶编码基因frdAB⑶及其上下游各400个左右碱基。
[0164]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0165]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。[0166]将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系为:1 μ I PCR扩增产物、
Iμ IpEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟；42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了富马酸还原酶编码基因frdAB⑶及其上下游各400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为PXZ005。
[0167]第二步，以pXZ005 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ-frdC-l/XZ-frdB-2 (SEQ ID NO:29/SEQ ID NO:30)进行PCR扩增，扩增产物包含pEASY-Blunt载体和富马酸还原酶编码基因上下游各400个左右碱基。
[0168]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ M)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0169]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0170]第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产 物。
[0171]以PBM002质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)为模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR 扩增 cat-sacB 片段。引物序列为:
[0172]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0173]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0174]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0175]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0176]连接体系为:10ng的第二步PCR扩增产物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 连接缓冲液(NEB 公司)，I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 μ I。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ005中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为PXZ006。
[0177]第四步，以PXZ006质粒DNA为模板，使用弓丨物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down扩增出DNA片段I。[0178]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10 μ Μ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0179]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0180]DNA片段I包含富马酸还原酶编码基因frdAB⑶上游400个左右碱基、cat-sacBDNA片段、富马酸还原酶编码基因frdAB⑶下游400个左右碱基。
[0181]将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株XZ-T004 (Morrison, 1977)，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株XZ-T004。
[0182]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌XZ-T004的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，37 °C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3901bp的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T005。
[0183]第五步，将第二步得到的pXZ005质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，并进行自连。
[0184]具体步骤如下:将第二步的PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCRExtration KU，购自BioMIGA生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物，加Λ2μ I 10ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μ 1，37°C 反应 30 分钟；加入 I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5 μ I连接产物加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒PXZ007。
[0185]第六步，以pXZ007质粒DNA为模板，用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down扩增出DNA片段II。
[0186]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ l、dNTP (每种 dNTP 各IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各2μ l.Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸懼水 33.5 μ I,总体积为 50 μ I。
[0187]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0188]DNA片段II用于第二次同源重组。首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-T005 (Morrison, 1977)，然后将 DNA 片段 II 电转至带有 pKD46 质粒的 XZ-T005。
[0189]电转条件为:首先准备带有pKD46质粒的XZ-T005的电转化感受态细胞(Dower etal.,1988);将50111感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down进行验证，正确的菌落扩增产物为821bp的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T006，得到菌株XZ-T006(表I)。
[0190]敲除frd基因所构建的质粒见表3,使用的引物序列见表2。
[0191](4)磷酸乙酰转移酶编码基因pta和乙酸激酶编码基因ackA的敲除
[0192]在菌株XZ-T006中敲除磷酸乙酰转移酶编码基因pta (GenBank No:ACA77021.1)和乙酸激酶编码基因ackA(GenBank No:ACA77022.1)，操作步骤共以下六步:
[0193]第一步，以大肠杆菌ATCC 8739基因组DNA为模板，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down (SEQ ID NO:35/SEQ ID NO:36)，扩增大肠杆菌 ATCC8739 的磷酸乙酰转移酶编码基因Pta及其下游400个左右碱基和乙酸激酶编码基因ackA及其上游400个左右碱基。
[0194]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0195]扩增条件为98°C`预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0196]将扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体上。克隆体系为:1 U I PCR扩增产物、
IU IpEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应5分钟后加入50 u I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟；42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 ill LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15i!g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入了磷酸乙酰转移酶编码基因Pta及其下游400个左右碱基和乙酸激酶编码基因ackA及其上游400个左右碱基，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ023。
[0197]第二步，以pXZ023 质粒 DNA 为模板，使用引物 XZ-ackA-2/XZ-pta_2 (SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38)进行PCR扩增，扩增产物包含pEASY-Blunt载体和磷酸乙酰转移酶编码基因pta下游400个左右碱基及乙酸激酶编码基因ackA上游400个左右碱基。
[0198]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0199]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0200]第三步，将含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)DNA片段连接至第二步的PCR扩增产物。[0201]以PBM002质粒(来源于合肥百迈生物技术有限公司)为模板，使用引物cat-sacB-up/down PCR 扩增 cat-sacB 片段。引物序列为:
[0202]cat-sacB-up:GGAGAAAATACCGCATCAGG(SEQ ID NO:11)
[0203]cat-sacB-down:GCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO:12)。
[0204]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0205]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。琼脂糖凝胶电泳回收，获得含有氯霉素基因(cat)和果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB)的DNA片段(3030bp)。
[0206]连接体系为:IOng的第二步PCR扩增产物，30ng的cat-sacB DNA片段，2 μ I10ΧΤ4 连接缓冲液(NEB 公司)，I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 μ I。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒(将cat-sacB DNA片段克隆到pXZ023中的质粒)进行测序验证，测序结果在上述第二步的PCR扩增产物上连接了 cat-sacB DNA片段，证明质粒构建正确，将得到的重组质粒命名为pXZ024。
[0207]第四步，以pXZ024质粒DNA为模板，使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down扩增出DNA片段I。
[0208]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0209]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸I分钟30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0210]DNA片段I包含磷酸乙酰转移酶编码基因pta下游400个左右碱基、cat-sacB DNA片段、乙酸激酶编码基因ackA上游400个左右碱基。
[0211]将DNA片段I用于第一次同源重组。首先将PKD46质粒通过氯化钙转化法转化至菌株XZ-T006 (Morrison，1977)，然后将DNA片段I电转至带有pKD46的菌株XZ-T006。
[0212]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的菌株XZ-T006的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 μ g/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行验证，正确的菌落扩增产物为301 Ibp的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T009。
[0213]第五步，将第二步得到的pXZ023质粒的DNA扩增片段进行磷酸化处理，进行自连。[0214]具体步骤如下:将第二步的PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCRExtration KU，购自BioMIGA生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物，加A2μ 1 10XT4连接缓冲液(NEB公司)、1 μ 1 T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μ 1，37°C 反应 30 分钟；加入 1 μ 1 T4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5 ill连接产物加入50 μ 1Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250 μ 1 LB培养基，200rpm，37°C孵育1小时。取200 菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果上述第二步的PCR扩增产物进行了自连，证明质粒构建正确，得到质粒PXZ025。
[0215]第六步，以pXZ025质粒DNA为模板，用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down扩增出DNA片段II，DNA片段II用于第二次同源重组。
[0216]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 10禮)1111、0嫩模板20叩、引物(10uM)各 2 μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5μ 1、蒸馏水 33.5μ 1，总体积为 50u 1.
[0217]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、56°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0218]首先将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至XZ-T009 (Morrison，1977)，然后将DNA片段II电转至带有pKD46质粒的XZ-T009。
[0219]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的XZ-T009的电转化感受态细胞(Doweretal.,1988);将50 感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-ackA-up/XZ-pta-down进行验证,正确的菌落扩增产物为731bp的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为XZ-T010，得到菌株XZ-TOlO (表I)。
[0220]敲除ackA-pta基因所构建的质粒见表3，使用的引物序列见表2。
[0221](5)整合乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因和大肠杆菌的二羟酸脱水酶基因(图5)
[0222]整合乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶基因(GenBank No:AAS49166, AY548760)和大肠杆菌的二羟酸脱水酶基因(GenBank No:YP_026248, NC_000913)并提高其表达强度，共有以下七步。所用引物见表2。
[0223]第一步，克隆大肠杆菌MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的启动子pck到载体pTrc99A0
[0224]以大肠杆菌MG1655 (来自ATCC，编号700926)基因组为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI/P-pck*-down-KpnI(SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20)扩增大肠杆菌 MG1655的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的启动子pck，引物序列见表2。[0225]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0226]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环);98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0227]扩增产物为磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的启动子pck，PCR产物进行SpeI (购自NEB公司)和KpnI (购自NEB公司)酶切。将其克隆到经过相同酶酶切的pTrc99A(来源于合肥百迈生物技术有限公司)表达载体上。
[0228]连接体系为:10ng的pTrc99A酶切产物，30ng的pck酶切片段，2μ I 10ΧΤ4连接缓冲液(NEB 公司),I μ I T4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20μ1。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ ILB培养基，200rpm, 37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氨苄青霉素(终浓度为lOOyg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pTrc99A上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的启动子pck，证明质粒构建正确，将得到的表达质粒命名为pXZ602。
[0229]第二步,克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*到pTrc99A。 [0230]以质粒pXZ602 为模板，设计引物 pck*-F/pck*-R(SEQ ID NO:21/SEQ ID NO:22)，引物序列为见表2。
[0231]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0232]扩增条件98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸7分钟(I个循环)。
[0233]扩增产物经过T4多核苷酸激酶(购自NEB公司)加磷，自连得到阳性质粒。
[0234]具体步骤如下:将PCR扩增的产物首先用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCRExtration Kit,购自BioMIGA生物技术有限公司);取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2 μ I 10ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、1 μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μ 1，37°C 反应 30 分钟；加入 I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，室温反应2小时得到连接产物；取5 μ I连接产物加入50 μ I Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入25(^11^培养基，200印111，371:孵育1小时。取200 μ I菌液涂在含有氨苄青霉素(终浓度为lOOyg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pTrc99A上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*(SEQ ID NO:75)，证明质粒构建正确，将得到的表达质粒命名为PXZ603。
[0235]第三步，进行乳酸乳球菌2-酮酸脱羧酶基因、大肠杆菌二羟酸脱水酶基因，及pck*启动子的连接反应。
[0236]以乳酸乳球菌(Lactococuslactis IL1403，来自 ATCC，编号 7962)基因组 DNA 为模板，用引物 kivD-F-KpnI/kivD-R-XbaI(SEQ ID NO:23/SEQ ID NO:24)，扩增乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶编码基因kivD。
[0237]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 ii 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0238]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为2-酮酸脱羧酶编码基因kivD，PCR产物进行KpnI (购自NEB公司)和XbaI (购自NEB公司)酶切。
[0239]以大肠杆菌MG1655 (来自ATCC，编号700926)基因组DNA为模板，使用引物ilvD-F-Xbal/iIvD-R-SalI (SEQ ID NO:25/SEQ ID NO:26)，扩增大肠杆菌MG1655 的二羟酸脱水酶基因ilvD。
[0240]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0241]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环)；72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为二羟酸脱水酶基因ilvD，PCR产物进行XbaI (购自NEB公司)酶切。
[0242]以质粒pXZ603为模板,使用引物P-pck*-up_SpeI和P-pck*-down_KpnI扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck'扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液 IOii 1、(1见？(每种(1见13各101111)111 1、0嫩模板20叩、引物(IOiiM)各 2 ii l.PhusionHigh-Fidelity DNA 聚合`酶(2.5U/yl) 0.5 yl、蒸馏水 33.5 yl，总体积为 50 yl。扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环);98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环)；72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck% PCR产物进行KpnI酶切。
[0243]上述三个片段进行连接反应。连接体系为:pck*酶切PCR片段10ng，kivD酶切PCR 片段 20ng，ilvD 酶切 PCR 片段 15ng，5 U I 2Xquick Iigase 缓冲液(购自 NEB 公司)，0.5 u IQuick T4DNA连接酶(购自NEB公司)，补充蒸馏水至lOiil。25°C，5分钟。
[0244]以连接产物为模板，使用引物P-pck*-up-SpeI和iIvD-R-SalI进行PCR扩增以提高连接产物的浓度。
[0245]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0246]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、58°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环)；72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为pck%kivD和ilvD的连接片段。
[0247]第四步，以pXZ015质粒DNA为模板，用引物XZ_pflB-l/XZ-pf 1B-2进行PCR扩增，得到pXZ015质粒的DNA扩增片段。
[0248]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0249]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环);98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0250]第五步，将含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck'2-酮酸脱羧酶和二羟酸脱水酶的DNA片段连接至第四步PCR扩增产物。
[0251]连接体系为:10ng的第四步PCR扩增产物，30ng的第三步PCR扩增DNA片段，2μ I10ΧΤ4 连接缓冲液(NEB 公司)，I μ I Τ4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 μ I。室温连接2小时，取5μ I加入50μ I Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟，42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 μ I LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PXZ015上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck'2-酮酸脱羧酶编码基因kivD和二羟酸脱水酶ilvD，证明质粒构建正确，将得到的质粒命名为pXZ618(构建过程见图5a)。
[0252]第六步，以pXZ016 质粒 DNA 为模板，用引物 XZ_pflB-up/XZ-pflB-down 进行 PCR扩增，得到PXZ016质粒的DNA扩增片段I。
[0253]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM)I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0254]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0255]DNA片段I包含丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB上游400个左右碱基、cat-sacBDNA片段、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB下游400个左右碱基。
[0256]将pXZ016质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组。
[0257]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌XZ-T010的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA扩增片段I，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 μ I菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17yg/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-pflB_up/XZ-pf IB-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3909bp的片段)。挑选一个正确的单菌落，得到菌株AS5 (构建过程见图5b)。
[0258]第七步，以pXZ618 质粒 DNA 为模板，用引物 XZ_pflB-up/XZ-pflB-down 进行 PCR扩增，得到PXZ618质粒的DNA扩增片段II。
[0259]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0260]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟15秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。[0261]将PXZ618质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组。
[0262]电转条件为:首先准备带有pKD46的菌株AS5的电转化感受态细胞(Dower etal.，1988);将50 μ I感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-pf lB-up/XZ-pf IB-down进行验证，正确的菌落扩增产物为4871bp左右的片段。挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株AS6(表1)(构建过程见图5c)。
[0263](6)整合乳酸乳球菌的醇脱氢酶基因 [0264]将磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*和乳酸乳球菌的醇脱氢酶基因adhA (GenBank No:NP_267964.1,NC_002662.1)整合到 AS6 的 frd位点，并提高其表达强度，共有以下五步:
[0265]第一步，进行乳酸乳球菌的醇脱氢酶基因adhA，及pck*启动子的连接反应。
[0266]以乳酸乳球菌(Lactococuslactis IL1403，来自 ATCC，编号 7962)基因组 DNA 为模板，用引物 adhA-F-XbaI/adhA-R-SalI(SEQ ID NO:33/SEQ ID NO:34)，扩增乳酸乳球菌的醇脱氢酶基因adhA。
[0267]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。
[0268]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸30秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0269]扩增产物为醇脱氢酶基因adhA，PCR产物进行XbaI (购自NEB公司)酶切。
[0270]以质粒pXZ603 为模板，使用引物 P-pck*-up_SpeI 和 P-pck*-down_XbaI (SEQ IDNO:31/SEQ ID NO:32)扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*。扩增体系为:NewEngland Biolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP 各 IOmM) I μ 1、DNA 模板20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ l.Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水33.5 μ 1，总体积为50 μ I。扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸15秒(30个循环)；72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck% PCR产物进行XbaI酶切。
[0271]两个片段进行连接反应。连接体系为:pck*酶切PCR片段10ng，adhA酶切PCR片段 20ng，5yl 2Xquick Iigase 缓冲液(购自 NEB 公司)，0.5 μ I Quick T4DNA 连接酶(购自NEB公司)，补充蒸馏水至10 μ I。25°C，5分钟。
[0272]以连接产物为模板，使用引物P-pck*-up_SpeI和 adhA-R_SalI(SEQ ID NO:31/SEQIDNO:34)进行PCR扩增以提高连接产物的浓度。
[0273]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I μ 1、DNA 模板 20ng、引物(ΙΟμΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ I。[0274]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、59°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。扩增产物为pck*和adhA的连接片段。
[0275]第二步，以pXZ005质粒DNA为模板，用引物XZ-frdB-2/XZ-frdC_l进行PCR扩增，得到pXZ005质粒的DNA扩增片段。
[0276]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0277]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0278]第三步，将含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck'醇脱氢酶基因adhA的DNA片段连接至第二步PCR扩增产物。
[0279]连接体系为:IOng的第二步PCR扩增产物，30ng的第一步PCR扩增DNA片段，2 ill10XT4 连接缓冲液(NEB 公司),I U I T4 连接酶(NEB 公司，400，OOOcohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20 ill。室温连接2小时，取5 ill加入50 ill Transl-Tl感受态细胞中(购自北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟，42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250 u I LB培养基，200rpm, 37°C孵育I小时。取200 yl菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为15 u g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PXZ005上插入了磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的突变启动子pck*和醇脱氢酶基因adhA，证明质粒构建正确，将得到的质粒命名为pXZ619。
[0280]第四步，以pXZ006 质粒 DNA 为模板，用引物 XZ-frdB-up/XZ-frdC-down 进行 PCR扩增，得到PXZ006质粒的DNA扩增片段，将PXZ006质粒的DNA扩增片段用于第一次同源重组。[0281]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 U 1、dNTP (每种 dNTP各 IOmM) I ii 1、DNA 模板 20ng、引物(IOuM)各 2 y 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/iil)0.5iil、蒸馏水 33.5iil，总体积为 50u 10
[0282]扩增条件为98°C预变性2分钟(I个循环)；98°C变性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸I分钟(30个循环);72°C延伸5分钟(I个循环)。
[0283]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌AS6的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育2小时。取200 ill菌液涂在含有氯霉素(终浓度为17 u g/ml)的LB平板上，37°C过夜培养后，挑选5个单菌落进行PCR验证(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down进行验证，正确的菌落扩增产物为3901bp的片段)。挑选一个正确的单菌落，将其命名为AS17。
[0284]第五步，以pXZ619质粒DNA为模板，用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down进行PCR扩增，得到PXZ619质粒的DNA扩增片段，PXZ619质粒的DNA扩增片段用于第二次同源重组。[0285]扩增体系为:NewEnglandBiolabs Phusion 5X 缓冲液 10 μ 1、dNTP (每种 dNTP各 1OmM) 1 μ 1、DNA 模板 20ng、引物(10μΜ)各 2μ 1、Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶(2.5U/μ 1)0.5 μ 1、蒸馏水 33.5 μ 1，总体积为 50 μ 1。
[0286]扩增条件为98°C预变性2分钟(1个循环);98°C变性10秒、57°C退火10秒、72°C延伸1分钟40秒(30个循环);72°C延伸5分钟(1个循环)。
[0287]电转条件为:首先准备带有PKD46质粒的大肠杆菌AS17的电转化感受态细胞(Dower et al.，1988);将50 μ 1感受态细胞置于冰上，加入50ngDNA片段，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser (Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75转，30°C孵育4小时。将菌液转移至含有10%蔗糖的没有氯化钠的LB液体培养基(250ml烧瓶中装50ml培养基)，培养24小时后在含有6%蔗糖的没有氯化钠的LB固体培养基上划线培养。经过PCR验证(使用引物XZ-frdB-up/XZ-frdC-down进行验证,正确的菌落扩增产物为1844bp左右的片段)，挑选一个正确的单菌落，将其命名为菌株AS18 (表1)。
[0288]所用引物见表2，构建的质粒见表3。
[0289]表1、生产异丁醇的重组大肠杆菌
[0290]菌株名相关特征a_
ATCC 8739~野生型
XZ-T002AldhA
XZ-T004AldhA, ApflB
XZ-T006AldhA, ApflB, Afrd
XZ-TOlOAldhA, ΔρβΒ, Afrd, AackA-pta
AS6XZ-TOI O, pflB::pck*-kivD-1lvD
ASl 8A S 6, frd::pck*-adhA
AS29AS18，ρβΒ:: Ml-93-kivD-1lvD
AS72AS29, AadhE
AS74AS29, /\adhE, AtdcDE
整合α/Μ基因到/也乃五位点并用人工启动子进行调控
AS75AS74, tdcDE: :alsS AS77AS74, tdcDE::Ml-93-alsS
AS78AS74, tdcDE::Ml-37-alsS
AS79AS74, tdcDE::Ml-46-alsS
AS80AS74, tdcDE::Ml-30-alsS
AS81AS74, tdcDE::Ml-64-alsS
AS82AS74, tdcDE::Ml-12-alsS
整合基因到W/d位点并用人工启动子进行调控
AS83AS74，IdhAr.alsS
AS84AS74, ldhA::Ml-93-alsS
AS85AS74, ldhA::Ml-37-alsS
AS86AS74, IdhA::M1 -46-alsS
AS87AS74, ldhA::Ml-30-alsS
AS88AS74, IdhA::Ml-64-alsS
AS89AS74, ldhA::Ml-12-alsS
AS 105AS77, ldhA::Ml-64-alsS
整合z7vC基因到mgsA位点并用人工启动子进行调控
AS 106AS 105, mgsA;:M1 -93-1lvC
AS 107AS 105, mgsA::Ml-37-1lvC
AS 108AS 105, mgsA::Ml-46-1lvC
AS 109AS 105, mgsA::Ml-30-1lvC
在菌株AS108中调控/wLlS基因表达
AS 142AS 108, Ml-93-pntAB
AS 143ASm,Ml-37-pntAB
AS 144AS 108, Ml-46-pntAB_
[0291]
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌，其包含2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶，其特征在于所述大肠杆菌中吡啶核苷酸转氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶的活性同时被增强，并且任选地，选自2-酮酸脱羧酶、醇脱氢酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶中的1、2、3、4或5种酶的活性被增强。
2.权利要求1的重组大肠杆菌，其中所述2-酮酸脱羧酶和乙酰乳酸合成酶编码基因是外源的，并且任选地，重组大肠杆菌包含外源的醇脱氢酶编码基因。
3.权利要求2的重组大肠杆菌，其中乙酰羟酸还原异构酶和二羟酸脱水酶活性被增强。
4.权利要求1-3任一项的重组大肠杆菌，其中所述酶的活性增强是通过将所述酶的基因编码序列置于强启动子的控制之下和/或增加所述酶编码基因的一或多个拷贝。
5.权利要求4的重组大肠杆菌，其中所述酶编码基因的一或多个拷贝和任选存在的启动子核苷酸序列整合入所述重组大肠杆菌的基因组中，或者将包含所述酶编码基因的质粒导入所述重组大肠杆菌中。
6.权利要求4的重组大肠杆菌，其中所述强启动子选自SEQID NO:1、2、3、4或5任一所示的启动子。
7.权利要求4的重组大肠杆菌，其包含: (a)活性增强的乙酰羟酸还原异构酶； (b)活性增强的二羟酸脱水酶； (C)外源例如来自乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶； (d)外源例如来自枯草芽孢杆菌的`乙酰乳酸合成酶；并且 所述重组大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB基因置于强启动子例如SEQIDNO:1、2、3、4或5所示的启动子控制之下；以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因yfjB置于强启动子例如SEQ ID N0:l、2、3、4或5所示的启动子控制之下。
8.权利要求1-7任一项的重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中选自如下的一或多种内源性酶的活性被降低、例如被失活: (i)乳酸脱氢酶； (?)丙酮酸甲酸裂解酶； (iii)富马酸还原酶； (iv)磷酸乙酰转移酶； (V)乙酸激酶； (vi)乙醇脱氢酶； (vii)丙酸激酶； (viii)甲酸乙酰转移酶；和 (ix)甲基乙二醛合酶。
9.权利要求8的重组大肠杆菌，其包含: (a)大肠杆菌的乙酰羟酸还原异构酶编码基因ilvC，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA位点并且置于SEQ ID NO:3所示的启动子的控制下； (b)大肠杆菌的二羟酸脱水酶编码基因ilvD，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ ID NO:1所示的启动子的控制下；(C)乳酸乳球菌的2-酮酸脱羧酶编码基因kivD，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因PflB位点并且置于SEQ ID NO:1所示的启动子控制之下； (d)乳酸乳球菌的醇脱氢酶编码基因adhA，其被整合到所述重组大肠杆菌染色体的富马酸还原酶编码基因frd位点并且置于SEQ ID NO:75所示的启动子控制之下； (e)枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶编码基因alsS，其被分别整合到所述重组大肠杆菌染色体的丙酸激酶编码基因tdcD位点和乳酸脱氢酶编码基因IdhA位点，并且分别置于SEQ ID NO:1和5所示的启动子控制之下；并且 所述重组大肠杆菌的吡啶核苷酸转氢酶编码基因PntAB基因的原始启动子被替换为SEQ ID NO:1、3、4或5所示的启动子；以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶编码基因yf jB的原始启动子被替换为SEQ ID NO:2、3或4所示的启动子；以及 所述重组大肠杆菌的甲基乙二醛合酶编码基因mgsA、丙酮酸甲酸裂解酶编码基因pflB、富马酸还原酶编码基因frd、丙酸激酶编码基因tdcD、甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE、乳酸脱氢酶编码基因ldhA、磷酸乙酰转移酶编码基因pta、乙酸激酶编码基因ackA和乙醇脱氢酶编码基因adhE被敲除。
10.权利要求1-9任一项所述的重组大肠杆菌在生产异丁醇中的应用。
11.一种生产异丁醇的方法，包括: (a)发酵培养权利要求1-9任一项的重组大肠杆菌； (b)分离并收获异丁醇。
12.权利要求11的方法，其中 -发酵温度为25°C -39°C ； -发酵体系的PH值为6.0-8.0 ； -发酵时间为24小时-144小时； -细菌液接种培养基的发酵接种量体积百分比为0.01% -10%，例如0.01%、0.3%或10% ； 发酵培养基是由以下成分组成的水溶液:葡萄糖、KH2PO4, K2HPO4, (NH4) 2HP04、MgSO4 ? 7H20 和 CaCl2 ? 2H20 ；FeCl3 ? 6H20、CoCl2 ? 6H20、CuCl2 ? 2H20, ZnCl2、Na2MoO4 ? 2H20和 MnCl2 ? 4H20。 其中 葡萄糖为 50g/L-150g/L ；
KH2PO4 为 0.5g/L-5g/L ；
K2HPO4 为 0.5g/L-10g/L ；
(NH4)2HPO4 为 lg/L-lOg/L ；
MgSO4 ? 7H20 为 0.lg/L-5g/L ；
CaCl2 ? 2H20 为 0.lg/L-5g/L ；
FeCl3 ? 6H20 为 0.2 ii g/L-5 u g/L ；
CoCl2 ? 6H20 为 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
CuCl2 ? 2H20 为 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
ZnCl2 为 0.05 ii g/L-5 u g/L ；
Na2MoO4 ? 2H20 为 0.05 y g/L-5 u g/L ;和MnCl2.4H20 为 0.05 μ g/L-5 μ g/L。
13.权利要求11或12的方法，其中所述发酵为好氧发酵或厌氧发酵。
14.权利要求13的方法，其中好氧发酵的通气量为0.1-3.0L/min.L。
【文档编号】C12P7/04GK103667163SQ201210322624
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月4日 优先权日:2012年9月4日
【发明者】张学礼, 石爱琴, 朱欣娜, 马延和 申请人:天津工业生物技术研究所