正丁醇的生产方法

专利名称：正丁醇的生产方法
技术领域：
本发明涉及通过用于纤维素材料向期望的终产物转化的合并的生物处理方法来 生产四碳醇类，特别是正丁醇的方法。
背景技术：
生物燃料通过提供替代燃料对确保美国和全世界的能量基础架构安全是重要的， 这不仅限制了对化石燃料的依赖性，还将降低所产生的和释放到大气中的有害的碳排放 物。针对生物燃料的实现的当前的工作以乙醇生产和它的使用为中心。除了乙醇之外，许多厌氧微生物产生其他高能化合物，包括丁醇、长链醇类和酮， 它们可以用作燃料或作为燃料的制造的底物。丁醇特别地提供了作为运输燃料的许多优 点。丁醇是四碳醇类，一种与大多数溶剂(醇、醚、醛、酮和烃类)可混溶的透明中性液体， 并且微溶于水(与完全可混溶的乙醇相比，水溶解度6.3%)。它具有可与汽油相比的辛烷 值，使得它成为用于任何为燃烧汽油制造的内燃机的有价值的燃料。燃料试验还证明了，丁 醇在存在水的情况下不是相分离的，对于弹性体膨胀没有负面影响。因为它是较少吸湿性 的，丁醇可以通过现有的常见的运载管线运送，并保存在湿润的条件下，不同于乙醇。与乙 醇相比，丁醇不仅具有更接近汽油的更高能量含量，从而它在燃料经济性上有更少的折中， 而且它还由于它的低蒸汽压可以容易地添加到常规的汽油中。丁醇生物合成可以通过丙酮、丁醇和乙醇发酵途径(“ABE途径”)来实现。利用细 菌的溶剂生产性物种丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的这种丁醇发酵生产 途径的产物是六份丁醇、三份丙酮和一份乙醇。令人遗憾地，丁醇的生产是自我限制性的， 因为这种发酵的产物在约13g 丁醇/L的浓度下对细胞是有毒的，其抑制细胞的生长导致发 酵过程的终止。与生产生物燃料的当前方法相关的另一个难题是粮食作物例如玉米和糖类作为 起始材料的运用。例如，利用谷粒例如玉米用于乙醇的生产直接地与食品供应竞争，因而具 有抬高原材料的成本的非期望的结果。对使用粮食作物的替代是生物质，特别是木质纤维的生物质。木质纤维的生物质 是更为丰富的，与食料相比是便宜得多的。令人遗憾地，由于木质纤维素的复杂分子结构， 使用当前技术从纤维素和木质纤维素生产生物燃料是非常难的。当前的方法需要利用酸处 理并中和、随后用外源产生的酶处理来将纤维素水解为糖类的多个步骤。纤维素是非常稳定的聚合物，在25°C下β-糖苷键裂解的半衰期约5-8百万年 (ffolfenden and Snider，2001)。酶驱动的纤维素生物降解过程是快得多的，对于淀积 物中的碳返回大气是关键的(Zhang et al.，2006)。酶学纤维素水解的广泛接受的机制 涉及三种不同纤维素酶的协同作用葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶或纤维二糖水解酶、和
5β-葡糖苷酶(Lynd et al.，2002)。葡聚糖内切酶(1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶； EC 3.2.1.4)随机地裂解分子内的β-1，4-糖苷键。葡聚糖外切酶(l，4-i3-D-葡聚糖纤 维二糖水解酶；EC 3.2. 1.91)裂解纤维素分子的可接近的末端来释放纤维二糖。β-葡 萄糖苷酶(β _萄糖苷葡糖水解酶；EC 3. 2. 1. 21)水解可溶的纤维二糖和其他聚合度达到 6的纤维糊精来产生水相中的葡萄糖。随着底物聚合化的程度提高，水解速率显著地降低 (Zhang and Lynd, 2004) 0当前，大多数商售的纤维素酶是利用木霉属(Trichderma)和曲 菌属(Aspergillus)物种生产的。当纤维素酶被用于将预处理的纤维素材料水解成可以 大规模地发酵成生物燃料的糖类时，纤维素市场预计将显著地扩大。编码纤维素酶的基因 已经从各种细菌、丝状真菌和植物克隆(Lynd et al.，2002)。几个小组表达了多种纤维 素酶以试图再创造酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的完全的纤维素分解的发酵 系统(van Zyl et al.，2007))。由于酿酒酵母缺乏水解纤维素的酶，三种类型的纤维素 酶被共同展示在酵母细胞壁的表面上。共同展示来自里氏木霉(T.reesei)的葡聚糖内切 酶II和纤维二糖水解酶II，以及棘孢曲霉(A. aculeatus) β -葡糖苷酶I的酵母菌株能够 直接从非晶态纤维素生产乙醇，产量大约2. 9克每升(Fujita et al.，2004)。其他人在酿 酒酵母中组合地表达了两种纤维素酶编码基因，里氏木霉的葡聚糖内切酶和扣囊复膜酵母 (Saccharomycopsis fibuligera)的 β -葡糖苷酶(Den Haan et al. ,2007) 获得的最高 的乙醇滴度为 1克每升。因此，需要生产丁醇的新的方法，其消除了与使用粮食作物作为起始材料相关的 难题并提高了生产的效率。发明概述提供了使用重组微生物生产丁醇的方法，所述重组微生物具有用于纤维素材料到 正丁醇的直接转化的工程化的途径。这些方法将水解和发酵整合到单个微生物或微生物的 稳定的混合培养物中，以提高生产的效率。更具体地，本发明的实施方式整合了两个或更多 个以下的处理步骤1)从木质纤维素除去木质素以释放纤维素和半纤维素；2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖；3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的混合的糖类水解产物的发酵；4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇生产；和5)关闭乙醇和其他竞争产物途径。在另一个方面，提供了重组微生物宿主细胞，优选的酿酒酵母，其包含编码多肽的 至少一种DNA分子，所述多肽催化选自以下构成的组的底物到产物的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇其中至少一种DNA分子对于所述微生物宿主细胞是异源的，和其中所述微生物宿主细胞产生丁醇。在又一个方面，提供了重组微生物宿主细胞，优选的酿酒酵母，其能够将纤维素转 化成丁醇，包含(1)编码至少一种纤维素酶的DNA分子；和(2)编码多肽的至少一种DNA 分子，所述多肽催化选自以下构成的组的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA (c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇。在优选的实施方式中，所述纤维素酶选自以下构成的组葡聚糖内切酶II、纤维 二糖水解酶II和β -葡糖苷酶I。在另一个方面，提供了重组微生物宿主细胞，优选的酿酒酵母，其能够将木质纤维 素转化成丁醇，包含(1)编码至少一种漆酶多肽的DNA分子；(2)编码至少一种纤维素酶 多肽的DNA分子；和(3)编码多肽的至少一种DNA分子，所述多肽催化选自以下构成的组的 转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA
(d) (S) -3-羟基丁酰-CoA 到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇。在优选的实施方式中，漆酶基因是POXAlb。在另一个方面，提供了重组微生物宿主细胞，优选的酿酒酵母，其能够将木质纤维 素转化成丁醇，包含(1)编码至少一种涉及戊糖、优选的木糖的发酵的多肽的DNA分子； (2)编码至少一种纤维素酶多肽的DNA分子；和(3)编码多肽的至少一种DNA分子，所述多 肽催化选自以下构成的组的转化(a)丙酮酸到乙酰-CoA(b)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(c)乙酰乙酰-CoA到⑶-3-羟基丁酰-CoA(d)⑶-3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(e)巴豆酰-CoA 到丁酰-CoA(f) 丁酰-CoA 到丁醛(g) 丁醛到丁醇。期待的是在合适的时候，本发明的任何实施方式可以与本发明的一种或更多种其 他实施方式组合，虽然所述实施方式是在本发明的不同的方面中描述的。附图的简要描述和序列描述
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根据以下的详细说明、附图和构成本申请的一部分的附随的序列描述可以更完整 地理解本发明。附

图1显示了从乙酰-CoA开始、标明了相关的酶活性的丙酮丁醇梭菌丁醇生物合 成途径。附图2描绘了 AF104DNA，标明了涉及丁醇生物合成的丙酮丁醇梭菌基因和独特的 限制性位点。附图3显示了质粒pUG27的图，其带有l0XP-his5-l0XP破坏模块，和利用 l0XP-his5-l0XP破坏盒的基因破坏。对于基因破坏实验，合成了两种寡核苷酸(表2)，它们 的3'末端与质粒pUG27上的loxP-his5-loxP模块的左侧和右侧的序列互补，它们的5' 末端与要破坏的基因例如ADHl的5'和3'侧翼区域互补。质粒pUG27用作PCR模板来产
生破坏盒。附图4显示了通过Cre重组酶的表达的his5标记拯救。具有相关基因型的单倍 体his+酵母菌株用质粒PSH47转化。转化体在葡萄糖平板上生长，然后转入半乳糖培养基 来诱导Cre重组酶的表达。在两个IoxP位点之间Cre诱导的重组过程除去了标记基因。附图5显示了利用气相色谱法用于丁醇浓度定量的校准曲线。分别用IOOOppm到 0. 8ppm和IOOppm到0. 8ppm的范围的乙醇和丁醇开发了线性校准曲线。附图6显示了作为时间函数，分别从PASC(上部)和处理的纸(下部)作为碳的 来源的乙醇生产。酵母菌株是具有三种细胞壁附着的纤维素酶的Yl. C8 ；用该菌株进行三 种独立的发酵。Yl. B9、Y1. Cl和Yl. C2含有3种分泌的纤维素酶；Yl. C9是含有无纤维素酶 的相同载体的对照菌株。附图7显示了利用GasPak EX厌氧生成系统在厌氧条件下在96小时期间来自葡 萄糖的丁醇发酵。所有酵母菌株是AFY 10衍生物。阴性对照(没有丁醇基因)是adhl(3a) 载体 112、adhl (3a)载体 195 和 adhl (3a)载体 181。附图8是表达丁醇途径基因的酵母细胞的培养基的气相色谱(GC)。正丙醇峰波被 用于校准GC。附图9显示了在336小时的发酵后来自纤维素(40% PASC)的丁醇生产。酵母菌 株是AFYlO衍生物，其中Yl. F9含有分泌的纤维素酶CBHI和BGLI，以及丁醇基因；Yl. G4含 有分泌的纤维素酶BGLI和EGII和丁醇基因；Yl. Cl仅含有分泌的纤维素酶CBHII、BGLI和 EGII ；Yl. C8仅含有细胞壁附着的纤维素酶CBHII、BGLI和EGII ；以及Yl. C9是含有无纤维 素酶的相同载体的对照菌株。附图10显示了硫解酶(THL)分光光度分析。利用乙酰乙酰-CoA和CoA作为底物 测定活性。乙酰乙酰-CoA浓度的降低在303nm处测量。菱形表示来自用pAF104/112质粒 DNA转化的菌株的细胞提取物。三角形表示没有细胞提取物的对照实验。正方形表示来自 用载体DNA转化的细胞的酵母提取物。附图11显示了 HBD分光光度分析。通过在345nm监视由来自乙酰乙酰-CoA 的羟基丁酰-CoA形成所产生的NADH浓度降低来测量活性。正方形表示来自用 PAF104/112质粒DNA转化的菌株的细胞提取物。菱形表示来自用载体DNA转化的细胞的酵 母提取物。附图12显示了对浓度达2%的丁醇有抗性的工业酵母菌株(AFY16)，而实验室菌
8株(AFY1、AFY3)的生长在的丁醇浓度下是严重损害的。发明的详细说明提供了重组微生物，其具有用于纤维素材料向丁醇的直接转化的工程化的途径。 还提供了将水解和发酵整合到单个微生物或微生物的稳定的混合培养物中以提高生产的 效率的方法。更具体地，本发明的实施方式整合了两个或更多个以下的处理步骤1)从木质纤维素除去木质素以释放纤维素和半纤维素；2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖；3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的混合的糖类水解产物的发酵；4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇生产；和5)关闭乙醇、丙酮和其他竞争产物途径。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通 技术人员通常所理解的相同含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。以下定义和缩写被 用于权利要求和说明书的解释。术语“丁醇生物合成途径”是指生产丁醇的酶途径。术语“丙酮酸_铁氧化还原蛋白氧化还原酶”或“丙酮酸甲酸_裂解酶”是用于催 化丙酮酸向乙酰-CoA的转化的酶。丙酮酸-铁氧化还原蛋白氧化还原酶和丙酮酸甲酸-裂 解酶是已知的，EC编号分别是 1. 2. 7. 1 和 2. 3. 1. 54 (Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press, San Diego)。酶可从多种来源获得，包括但不限于GenBank (GenBank Nos. CAC2229 和 CAC0980)。术语“乙酰-CoA C-转乙酰酶”和“硫解酶”在此可互换地使用，是指催化乙酰-CoA 到乙酰乙酰-CoA的转化的酶。硫解酶称为EC编号2. 3. 1. 9。该酶可从多种来源获得，包括 但不限于 GenBank (GenBank Nos. CAC2873 或 CAP0078)。术语“3-羟基丁酰-CoA脱氢酶”是指催化乙酰乙酰-CoA向(S) _3_羟基丁酰-CoA 的转化的酶。3-羟基丁酰-CoA脱氢酶称为EC编号1. 1. 1. 157。该酶可从多种来源获得， 包括但不限于 GenBank (GenBank Nos. CAC2708 或 CAC2009)。术语“3-羟基丁酰-CoA脱水酶”或“巴豆酸酶”在此可互换地使用，是指催化 (S) -3-羟基丁酰-CoA向巴豆酰-CoA的转化的酶。3-羟基丁酰-CoA脱水酶称为EC编号 4. 2. 1. 55。该酶可从多种来源获得，包括但不限于GenBank (GenBank Nos. CAC2712、CAC2012 或 CAC2016)。术语“丁酰-CoA脱氢酶”是指催化从巴豆酰-CoA向丁酰-CoA的转化的 酶。丁酰-CoA脱氢酶称为EC编号1.3.99. 2。该酶可从多种来源获得，包括但不限于 GenBank (GenBank No.CAC2711)。术语“丁醛脱氢酶”、“醛_醇脱氢酶”、“醇脱氢酶”和“乙醛脱氢酶”在此可互 换地使用，是指催化从丁酰-CoA到丁醛的转化的酶。优选的丁醛脱氢酶称为EC编号 1. 2. 1. 57。其他EC编号包括1. 1. 1. 1和1. 2. 1. 10。该酶可从多种来源获得，包括但不限于 GenBank(GenBank Nos. CAPO162 或 CAP0035)。术语“丁醇脱氢酶”是指催化从丁醛向丁醇的转化的酶。这个酶称为EC编号 1. 1. 1。该酶可从多种来源获得，包括但不限于GenBank(GenBank Nos. 04 0162、或0々 0035、 或 CAP0059、或 CAC3298、或 CAC3299、或 CAC3392)。
术语“碳底物”是指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源，特别是选自由单糖、 寡聚糖、多糖或其混合物构成的组的碳源。术语“基因”是指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，任选地包括在编码序列之 前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然的基因”是指在宿主生 物体中天然存在的、具有它自己的调节序列的基因。“嵌合的基因”是指任何不是天然的基 因的基因，包含在宿主生物体中不在一起存在的调节和编码序列。因而，嵌合基因可以包含 来自不同来源的调节序列和编码序列，或来自相同来源但以不同于该来源中存在的方式排 列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体的基因组中处在其天然位置的天然 基因。“外源基因”或“异源基因”是指在宿主生物体中通常不存在的、但是通过基因转移被 导入宿主生物体中的基因。外源基因可以包含插入到非天然生物体中的天然基因或嵌合基 因。还理解的是，外源基因包括其编码序列被修饰以增强它在特定宿主中的表达的基因，例 如，密码子可以被替换以反映宿主的优选的密码子利用率。“转基因”是已经通过转化过程 导入基因组的基因。在此使用的，术语“编码序列，，是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“适合的调 节序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、之内、或下游(3'非编码序列)的核 苷酸序列，其影响相连的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列可以包括 启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和 茎-环结构。术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般地， 编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体地来自天然的基因，或由来自自然中存在 的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域技术人员理解的是，不 同的启动子可以指导在不同组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环 境或生理条件的基因表达。使得基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常 称为“组成型启动子”。进一步公认的是，大多数情况下，调节序列的确切边界没有被完全地 划定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。术语“可操作连接的”是指核酸序列在单个核酸片段上的相连，从而一个核酸序列 的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处在 启动子的转录控制之下)，启动子是与编码序列可操作连接的。编码序列可以以正义或反义 的取向与调节序列可操作连接。如在此使用的，术语“表达”是指来自本发明的核酸片段的正义(mRNA)或反义RNA 的转录和稳定的积累。表达也可以指mRNA翻译成多肽。如在此使用的，术语“转化”是指外源核酸插入到细胞中，不管用于插入的方法，例 如，脂转染、转导、感染或电穿孔。外源核酸可以作为未整合的载体，例如质粒来维持，或作 为选择，可以整合到细胞的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因 的”或“重组的”或“转化的”生物体。术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带基因的染色体外元件，通常处于环形 双链DNA片段的形式，所述基因不是细胞的中心新陈代谢的部分。这样的元件可以是自主 复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环形的、单链或双链的DNA或 RNA，来自任何来源，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的结构，所述结构能够将启动子片段和选定基因产物的DNA序列与合适的3'非翻译序列一起导入细胞。“转化盒” 是指特定的载体或线性DNA片段，其含有外源基因并具有除了外源基因之外的元件，所述 除了外源基因之外的元件促进特定宿主细胞的转化。“表达盒”是指含有外源基因并具有除 了外源基因之外的元件的特定载体，所述除了外源基因之外的元件容许该基因在外源宿主 中增强的表达。在此使用的标准分子生物学技术是本领域公知的，由Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press =Cold Spring Harbor，NY所描述。在此使用的用于酿酒酵母的操作的技 术是本领域公知的，在 Sherman F,Fink GR,Hicks JB. 1986. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor, NY 禾口 Guthrie C, Fink GR, (Eds. ). 2002. Methods in Enzymology, Volume 351, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Part C), Elsevier Academic Press, San Diego, Calif.中 描述了 °合并的生物处理方法合并的生物处理(CBP)是一种用于纤维素生物质的处理策略，其涉及将两种或更 多种以下步骤合并成单个处理步骤1)从木质纤维素除去木质素以释放纤维素和半纤维素；2)纤维素和半纤维素的解聚成为可溶性糖；3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的混合的糖类水解产物的发酵；4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇生产；禾口5)关闭乙醇、丙酮和其他竞争产物途径。1)从木质纤维素除去木质素漆酶是催化多种酚类化合物以及二胺和芳香族胺的氧化的酶。在真菌中，漆酶涉 及木质纤维材料的降解。木质素降解酶公知难以在非真菌系统中表达。然而，本发明的某 些实施方式使用了漆酶基因来分解木质素和释放纤维素或半纤维素。适合于在酵母中表达 来分解木质素的其他酶包括木质素过氧化物和锰依赖性过氧化物酶。2)纤维素解聚成为可溶性糖纤维素的酶促降解涉及至少三种不同类型的纤维素酶的协同作用。这些酶根据 国际生物化学和分子生物学联合会的命名委员会给出了酶委员会(Enzyme Commission, EC)名称(Eur. J. Biochem. 264 :607609 和 610 650，1999)。内-β _(1，4)_ 葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)沿着纤维素链的长度上随机地裂解纤维素链，因而产生新的链末端。外_(1， 4)_葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)是进行性酶，从纤维素链的游离末端裂解纤维二糖单元 (3-(1，4)-葡萄糖二聚体)。最后，β-D-葡糖苷酶(纤维二糖酶EC 3.2. 1.21)将纤维二 糖水解成葡萄糖。这些一般活性的所有三种是聚合物例如纤维素向亚基例如单糖、葡萄糖 的有效和完全的水解所需的。当然，酵母是天然的糖类发酵器，将糖类转化成乙醇。通过在酿酒酵母的细胞表 面上共同展示来自丝状真菌里氏木霉的纤维素分解酶，可以制得纤维素降解酵母菌株。然 后，这些工程化的酵母直接从纯纤维素生产乙醇(Fujita et al,2004 ；Den Haan et al, 2007)。
3)含有六碳(己糖)和五碳(戊糖)糖类的混合的糖类水解产物的发酵最有效的乙醇生产酵母之一酿酒酵母具有几项优点，例如，来自己糖的高乙醇生 产，对乙醇和木质纤维素生物质的酸解产物中的其他抑制性化合物的高耐受性。然而，由于 这种酵母的标准菌株不能利用戊糖，例如木糖，和纤维寡糖(二到六个葡萄糖单元)，来自 木质纤维素水解产物的发酵将不是完全有效率的。根据本发明的某些实施方式，提供了重 组酵母菌株，通过整合用于来自树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶和木糖醇 脱氢酶的细胞间表达的基因，和用于展示来自棘孢曲霉(A. acleatus)的β-葡糖苷酶的基 因，其可以发酵木糖和纤维寡糖。4)通过产溶剂(solventogenesis)途径的丁醇生产丙酮、丁醇和其他溶剂可以通过几种梭菌属物种来生产达到商业上重要的水平。 在第一次世界大战期间由Chaim Weizmann使用在1912到1914年间首次鉴定的丙酮丁醇 梭菌的分离物来开发工业的基于淀粉的丙酮、丁醇和乙醇(ABE)发酵方法，来生产用于炸 药生产的丙酮。在1920年代和1930年代，对丁醇的提高的需求引起了大的发酵工厂和更 有效的基于糖蜜的方法的建立。然而，在1950年代期间更为节省成本的石油化工方法的建 立导致在少数国家之外的所有国家中ABE方法的放弃。商品性生产设备仍然在俄国运行直 到1980年代。典型株丙酮丁醇梭菌ATCC 824在1924年分离自康涅狄格的园土，是被最好 地研究的产溶剂梭菌之一。已知该菌株利用广泛的单糖、二糖、淀粉和其他底物，例如乳清 和木聚糖，但不利用结晶纤维素。来自附图1中的途径的基因被合成并转化到被选择用于 最大丁醇生产的酿酒酵母菌株中。5)关闭乙醇和其他竞争产物途径酵母是将糖类转化成乙醇的天然的糖类发酵细胞系。本领域已知几种方法可以用 于关闭乙醇和其他竞争途径。例如，定点诱变(SDM)可用于通过特异性、选择性突变使得乙 醇途径内基因无功能。基因还可以通过同源重组插入酵母基因组中来敲除乙醇途径内的基 因。用于丁醇生产的微生物宿主用于丁醇生产的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。选择用于丁 醇生产的微生物宿主优选的是对丁醇耐受的，并且应能够将碳水化物转化成丁醇。适合的 微生物宿主包括具有一种或更多种、优选的全部以下特征的宿主对丁醇的内在的耐受性、 高葡萄糖利用速率、基因操作的遗传工具的可用性和产生稳定的染色体改变的能力。遗传修饰宿主的能力对于重组微生物的产生是有用的。基因转移技术的方式可以 是本领域已知的任何方法，例如，通过电穿孔、接合、转导或自然转化。大量的宿主接合质粒 和药物抗性标记物是本领域技术人员可获得的和已知的。根据宿主中使用的标记物的性 质，使克隆载体适应于宿主生物体。微生物宿主还可以被操作，以通过删除各种基团来灭活碳流动的竞争性途径。这 一般需要指导灭活的转座子或染色体整合载体的可获得性。另外，生产宿主应当适合于化 学诱变，从而可以获得改善内在的丁醇耐受性的突变。用于丁醇生产的适合的微生物宿主包括，但不限于，梭菌属(Clostridium)、发 酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红 球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽胞杆菌属(Bacillus)、乳杆菌
12属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克氏杆菌 属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌 属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵 母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)和酵母属(Saccharomyces)的成员。优选的 宿主包括大肠杆菌(Escherichia coli)、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地 Hi包If lif (Bacillus licheniformis) > ^Sj^^^ifelf lif (Paenibacillus macerans) > 红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植 物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、享鸟鸡肠球 菌(Enterococcus gallinarium)、獎肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽胞杆菌 (Bacillus subtilis)、卡尔斯白酵母(Saccharomyces carlsburgenesis)禾口酉良酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)优选的微生物宿主是酵母属物种，例如，卡尔斯伯酵母和酿 酒酵母。特别优选的微生物宿主是酿酒酵母。生产宿主的构建含有编码纤维素底物向丁醇的转化的酶途径的基因的重组生物体使用本领域公 知的技术构建。编码本发明的丁醇生物合成途径之一的酶，例如乙酰-CoA C-转乙酰酶(硫 解酶)、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA脱氢酶、 丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的基因可以分离自各种来源，如上所述的。从细菌基因组获得期望的基因的方法是分子生物学领域常见的和公知的。例如， 如果基因的序列是已知的，适合的基因组文库可以通过限制性内切酶消化来创建，可以用 与期望的基因序列互补的探针来筛选。一旦分离了序列，DNA可以利用标准的引物指导的 扩增方法，例如聚合酶链式反应(美国专利NO. 4，683，202)扩增，来获得适合于利用合适的 载体转化的DNA的数量。一旦鉴定和分离了相关的途径基因，它们可以通过本领域公知的方式转化到适合 的表达宿主中。对于多种宿主细胞的转化有用的载体或盒是常见的并可从一些公司，例如 EPICENTRE (Madison, Wis. )> Invitrogen Corp. (Carlsbad, Calif. ) >Stratagene (La Jolla, Calif.)和 New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)商业上获得。一般地，载 体或盒含有指导相关基因的转录和翻译的序列、可选择标记物、以及容许自主复制或染色 体整合的序列。适合的载体包含基因5'的控制转录起始的区域，和DNA片段的3'的控制 转录终止的区域。两个控制区域都可以来自与转化的宿主细胞同源的基因，然而要理解的 是，这样的控制区域也可以来源于对于被选作生产宿主的特定物种不是天然的基因。对于在期望的宿主细胞中驱动相关途径编码区域的表达有用的起始控制区域或 启动子是很多的，是本领域技术人员熟悉的。实际上能够驱动这些遗传元件的任何启动 子都适合于本发明。对于在酵母属中表达有用的启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、 GALlO、ADHl、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRPl、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUPl、FBA、GPD 和 GPM。终止控制区域也可以来自于对优选的宿主天然的各种基因。任选地，终止位点可 以是不必要的；然而，如果包括了是最优选的。引用的所有序列引证、参考文献、专利、专利申请或其他文件通过引用合并在此。
13实施例在以下实施例中进一步定义本发明。要理解的是，尽管显示了本发明的优选的实 施方式，这些实施例仅通过例示的方式给出。根据以上的讨论和这些实施例，本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征，并且可在不背离本发明的精神和范围的情况下，进行本发 明的各种变化和修改来使其适应各种用途和状况。实施例1编码纤维素酶基因的表达质粒的构建编码用于在酵母细胞壁表面上共同展示的纤维素酶的表达构建体通过将纤维素 酶基因与编码来自米根霉(Rhizopus oryzae)的葡糖淀粉酶的分泌信号序列的DNA融合来 构建。分泌信号对纤维素酶向细胞壁的递送负责。编码酿酒酵母α-凝集素的C-末端一 半的基因连接到纤维素酶的3'-末端。重组蛋白质的α-凝集素部分容许对细胞壁的附 着。此外，所有三种纤维素酶还以不附着于细胞壁的分泌的可溶形式表达。分泌形式的表 达构建体缺乏α-凝集素部分。纤维素酶基因的DNA序列是已知的，使用以下的基因里氏木霉葡聚糖内切酶 II (GenBank登记号码DQ178347)；里氏木霉纤维二糖水解酶II (GenBank登记号码Μ55080) 和棘孢曲霉(A. aculeatus) β -葡糖苷酶I (GenBank登记号码D64088)。纤维素酶DNA构建 体由BlueHeron Bi0使用他们的GeneMaker 合成平台来商业上合成。独特的限制性内 切酶位点添加到序列中来便于向表达载体的亚克隆。通过不改变氨基酸序列的核苷酸取代 从编码序列中除去几个限制性位点。纤维素酶DNA构建体由Blue Heron Bio商业上合成，克隆到Blue Heron pUC119 载体中。载体插入物的序列显示如下pUC119-AF101 (纤维二糖水解酶 II(CBHII)构建体)AAGCTTGCATGCAGTTTATCATT ATCAATACTCGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAAATT AGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTG TCTGGGTGAACAGTTTATTCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCCCGCTTTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAA AGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAG AACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGATGCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACAC AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAA AAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTAGG TATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTT AAAACACCAGAACTTAGTTTCGACGGATCTGCAGGTCGACATGCAACTGTTCAATTTGCCATTGAAAGTTTCATTCT TTCTCGTCCTCTCTTACTTTTCTTTGCTCGTTTCTGCTGACTACAAGGACGATGACGACAAATCTAGACAGGCTTGC TCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTA CTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCATCGACGACTT CACGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGTTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCA GTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTC TGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCCGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCT CTTTTATGTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAG AATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAAT ATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAG TGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGAT GTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATG TTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCACTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATT ACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACGTCTTCT TGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAAC AGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTG GATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCA CTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCA CAAACGCAAACCCATCGTTCCTGGGATCCAGCGCCAAAAGCTCTTTTATCTCAACCACTACTACTGATTTAACAAGT ATAAACACTAGTGCGTATTCCACTGGTTCCATTTCCACAGTAGAAACAGGCAATCGAACTACATCAGAAGTGATCAG TCATGTGGTGACTACCAGCACAAAACTGTCTCCAACTGCTACTACCAGCCTGACAATTGCACAAACCAGTATCTATT CTACTGACTCAAATATCACAGTAGGAACAGATATTCACACCACATCAGAAGTGATTAGTGATGTGGAAACCATTAGC AGAGAAACAGCTTCGACCGTTGTAGCCGCTCCAACCTCAACAACTGGATGGACAGGCGCTATGAATACTTACATCCC GCAATTTACATCCTCTTCTTTCGCAACAATCAACAGCACACCAATAATCTCTTCATCAGCAGTATTTGAAACCTCAG ATGCTTCAATTGTCAATGTGCACACTGAAAATATCACGAATACTGCTGCTGTTCCATCTGAAGAGCCCACTTTTGTA AATGCCACGAGAAACTCCTTAAATTCCTTTTGCAGCAGCAAACAGCCATCCAGTCCCTCATCTTATACGTCTTCCCC ACTCGTATCGTCCCTCTCCGTAAGCAAAACATTACTAAGCACCAGTTTTACGCCTTCTGTGCCAACATCTAATACAT ATATCAAAACGGAAAATACGGGTTACTTTGAGCACACGGCTTTGACAACATCTTCAGTTGGCCTTAATTCTTTTAGT GAAACAGCACTCTCATCTCAGGGAACGAAAATTGACACCTTTTTAGTGTCATCCTTGATCGCATATCCTTCTTCTGC ATCAGGAAGCCAATTGTCCGGTATCCAACAGAATTTCACATCAACTTCTCTCATGATTTCAACCTATGAAGGTAAAG CGTCTATATTTTTCTCAGCTGAACTCGGTTCGATCATTTTTCTGCTTTTGTCGTACCTGCTATTCTAACCCGGGTAC CTCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAG ACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTT TTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGC TCGAAGGCTTTAATTTGCGGCCGAGCTCGAATTC (SEQID NO 1) D00049)
其中核苷酸
1到12是HindIII和SphI限制性位点；
13到667是GPDH启动子(GenBank登记号码DQ019861)；
668到679是PstI和SalI限制性位点；
680到754是ATG和来自米根霉葡糖淀粉酶基因的分泌信号(GenBank登记号码
755到778是FLAG标签； 779到784是XbaI限制性位点；
785到2125是来自里氏木霉的成熟的纤维二糖水解酶II(CBHII) (GenBank登记 号码M55080)，引入了以下核苷酸变化(根据M55080DNA序列编号):A75G、G225A、T237A、 C267T、T441C、G561C、T957A 和 G1345C ；
2126到2131是BamHI限制性位点；
2132到3094是具有STOP密码子的α-凝集素3'-基因部分(GenBank登记号码 ΑΑΑ34417或Μ28164)，具有引入的以下核苷酸变化(根据M28164DNA序列编号)Τ1422Α、 T1887C 和 A2265G ；3095 到 3104 是 SmaI-KpnI 限制性位点；3105 到 3356 是 CYCl 终止子(GenBank 登记号码 EF210199)；和3357 到 3368 是 SacI-EcoRI 限制性位点。pUC119-AF102 ( β -葡糖苷酶 I (BGLI)构建体)TCTAGAGATGAACTGGCGTTCTCTCCTCC TTTCTACCCCTCTCCGTGGGCCAATGGCCAGGGAGAGTGGGCGGAAGCCTACCAGCGTGCAGTGGCCATTGTATCCC AGATGACTCTGGATGAGAAGGTCAACCTGACCACCGGAACTGGATGGGAGCTGGAGAAGTGCGTCGGTCAGACTGGT GGTGTCCCAAGACTGAACATCGGTGGCATGTGTCTTCAGGACAGTCCCTTGGGTATTCGTGATAGTGACTACAATTC GGCTTTCCCTGCTGGTGTCAACGTTGCTGCGACATGGGACAAGAACCTTGCTTATCTACGTGGTCAGGCTATGGGTC AAGAGTTCAGTGACAAAGGAATTGATGTTCAATTGGGACCGGCCGCGGGTCCCCTCGGCAGGAGCCCTGATGGAGGT CGCAACTGGGAAGGTTTCTCTCCAGACCCGGCTCTTACTGGTGTGCTCTTTGCGGAGACGATTAAGGGTATTCAAGA CGCTGGTGTCGTGGCGACAGCCAAGCATTACATTCTCAATGAGCAAGAGCATTTCCGCCAGGTCGCAGAGGCTGCGG GCTACGGATTCAATATCTCCGACACGATCAGCTCTAACGTTGATGACAAGACCATTCATGAAATGTACCTCTGGCCC TTCGCGGATGCCGTTCGCGCCGGCGTTGGCGCCATCATGTGTTCCTACAACCAGATCAACAACAGCTACGGTTGCCA GAACAGTTACACTCTGAACAAACTTCTGAAGGCCGAACTCGGCTTCCAGGGCTTTGTGATGTCTGACTGGGGTGCTC ACCACAGTGGTGTTGGCTCTGCTTTGGCCGGCTTGGATATGTCAATGCCTGGCGATATCACCTTCGATTCTGCCACT AGTTTCTGGGGAACCAACCTGACCATTGCTGTGCTCAACGGAACCGTCCCGCAGTGGCGCGTTGACGACATGGCTGT CCGTATCATGGCTGCCTACTACAAGGTTGGCCGCGACCGCCTGTACCAGCCGCCTAACTTCAGCTCCTGGACTCGCG ATGAATACGGCTTCAAGTATTTCTACCCCCAGGAAGGGCCCTATGAGAAGGTCAATCACTTTGTCAATGTGCAGCGC AACCACAGCGAGGTTATTCGCAAGTTGGGAGCAGACAGTACTGTTCTACTGAAGAACAACAATGCCCTGCCGCTGAC CGGAAAGGAGCGCAAAGTTGCGATCCTGGGTGAAGATGCTGGTTCCAACTCGTACGGTGCCAATGGCTGCTCTGACC GTGGCTGTGACAACGGTACTCTTGCTATGGCTTGGGGTAGCGGCACTGCCGAATTTCCATATCTCGTGACCCCTGAG CAGGCTATTCAAGCCGAGGTGCTCAAGCATAAGGGCAGCGTCTACGCCATCACGGACAACTGGGCGCTGAGCCAGGT GGAGACCCTCGCTAAACAAGCCAGTGTCTCTCTTGTATTTGTCAACTCGGACGCGGGAGAGGGCTATATCTCCGTGG ACGGAAACGAGGGCGACCGCAACAACCTCACCCTCTGGAAGAACGGCGACAACCTCATCAAGGCTGCTGCAAACAAC TGCAACAACACCATCGTTGTCATCCACTCCGTTGGACCTGTTTTGGTTGACGAGTGGTATGACCACCCCAACGTTAC TGCCATCCTCTGGGCGGGCTTGCCTGGCCAGGAGTCTGGCAACTCCTTGGCTGACGTGCTCTACGGCCGCGTCAACC CAGGCGCCAAATCTCCATTCACCTGGGGCAAGACGAGGGAGGCGTACGGGGATTACCTTGTCCGTGAACTCAACAAC GGCAACGGAGCACCCCAAGATGATTTCTCGGAAGGTGTTTTCATTGACTACCGCGGATTCGACAAGCGCAATGAGAC CCCGATCTACGAGTTCGGACATGGTCTGAGCTACACCACTTTCAACTACTCTGGCCTTCACATCCAGGTTCTCAACG CTTCCTCCAACGCTCAAGTAGCCACTGAGACTGGCGCCGCTCCCACCTTCGGACAAGTCGGCAATGCCTCTGACTAC GTGTACCCTGAGGGATTGACCAGAATCAGCAAGTTCATCTATCCCTGGCTTAATTCCACAGACCTGAAGGCCTCATC TGGCGACCCGTACTATGGAGTCGACACCGCGGAGCACGTGCCCGAGGGTGCTACTGATGGCTCTCCGCAGCCCGTTC TGCCTGCCGGTGGTGGCTCTGGTGGTAACCCGCGCCTCTACGATGAGTTGATCCGTGTTTCGGTGACAGTCAAGAAC ACTGGTCGTGTTGCCGGTGATGCTGTGCCTCAATTGTATGTTTCCCTTGGTGGACCCAATGAGCCCAAGGTTGTGTT GCGCAAATTCGACCGCCTCACCCTCAAGCCCTCCGAGGAGACGGTGTGGACGACTACCCTGACCCGCCGCGATCTGT CTAACTGGGACGTTGCGGCTCAGGACTGGGTCATCACTTCTTACCCGAAGAAGGTCCATGTTGGTAGCTCTTCGCGT
16CAGCTGCCCCTTCACGCGGCGCTCCCGAAGGTGCAAGGATCCTAAGGTACC (SEQID NO 2)其中核苷酸1到6是XbaI限制性位点；7到2529是来自棘孢曲霉的成熟的β -葡糖苷酶I (GenBank登记号码D64088 或ΒΑΑ10968)，具有引入的以下核苷酸改变(根据D64088DNA序列编号)A398T、G905A、 G920A、Τ1049Α 和 Τ1079Α ；Α1388Τ ；C1478T ；G1886A、G1952A、Τ1973Α ；2530到2535是BamHI限制性位点；2536 到 2538 是 TAA STOP 密码子；和2539到2544是KpnI限制性位点。pUC119-AF103(葡聚糖内切酶(EGII)构建体)TCTAGACAGCAGACTGTCTGGGGCCAGT GTGGAGGTATTGGTTGGAGCGGACCTACGAATTGTGCTCCTGGCTCAGCTTGTTCGACCCTCAATCCTTATTATGCG CAATGTATTCCGGGAGCCACTACTATCACCACTTCGACCCGGCCACCATCCGGTCCAACCACCACCACCAGGGCTAC CTCAACAAGCTCATCAACTCCACCCACTAGCTCTGGGGTCCGATTTGCCGGCGTTAACATCGCGGGTTTTGACTTTG GCTGTACCACAGATGGCACTTGCGTTACCTCGAAGGTTTATCCTCCGTTGAAGAACTTCACCGGCTCAAACAACTAC CCCGATGGCATCGGCCAGATGCAGCACTTCGTCAACGAGGACGGGATGACTATTTTCCGCTTACCTGTCGGATGGCA GTACCTCGTCAACAACAATTTGGGCGGCAATCTTGATTCCACGAGCATTTCCAAGTATGATCAGCTTGTTCAGGGGT GCCTGTCTCTGGGCGCATACTGCATCGTTGACATCCACAATTATGCTCGATGGAACGGTGGGATCATTGGTCAGGGC GGCCCTACTAATGCTCAATTCACGAGCCTTTGGTCGCAGTTGGCATCAAAGTACGCATCTCAGTCGAGGGTGTGGTT CGGCATCATGAATGAGCCCCACGACGTGAACATCAACACCTGGGCTGCCACGGTCCAAGAGGTTGTAACCGCAATCC GCAACGCTGGTGCTACGTCGCAATTCATCTCTTTGCCTGGAAATGATTGGCAATCTGCTGGGGCTTTCATATCCGAT GGCAGTGCAGCCGCCCTGTCTCAAGTCACGAACCCGGATGGGTCAACAACGAATCTGATTTTTGACGTGCACAAATA CTTGGACTCAGACAACTCCGGTACTCACGCCGAATGTACTACAAATAACATTGACGGCGCCTTTTCTCCGCTTGCCA CTTGGCTCCGACAGAACAATCGCCAGGCTATCCTGACAGAAACCGGTGGTGGCAACGTTCAGTCCTGCATACAAGAC ATGTGCCAGCAAATCCAATATCTCAACCAGAACTCAGATGTCTATCTTGGCTATGTTGGTTGGGGTGCCGGATCATT TGATAGCACGTATGTCCTGACGGAAACACCGACTGGCAGTGGTAACTCATGGACGGACACATCCTTGGTCAGCTCGT GTCTCGCAAGAAAGGGATCCTAAGGTACC (SEQ ID NO 3)其中核苷酸1到6是XbaI限制性位点；7到1197是来自里氏木霉的成熟的葡聚糖内切酶(GenBank登记号码DQ178347或 P07982)，具有引入的以下核苷酸变化(根据DQ178347DNA序列编号)G267T和C576T ；1198到1203是BamHI限制性位点；1204 到 1206 是 TAA STOP 密码子；禾口1207到1212是KpnI限制性位点。每个上述质粒被用于创造用于细胞壁附着的纤维素酶的相应表达质粒。对于细胞 壁附着的CBHII，pUC119-AF101 DNA用HindIII-EcoRI消化， 3370bp DNA片段进行凝胶纯 化。纯化的DNA片段连接到HindIII-EcoRI消化的载体YEp 1 ac 112、YEp 1 ac 181和YEp 1 ac 195 中，分别产生 YEplacll2-AF101-at、YEplacl81-AF101_at 和 YEplacl95-AF101_at。对 于细胞壁附着的BGLI，pUC119-AF102DNA用XbaI-BamHI消化， 2520bp DNA片段进行 凝胶纯化。纯化的DNA片段连接到XbaI-BamHI消化的YEplacl81-AF101_at载体中，产生 YEplacl81-AF102-at。对于细胞壁附着的 EGII，pUC119_AF103DNA 用 XbaI-BamHI 消化， 1212bp DNA片段进行凝胶纯化。纯化的DNA片段连接到XbaI-BamHI消化的 YEplacl 12-AF101-at 载体中，产生 YEplacll2-AF103_at。还产生了用于分泌的纤维素酶的表达质粒。对于分泌的BGLI，pUC119-AF102DNA 用XbaI-KpnI消化， 2530bpDNA片段进行凝胶纯化。纯化的DNA片段连接到XbaI-KpnI消 化的载体 YEplacl81-AF101-at 和 YEplacl95_AF101 中，分别产生 YEplacl81-AF102_sec 和 YEplacl95-AF102-sec。对于分泌的 EGII，pUC119_AF103DNA 用 XbaI-KpnI 消化， 1212bp DNA片段进行凝胶纯化。纯化的DNA片段连接到XbaI-KpnI消化的YEplacl 12-AF103_at 载体中，产生 YEplacll2-AF103-sec。对于分泌的 CBHII，pUC119_AF10IDNA 用 XbaI-BamHI 消化， 1341bp DNA片段进行凝胶纯化。纯化的DNA片段连接到XbaI-BamHI消化的 YEplacl95-AF102-sec 中，产生 YEplacl95-AF101_sec。实施例2编码丁醇途径基因的表达质粒的构建为了在酵母中表达丁醇生物合成途径(附图1)，AF104DNA由Blue Heron Bio 商业上合成，丙酮丁醇梭菌基因在AF104DNA中的位置和顺序在表1和附图2中示出。 AF104DNA克隆到PENTR223质粒中，其为细菌细胞赋予了壮观霉素抗性。为了便于随后 的克隆，通过不改变氨基酸序列的核苷酸取代，从丙酮丁醇梭菌基因的编码序列中除去 几个限制性位点。具体地，如下显示的限制内切酶的识别位点在AF104DNA中如下突变 XbaI (TcT/AAGA,1014-1019)，EcoRV(GA/TTATC,1120-1125)，PstI (CT/AGCAG,1417-1422)， PstI (CT/AGCAG,6650-6655)，EcoRI(GAAT/CTC,6966-6971)，KpnI(GGT/AACC,7999-8004)， EcoRV(8761-8766)，EcoRI(GA/TATTC，9850-9855)，EcoRV(GATATC/T，12380-12385)。AF104_ PENTR223质粒不含有对酵母中质粒DNA的复制必不可少的序列，酵母复制起点被亚克隆到 AF104_PENTR223中。具体的，AF104_PENTR223质粒DNA通过EcoRV消化来线性化。高拷贝 (YEplacl95、YEPlacll2、YEplacl81)和低拷贝(YCplac33、YCplac22 和 YCplacl 11)数的细 菌_酵母穿梭载体用Aatll/Narl消化，与T4DNA聚合酶孵育来钝化限制性消化产生的5' 和3'凸出末端。含有酵母复制起点的这些质粒的酵母DNA片段连接到AF104_PENTR223。 产生的重组质粒(表2)能够在最小培养基上生长，并表达对丁醇生物合成负责的至少两种 酶(参见下文实施例8)。作为质量对照，质粒DNA从酵母细胞中回收，重新导入细菌内，纯 化，并进行彻底的限制性分析。显著地，五十个质粒DNA的仅2个具有改变的限制性图谱， 表明AF104DNA衍生的质粒在酵母中是稳定的。实施例3酿酒酵母的转化和转化体选择使用了酵母菌株AFYl (ΜΑΤ α his3-A200 leu2_3，112 ura3-521ys2-801trpl-l) 和 AFY2(MATa his3-Δ 2001eu2-3,112ura3-521ys2-801trpl-l)的衍生物(表 2)。这些菌 株可以用多达5种带有不同选择标记物的质粒转化。使用表达质粒的转化用醋酸锂方法进 行。进行使用多达3种质粒的共同转化，选择含有编码纤维素酶或纤维素酶和丁醇途径基 因的质粒的Trp+Ura+Leu+菌落。为了单独表达丁醇途径基因，使用了撤除单种成分(single drop-out)培养基。使用的所述酵母转化方法是Ausubel et al. (2002)中描述的方案的稍微改进的形式。过夜培养物的细胞重悬浮在50mL YPD (0. 2的起始OD6J并生长到0. 5-0. 7的OD6c 。细 胞通过离心来收获(l，500g，5min)，重悬浮在20mL无菌蒸馏水中。细胞通过离心收获，重悬 浮在1. 5mL新近制备的无菌TE/LiOAc (从IOX浓缩的储备物制备；10XTE-0. IM Tris-HCl、 0. OlM EDTA、pH 7. 5 ；IOX LiOAc-IM LiOAc，用稀释乙酸调节到pH 7.5)中。对于基因破坏 实验， 5 μ g的破坏盒DNA与70 μ g新近变性的鲑鱼精子DNA(10mg/ml，在水浴中沸腾20 分钟，然后在冰/水中冷却)混合，并添加TE/LiOAc中的200 μ L细胞并小心地混合。立即 地，添加1，200 μ L新近制备的无菌的40% PEG4，000(从储备溶液制备的50% PEG 4000、 IOX TEUOX Li0Ac、8 1 lv/v、pH 7.5)并小心地混合。细胞在30°C恒定搅动孵育30 分钟。细胞在42°C孵育15分钟，然后通过离心来采集(4，000g，1分钟)。细胞重悬浮在 200 μ 1 YPD中，平铺到选择性平板上。平板在30°C孵育直到出现菌落。实施例4纤维素处理所有化学物质、培养基成分和添加物是分析级的。磷酸-膨胀纤维素(PASC)如Den Haan et al. (2007)所描述的制备。简要地，Avicel PH-101 (Fluka) (2g)首先用 6mL 蒸 馏水浸泡。然后，50mL的86. 2%磷酸缓慢地添加到试管并充分混合，随后添加另外50mL的 磷酸并混合。透明的溶液在4°C保持过夜来完全溶解纤维素，直到在反应混合物中没有团 块残留。然后，200mL冰冷的蒸馏水添加到试管并混合，随后添加另外200mL水并混合。混 合物在3500rpm离心15分钟，除去上清液。重复添加蒸馏水和随后的离心。最后，IOmL的 2M碳酸钠和450mL水添加到纤维素中，之后用蒸馏水2或3次洗涤，直到获得最终5_7的 PH值。Whatman Paper#i的酸处理如上对Avicel 所述的进行，除了仅使用Ig撕碎 的纸。实施例5酵母发酵单独的菌落接种到具有适合的添加物和具有2%葡萄糖作为碳源的IOmL培养基 中，在30°C有氧孵育24-72小时。酵母细胞通过在4，OOOrpm离心10分钟来采集，重悬浮在 具有2%葡萄糖的IOOmL培养基中。在30°C在有氧条件下孵育24-72小时之后，细胞通过 离心来收集并用蒸馏水洗涤两次。细胞团接种到具有2%葡萄糖、或40% PASC或40%处理 的Whatman Paper的IOmL培养基中，丁醇或乙醇发酵在具有闭合的盖子的15mL试管中 在30°C厌氧地进行。0. 2mL等分量在不同的时点采集，利用气相色谱分析丁醇和乙醇浓度。实施例6利用loxP-his5_loxP破坏盒的基因破坏酿酒酵母是非常有效的乙醇生产者。因而，为了避免乙醇和丁醇生物合成途径之 间的竞争，利用标准技术删除实验室菌株AFYl和AFY3中的ADHl和ADH5基因。通过利用 PUG27质粒(Gueldener et al. 1996)作为PCR模板来产生DNA片段(所述DNA片段指导二 倍体酵母细胞中通过同源重组用粟酒裂殖酵母(Schizosachharomyces p0mbe)hiS5基因置 换染色体0RF)的基于PCR的基因删除，染色体ADHl和ADH5基因被灭活。两个盒利用ADHl 和ADtH5破坏引物(表3)来扩增。引物的5' 50个核苷酸分别与ATG起始密码子上游和 终止密码子下游的目标基因序列同源。3'-片段与破坏盒的IoxP基序的右侧和左侧的序 列同源(附图3)。
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重要地，ADHl基因的删除导致乙醇生物合成的显著的降低。还构建了在adhl和 adh5基因中包括突变的双突变体菌株。酿酒酵母基因组编码8种醇脱氢酶，其中至少4种 涉及乙醇生产。因而，相应基因的灭活可以导致阻断乙醇合成，可以显著地提高丁醇生产。为了确认破坏盒向ADHl和ADH5基因座的正确的整合，还利用相应的目标基因特 异性引物(A，D)和破坏盒特异性引物(B，C)(表3)对His+转化体进行诊断性PCR。杂合 的二倍体形成孢子，解剖四分孢子。为了在一个菌株中对几个基因破坏重复地使用his5标记物，必需从成功破坏的 基因中除去标记物。其中相应的基因通过l0Xp-his5-l0Xp盒被破坏的adhl和adh5突变 菌株，用带有URA3标记基因和处在可诱导的GALl启动子控制下的ere基因的ere表达质 粒pSH47 (Guldener etal.，1996)转化(附图4)。Cre重组酶的表达通过将细胞从葡萄糖 移动到半乳糖培养基、并在半乳糖培养基中孵育2小时来诱导。失去his5标记基因的细胞 通过在没有组氨酸的含最少葡萄糖的平板上影印铺板酵母菌落来检测。his5标记基因的失 去通过诊断性PCR来验证。通过在含有5-氟乳清酸的平板上将细胞划线来反选择质粒的 丧失，从这些菌株中除去Cre表达质粒。实施例7来自酵母的蛋白质提取物的制备酵母的无细胞提取物基本上如Ausubel et al. , (2002)所描述的制备。过夜 的酵母培养物稀释到0. 2的0D·，然后在IOmL选择性的最小培养基中生长到0. 8-1. 0的 0D_。细胞通过离心来收获，重悬浮在200μ 1含蛋白酶抑制物的玻璃珠破坏缓冲液中(20mM Tris-HCl, pH 7. 9 ；IOmM MgCl2 ；ImM EDTA、ImM 二硫苏糖醇、5 %甘油、0. 3M 硫酸铵；1 μ g/ mL亮抑酶肽、抗蛋白酶、糜蛋白酶抑素、胃酶抑素和抑酶肽)。添加等体积的冷却的酸洗涤 的玻璃珠，悬浮液在4°C在最大速度涡旋1分钟。试管置于冰上2分钟，再涡旋4次。收集 水相，保持在冰上。玻璃珠用2倍体积的玻璃珠破坏缓冲液洗涤。集中的无细胞提取物在 12，000g、4°C离心15分钟，保存在-800C ο实施例8酶分析所有的酶分析在25°C进行。利用乙酰乙酰-Co和CoA作为底物，根据利用Genesys IOUV/可见光分光光 度计(Thermo Scientific, ffaltham, ΜΑ)在303nm处测量的乙酰乙酰-CoA浓度的降低 (ffiesenborn et al.，1988)来测定THL活性。为了开始酶反应，细胞提取物(IOyL)添加到 含有 IOOmM Tris-HCKpH 8. 0) UOmM MgCl2、ImM二硫苏糖醇、50 μ M 乙酰乙酰-CoA和 0. 2mM CoA的溶液中。监测样品溶液和对照溶液中吸光度的降低，对照溶液中没有CoA。通过监视来自乙酰乙酰-CoA的β -羟基丁酰-CoA的形成所产生的NADH浓度的 降低，在345nm处测量HBD活性(Hartmanis and Gatenbeck，1984)。细胞提取物添加到含 有IOOmM MOPS (pH 7. 0)、ImM 二硫苏糖醇、0. ImM乙酰乙酰-CoA和0. 15mM NADH的混合物 中。乙酰乙酰-CoA在对照中省略。通过在263nm处测量来自巴豆酰-CoA的β -羟基丁酰-CoA形成所产生的巴豆 酰-CoA浓度降低，来测量CRT活性(Hartmanis and Gatenbeck，1984)。细胞提取物添加到 含有IOOmM Tris-HCl (pH 7. 6)禾口 50 μ M巴豆酰-CoA的混合物中。
用于B⑶分析的细胞提取物如上所述在填充95% N2和5 % H2的厌氧仓室中制 备。通过在300nm处监视二茂铁离子来分析B⑶活性，二茂铁离子在来自巴豆酰-CoA的丁 酰-CoA形成期间作为电子供体(Lehman et al.，1990)。向含有细胞提取物和50nM MOPS (pH 7. 0)的混合物中，添加巴豆酰-CoA到0. 4mM,在10分钟的平衡之后，二茂铁离子添加到 0. 2mM的终浓度。监视样品溶液和没有巴豆酰-CoA的对照溶液中吸光度的降低。为了测量BYDH和BDH活性，有氧生长的培养物在厌氧条件下柔和搅动孵育3小 时，然后在厌氧的仓室中制备细胞提取物。BYDH活性分析利用酵母醇脱氢酶进行(Dtore et al. 1987)。在这种偶联分析中，BYDH将丁酰-CoA转化为丁醛，其进一步被醇脱氢酶转化为 丁醇，引起2个NADH分子的消耗。含有细胞提取物、50mM MES缓冲液(pH6. 0)、IOOmM KC1、
0.15mM NADH和3U酵母衍生的醇脱氢酶的混合物孵育10分钟，然后将0. 2mM的丁酰-CoA 添加到混合物中。在345nm处测量NADH浓度的降低。对照中省略了丁酰_CoA。通过在345nm处监视样品溶液和没有丁醛的对照溶液中由来自丁醛的丁醇形成 引起的NADH浓度的降低，来测量BDH活性(DUrre et al. 1987)。含有细胞提取物、50mM MES (pH 6. 0)和0. 15mM NADH的反应混合物在添加35mM 丁醛之前孵育10分钟。至此，对用AF104衍生物转化的重组酵母细胞中丁醇的生物合成负责的两个丙酮 丁醇梭菌酶的活性如上所述地测试。作为乙酰-CoA转乙酰酶(硫解酶，THL)活性的结果， 从乙酰乙酰-CoA和CoA形成2个乙酰-CoA分子。用表达丁醇途径基因的高拷贝质粒转化 AFYlO酵母菌株显著地加快了体外乙酰乙酰-CoA浓度的降低(附图10)。例如，在30分钟 孵育之后，仅56%的乙酰乙酰-CoA保留在反应混合物中。相反，从用载体DNA转化的细胞 制备的提取物仅转化32%的底物。β -羟基丁酰-CoA脱氢酶(HBD)活性涉及在NADH偶联反应中从乙酰乙酰-CoA 形成羟基丁酰。底物与从单独的载体DNA转化的酵母细胞制备的蛋白质提取物孵育不 引起NADH浓度的显著降低(在25分钟孵育之后98% NADH保留在反应混合物中)(附图 11)。然而，编码丁醇途径的质粒DNA引起NADH浓度的显著降低。在10分钟的孵育之后， 几乎50 %的NADH被转化为NAD+。实施例9气相色谱分析发酵产物(例如，乙醇和丁醇)利用装备有RTX-5毛细管柱(30m χ 0. 53mm
1.d. χ 1. 5μπι) (Restek, Bellefonte, ΡΑ)的气相色谱(GC) (5890Series II Agilent Technologies,Wilmington,DE)和火焰电离检测来分析。在分析之前，样品在14，OOOXrpm 离心10分钟。样品用正丙醇的25ppm水溶液稀释20倍作为内标准。氦气用作载气，5mL/ 分钟，在毛细管柱之前分流1到20。柱加热到40°C 4分钟，然后以30°C /分钟的速度上升 到130°C。GC装备7673B自动采样器(Agilent Technologies)，数据通过触点闭合来采集， 利用 Peak Simple 软件(SRI Instruments Torrance, CA)进行分析。分别用覆盖 IOOOppm 到0. Sppm和IOOppm到0. Sppm的范围的乙醇和丁醇开发了线性校准曲线。附图5是丁醇 的校准曲线的实例。实施例10通过重组酵母从纤维素发酵丁醇和乙醇构建了几个酵母菌株用于从纤维素生产丁醇和乙醇。为了将纤维素发酵成丁醇和
21乙醇，构建了在酵母细胞壁表面共同展示三种纤维素酶(EGII、CHBII和BGLI)的菌株。此 外，发展了产生相同纤维素酶的分泌形式的第二组菌株。具有表面展示的纤维素酶的菌株 和表达分泌的纤维素酶的菌株是用于从PASC或处理的纸生产乙醇的有效的宿主(附图6)。 附图6说明了通过上述酵母菌株的纤维素到乙醇的发酵。发酵使用IOmL的最小培养基和 40% PASC或处理的Whatman 纸在i5mL试管中进行。pasc，一种无定形类型的纤维素， 通过用85%磷酸处理从Avieel 制备。Avieel 是通过木材的酸回流水解产生的商业上 可获得的、结晶形态的纤维素。几种独立的重组酵母菌株被用于每个发酵实验。用空载体， 即，没有纤维素酶基因的载体转化的酵母菌株用作阴性对照。显著地，乙醇生产性酵母菌株 以几乎100%的最大理论产量将纤维素解聚并发酵成乙醇，产生超过4克每升的乙醇。为了将葡萄糖发酵成丁醇，构建了表达附图1的丁醇途径的酶的酵母菌株。这些 菌株被用于来自2%葡萄糖的丁醇发酵。丁醇发酵利用GasPak EX厌氧生成系统在厌氧 条件下进行。这个系统提供了具有4-10%氧化碳和 0.1%氧气的无水厌氧条件。附图7 显示了使用含有丁醇途径基因的十二种酵母菌株的来自葡萄糖的丁醇发酵。三种载体对 照被用作阴性对照。如通过气相色谱法测量的，一个酵母菌株，即，adhl (3a) A7. 2产生超过 0.018g/L的丁醇(附图8)。要注意的是，发酵实验在酵母菌株中进行，在所述酵母菌株中 仅一种涉及乙醇生产的最后阶段的酶Adhl被灭活。由于酿酒酵母基因组编码8种醇脱氢 酶，其中至少4种涉及乙醇生产，预计的是在带有多个adh突变的酵母菌株中的丁醇产量将 显著更高。为了将纤维素发酵成丁醇，构建了表达丁醇途径的所有酶和两种分泌的纤维素 酶:EGII和CBHII ；EGII和BGLI ；或CBHII和BGLI的酵母菌株。这些菌株被用于来自40% PASC的丁醇发酵。丁醇发酵利用GasPak EX厌氧生成系统在厌氧条件下进行。附图9显示 了使用含有丁醇途径和纤维素酶基因的几种Arbor Fuel的酵母菌株来自纤维素的丁醇发 酵。含有CBHII和BGLI的一种酵母菌株Yl. F9产生了 4. 3ppm,而另一种含有EGII和BGLI 的Yl. G4产生4. 8ppm的丁醇。实施例11实验室和工业酵母菌株对丁醇的敏感性为了在工业水平生产丁醇，耐受高丁醇浓度的宿主细胞是优选的。测试了实验室 和工业酵母菌株对丁醇的敏感性。测试的两种实验室菌株(AFY1、AFY3)的生长在含有 丁醇的平板上严重地受损。相反，作为野生型多倍体酵母菌株的工业酵母菌株AFY16耐受 高达2%的丁醇而对生长速度没有显著影响(附图12)，表明AFY16酵母菌株和它的衍生物 用于工业丁醇生产的适用性。实施例12漆酶在酿酒酵母中的表达漆酶可以用于木质纤维水解产物的酶解毒。具有对酚抑制剂的增强的抗性、从而 改善了发酵木质纤维水解产物的能力的酿酒酵母菌株通过漆酶的异源表达来获得。酿酒酵 母可以用于发酵木质纤维素水解产物中的糖类。与发酵方法相关的难题是在木质纤维素 水解产物中抑制物的存在。抑制物可以包括酚类化合物、呋喃衍生物、脂肪族酸和提取物。 存在几种方法用于在发酵之前木质纤维素水解产物的解毒(Olsson and Hahn-Hagerdal, 1996)。近来开发了利用来自变色栓菌(T. versicolor)的漆酶的酶解毒方法(Jonsson et
22al.，1998)。漆酶特异性地除去酚类化合物而不改变呋喃衍生物、脂肪族酸和可发酵糖的浓 度。酶解毒方法容许对发酵抑制剂更有抗性的酿酒酵母菌株的构建。纤维素酶基因导入这 些菌株中，将这些天然的非纤维素分解酵母转化成允许在预处理的木质纤维素上生长和发 酵的微生物。漆酶表达构建体类似于纤维素酶构建体。漆酶基因的克隆可以如实施例1中 对纤维素酶的克隆所描述的进行。简要地，来自糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)成熟的 漆酶POXAlb (AJ005018)与来自米根霉的葡糖淀粉酶的分泌信号序列(D00049)融合。分泌 信号对漆酶向细胞壁的递送和向细胞外部的分泌负责。糙皮侧耳漆酶表达构建体可以与来 自里氏木霉的葡聚糖内切酶II和纤维二糖水解酶II以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶的表达构 建体共同表达。实施例13酿酒酵母中木糖同化酶的表达这个实例的目的是描述如何工程化木糖发酵酿酒酵母菌株。酿酒酵母的野生型菌 株不能利用戊糖，例如木糖。然而戊糖糖类的有效发酵对于获得来自木质纤维生物质的乙 醇和丁醇生产的经济可行方法是必需的。酿酒酵母的厌氧木糖发酵通过来自树干毕赤酵 母(Pichiastipitis)的木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的异源表达与内源木酮糖 激酶(XK)的过量表达首次被展现(Ho et al.，1998，1999)。来自木糖的醇发酵还通过仅 带有一个来自真菌Piromyces sp.的异源木糖异构酶(XI)基因的重组酿酒酵母菌株进行 7 (Kuyper et al. ,2003) 编码 XI 的开放阅读框(GenBank 登记号码 AJ249909)由 Blue Heron Bio合成。限制性内切酶Sail和KpnI的位点将被分别引入DNA的5'和3'末端。 限制性内切酶HindIII和KpnI的位点将通过不改变氨基酸序列的核苷酸取代来改变。产生 的质粒PUC119-AF105将用SalI-KpnII消化， 1326bp DNA片段凝胶纯化。纯化的DNA片 段将连接到SalI-KpnI消化的载体YEplacl95-AF101_at中来产生质粒pYEplacl95_AF105。 这个质粒将用于酵母细胞的转化，以及用于已经含有如上所述的纤维素酶基因和丁醇途径 基因的细胞的共同转化。虽然已经在此详细地公开了具体的实施方式，这通过仅用于例示的目的的实施例 的方式来进行，不意味着限制接下来附随的权利要求的范围。特别地，发明人期待的是，各 种替代、改变和修改可以对本发明进行而不背离如权利要求所定义的本发明的精神和范 围。其他方面、优点和改变被认为处在以下权利要求的范围之内。提出的权利要求是在此 公开的发明的表示。其他的、未要求权利的发明也是期待的。申请人保留在以后的权利要 求中追求这样的发明的权利。表1. 丁醇生物合成途径基因 表2.使用的酵母菌株和质粒
酵母菌林 AFYl AFY2 AFY3 AFYlO AFY19 AFY28
质粒
AF104_PENTR223克隆到PENTR223载体中赋予对壮观霉素的抗性
的 AF104 DNA
含有编码酵母2 μ复制起点的YEplacl 12的 AatH/Narl 片段的 AF104—PENTR223 含有编码酵母2μ复制起点的YEplacl95的 Aatll/Narl 片段的 AF104—PENTR223 含有编码酵母2 μ复制起点的YEplacl81的 Aatll/Narl 片段的 AF104_PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplac22的 Aatll/Narl 片段的 AF104—PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplac33的 Aatll/Narl 片段的 AF104_PENTR223 含有编码酵母CEN4复制起点的YCplaclll的 Aatll/Narl 片段的 AF104_PENTR223 纤维二糖水解酶II (CBHII)构建体
具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的CBHII的表达构建体 具有附着的BGLI的表达构建体 具有附着的EGII的表达构建体 具有分泌的CBHII的表达构建体 具有分泌的BGLI的表达构建体 具有分泌的EGII的表达构建体
pAF104/112A3
pAF 104/195A7
pAF104/181A12 pAF104/181B2 pAF 104/22
pAF 104/339
pAF104/11116
pUC119-AF101 YEplacll2-AF101-at YEplacl81-AFlOl-at YEplacl 95-AF101-at YEplacl 81-AF 102-at YEplac 112-AF103-at YEplacl 95-AF101-sec YEplacl 81-AF 102-sec YEplacll2-AF103-sec表3.寡核苷酸的列表
25
26Research 24 :2519_2524·Hartmanis MG, Gatenbeck S.1984. Intermediary Metabolism in Clostridium acetobutylicum Levels of Enzymes Involved in the Formation of Acetate and Butyrate. Appl Environ Microbiol 47:1277-1283.Ho Nff, Chen Z，Brainard AP. 1998. Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose. Appl Environ Microbiol 64:1852-1859.Ho NW, Chen Z, Brainard AP, Sedlak M. 1999. Successful design and development of genetically engineered Saccharomyces yeasts for effective co-fermentation of glucose and xylose from cellulosic biomass to fuel ethanol. Adv Biochem Eng Biotechnol 65 :163—192.Jonsson LJ, Palmqvist E, Nilvebrant NO, Hahn-Hagerdal B. 1998. Detoxifcation of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl Microbiol Biotechnol 49 :691_697.Kuyper M， Harhangi HR, Stave AK, Winkler AA, Jetten MS， de Laat WT, den Ridder JJ, Op den Camp HJ, van Dijken JP, Pronk JT. 2003. High level functional expression of a fungal xylose isomerase the key to efficient ethanolic fermentation of xylose by Saccharomyces cerevisiae ？ FEMS Yeast Res 4 :69_78.Lehman TC，Hale DE，Bhala A，Thorpe C. 1990. An acyl-coenzyme A dehydrogenase assay utilizing the ferricenium ion.Anal Biochem 186:280—284·Lynd LR, Weimer PJ，van Zyl WH, Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization !fundamentals and biotechnology. Microbiol Mol Biol Rev 66:506—577.Olsson L，Hahn-Hagerdal B. 1996.Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production. Enzyme Microb Technoll8 :312_33LSambrook J，Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor，NY.Sherman F，Fink GR，Hicks JB. 1986. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press :Cold Spring Harbor，NY.van Zyl WH, Lynd LR, den Haan R, McBride JE. 2007. Consolidated bioprocessing for bioethanol production using Saccharomyces cerevisiae. Adv Biochem Eng Biotechnol 108 :205_235Wiesenborn DP，Rudolph FB, Papoutsakis ET. 1989. Coenzyme A transferase from Clostridium acetobutylicum ATCC 824and its role in the uptake of acids. Appl Environ Microbiol 55 :323_329.Wolfenden R，Snider MJ. 2001. The depth of chemical time and the powder of enzyme as catalysts. Acc Chem Res 34:938—945.Zhang Y-HP,Lynd LR. 2004. Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose :noncomplexed cellulose systems. Biotechnol Bioeng 88 797-824.
Zhang Y-HP,Himmel ME,Mielenz JR. 2006. Outook for cellulase improvement screening and selection strategies. Biotechnol Adv 24 :452_48权利要求
一种重组微生物，包含(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因，所述多肽催化选自以下构成的组的底物到产物的转化(a)乙酰 CoA到乙酰乙酰 CoA(b)乙酰乙酰 CoA到(S) 3 羟基丁酰 CoA(c)(S) 3 羟基丁酰 CoA到巴豆酰 CoA(d)巴豆酰 CoA到丁酰 CoA(e)丁酰 CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇；和(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因；其中所述重组微生物将纤维素转化成丁醇。
2.权利要求1的微生物，其中所述微生物是选自由以下构成的组的属的成员梭菌属、 发酵单胞菌属、埃希杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、乳杆菌属、肠 球菌属、产碱杆菌属、克氏杆菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤氏 酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属和酵母属。
3.权利要求1的微生物，其中所述微生物是选自由大肠杆菌、真养产碱杆菌、地衣芽孢 杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪 肠球菌、枯草芽胞杆菌、卡尔斯伯酵母和酿酒酵母构成的组的物种的成员。
4.权利要求2的微生物，其中所述微生物是酵母属物种。
5.权利要求4的微生物，其中所述微生物是酿酒酵母。
6.权利要求1的微生物，其中所述纤维素酶选自由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和 β-葡糖苷酶构成的组。
7.权利要求6的微生物，其中所述纤维素酶选自由葡聚糖内切酶II、纤维二糖水解酶 II和β-葡糖苷酶I构成的组。
8.权利要求7的微生物，其中所述微生物包含编码葡聚糖内切酶II、纤维二糖水解酶 II和葡糖苷酶I的异源基因。
9.权利要求8的微生物，其中所述葡聚糖内切酶II和纤维二糖水解酶II基因来自里 氏木霉，所述β-葡糖苷酶I基因来自棘孢曲霉。
10.权利要求1的微生物，其中所述丁醇生物合成途径基因选自由乙酰-C0AC-转乙酰 酶(硫解酶)、3_羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA 脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶构成的组。
11.权利要求10的微生物，其中所述丁醇生物合成途径基因来自产溶剂细菌。
12.权利要求11的微生物，其中所述产溶剂细菌是丙酮丁醇梭菌。
13.权利要求10的微生物，其中所述微生物包含编码乙酰-CoAC-转乙酰酶(硫解 酶)、3_羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶(巴豆酸酶)、丁酰-CoA脱氢酶、 丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的异源丁醇生物合成途径基因。
14.权利要求13的微生物，其中所述丁醇生物合成途径基因来自产溶剂细菌。
15.权利要求14的微生物，其中所述产溶剂细菌是丙酮丁醇梭菌。
16.权利要求1的微生物，其中竞争产物途径已被破坏。
17.权利要求16的微生物，其中所述竞争产物途径是乙醇途径。
18.权利要求17的微生物，其中所述乙醇途径通过灭活一种或更多种醇脱氢酶来破坏。
19.一种用于从纤维素生产丁醇的方法，包括(a)提供根据权利要求1-18的任一项的重组微生物；和(b)在一定条件下使所述微生物与纤维素接触从而生产丁醇。
20.权利要求19的方法，进一步包括分离生产的丁醇的步骤。
21.一种重组微生物，包含(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因，所述多肽催化选自以下构成的 组的底物到产物的转化(a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(b)乙酰乙酰-CoA到(S)-3-羟基丁酰-CoA(c)(S) -3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA(e)丁酰-CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇；(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因；和(3)编码漆酶多肽的异源基因；其中所述重组微生物将木质纤维素转化成丁醇。
22.权利要求21的微生物，其中编码漆酶多肽的基因是来自糙皮侧耳的POXAlb基因。
23.一种用于从木质纤维素生产丁醇的方法，包括(a)提供根据权利要求21-22的任一项的重组微生物；和(b)在一定条件下使所述微生物与木质纤维素接触从而生产丁醇。
24.权利要求23的方法，进一步包括分离生产的丁醇的步骤。
25.一种重组微生物，包含(1)编码多肽的至少一种异源丁醇生物合成途径基因，所述多肽催化选自以下构成的 组的底物到产物的转化(a)乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA(b)乙酰乙酰-CoA到(S)-3-羟基丁酰-CoA(c)(S) -3-羟基丁酰-CoA到巴豆酰-CoA(d)巴豆酰-CoA到丁酰-CoA(e)丁酰-CoA到丁醛(f)丁醛到丁醇；(2)编码纤维素酶的至少一种异源基因；和(3)编码涉及戊糖的发酵的多肽的至少一种异源基因； 其中所述重组微生物将半纤维素转化成丁醇。
26.权利要求25的微生物，其中所述戊糖是木糖。
27.权利要求26的微生物，其中涉及木糖的发酵的所述多肽是木糖异构酶。
28.权利要求27的微生物，其中所述木糖异构酶基因来自Piromycessp.。
29.权利要求26的微生物，其中涉及木糖的发酵的所述多肽是木糖还原酶或木糖醇脱氢酶。
30.权利要求29的微生物，其中所述微生物包含编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的异源基因。
31.权利要求30的微生物，其中所述木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因来自树干毕赤酵母。
32.一种用于从半纤维素生产丁醇的方法，包括(a)提供根据权利要求25-31的任一项的重组微生物；和(b)在一定条件下使所述微生物与半纤维素接触从而生产丁醇。
33.权利要求32的方法，进一步包括分离生产的丁醇的步骤。全文摘要
本发明的实施方式包括通过用于纤维素材料向期望的终产物的转化的合并的生物处理方法来生产四碳醇类、特别是正丁醇的方法。根据某些实施方式，提供了重组微生物宿主细胞，优选的酿酒酵母，其能够将纤维素材料转化成丁醇，并包括丁醇生物合成途径基因和纤维素酶基因。
文档编号C12P7/16GK101918572SQ200880122492
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月27日 优先权日2007年10月26日
发明者A·阿梅里克, B·E·泰伦, N·赫拉姆佐夫, S·亨克 申请人:阿伯燃料公司