一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法
【专利摘要】本发明公开了一株新的产丁醇的贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌IT66（ClostridiumbeijerinckiiIT66），保藏编号为CCTCCMNO：2011404。本发明还公开了上述贝氏梭菌在发酵生产丁醇中的应用。本产品采用恒化器连续培养、等离子诱变贝氏梭菌IB4，然后经刃冬青平板筛选出对抑制物耐受、还原力强的菌株，该菌株高耐受酸解副产物、高丁醇比、高溶剂产量；未脱毒的玉米芯酸解糖液为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了11.3g/L和9.1g/L，分别比同等条件培养的出发菌株提高了2.3倍和2.4倍，丁醇比高达80%，糖转化率为0.32，具有重大的社会意义和经济价值。
【专利说明】一株新的产丁醇菌株及其生产丁醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一株新的产丁醇的菌株及其生产丁醇的方法。
【背景技术】
[0002]随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇又受到了广泛的重视，已经成为生物能源的研究热点之一。作为新一代的液体能源，丁醇正在被越来越多的国家重视，其具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。
[0003]丙酮丁醇梭菌和贝氏梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物质或糖蜜等原料，且丁醇生产菌株对纤维水解液中的葡萄糖和木糖都有较高的利用效率。以纤维素原料生产丁醇具有优势，但纤维素原料处理过程中会产生一定量的酸类、醛类、木质素衍生物等副产物。水解液中含有乙酸、甲酸、醛类物质(糠醛和HMF)、酚类物质(阿魏酸、香豆酸、丁香醛、香草醛)等，这些物质通过破坏H+离子梯度、抑制发酵过程中酶的活性、破坏细胞膜的稳定性、改变渗透性等方式抑制丁醇发酵的正常进行。
[0004]近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、纤维原料糖液的制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。
[0005]Mermelstein 等(Biotechnology and Bioengineering.1993, 42: 1053 ~1060)利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株Clostridiumnacetobutylicum ATCC 824 提高了 37%。 Nasib Qureshi 等(Biomass and Bioenergy.2008，32: 176-183)利用贝氏梭菌P260，在小麦秸杆中加入纤维素酶、木聚糖酶等进行同步糖化发酵，经过533小时的连续发酵,其溶剂的产率为0.41。Annous等(Appl.Environ.Microbiol.1991，57: 2544-2548)利用化学诱变，得到了超级菌株BA101，单批发酵总溶剂最高可达 25 g/L 以上；Tha`ddeus Ezeji 等(Bioresource Technology.2008, 99:5915-5922)利用突变株BA101，以XAD-4 resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30 g/L，但其不能利用未脱毒的酸解和酶解糖液发酵产丁醇。木质纤维原料经稀酸处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；Guo等(J Ind Microbiol Biotechnol, 2012, 99 (3)，401-407.)利用离子束诱变，得到了一株能利用未脱毒玉米芯酸解糖液的丁醇生产菌株Clostridium beijerinckii IB4 (本专利的出发菌株),利用毒素总酹约为1.4g/L的水解液得到产丁醇和总溶剂分别为6.8g/L和9.5g/L。。
[0006]可见，木质纤维原料中的毒素抑制物严重抑制产丁醇梭菌的发酵性能；而菌种改良是提高菌株对抑制物的耐受性、发酵经济性的关键手段之一。
【发明内容】
[0007]本发明的第一目的是提供一株新的产丁醇的菌株。[0008]本发明的第二个目的是提供一种上述菌株生产丁醇的方法。
[0009]一、为实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下:
一株新的产丁醇的菌株，其分类命名为贝氏梭菌IT66 {Clostridium beijerinckiiIT66)，已于2011年11月21日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC MNO:2011404。[0010]上述贝氏梭菌IT66的获取方法，是以贝氏梭菌IB4为出发菌株经恒化器连续培养装置，等离子诱变，再利用含有酚类等抑制物的刃天青平板筛选得到对抑制物耐受性高、还原力强的菌株，最后以未脱毒的玉米芯酸解糖液(本发明人团队文章发表，J Ind MicrobiolBiotechnol, 2012，99 (3)，401-407.)为底物，经厌氧发酵筛选获得高耐受纤维酸解副产物、高产溶剂的贝氏梭菌目标菌株。
[0011]具体地说，所述贝氏梭菌IT66的获取方法包括如下步骤:
a)连续培养驯化诱变:将贝氏梭菌原始菌株IB4活化培养，33~37°C培养，在25mL的厌氧瓶装液量为10~15mL，培养时间12~18 h，取对数生长期的菌液，接入含有新鲜培养基的自制连续培养装置中连续培养，接种量为5%~15% (v/v)0以纤维酸解副产物为限制因子加TPC培养450~600 h，初步筛选到耐纤维酸解副产物的贝氏梭菌菌株；
b)等离子体诱变:将恒化器连续培养装置(本发明人团队在先专利申请，专利申请
【发明者】姜岷, 贺爱永, 尹春燕, 孔祥平, 陈佳楠, 马江锋, 韦萍 申请人:南京工业大学