高产量生物丁醇的生产和定量方法

专利名称：高产量生物丁醇的生产和定量方法
技术领域：
本发明涉及使用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)ATCC 10132 生产 高产量丁醇的改进方法。本发明特别报道了在优化条件下具有提高的丁醇耐受性的菌株。 本发明还涉及在发酵工艺期间快速有效地定量评估丁醇的方法。本发明特别涉及用于定量 评估使用丙酮丁醇梭菌ATCC 10132进行厌氧发酵生产的丁醇的高效液相色谱(HPLC)方法。
背景技术：
丁醇或丁基醇(在通过生物方式生产时，有时也称作生物丁醇)是具有四碳结构 的伯醇，分子式为C4H1(iO。其主要作为溶剂、化学合成的中间产物以及燃料使用。目前，在 使用微生物通过发酵生产如丁醇和乙醇的燃料方面具有主要兴趣，其集中于环境问题以及 这种生产方式的可再生性质。丁醇是超级燃料，并且具有高于乙醇的热值(Qureshi and BlaSChek，2000)。丁醇具有高于乙醇的内能(丁醇为每加仑110，000Btu，而乙醇为每加仑 84，OOOBtu)。其“挥发性”比乙醇小6倍，比汽油小13. 5倍，并可通过现有的燃料管线运输， 而乙醇则必须通过铁路、船舶或车辆运输(Jones and Woods，1986)。丁醇是重要的工业化学品。与目前常见的燃料添加剂乙醇相比，丁醇更易于与汽 油和柴油燃料混溶，具有较低的蒸汽压，并且与水的混溶性较低，具有使丁醇成为比乙醇更 好的超级燃料的性质。目前丁醇作为化学品的价格是每加仑$3. 75，全球每年销售3. 7亿加 仑。预期如果能够经济地从廉价的生物质生产绿色丁醇，市场需求会显著提高。除作为燃 料应用之外，丁醇还可作为溶剂用于各种化学和纺织工艺、有机合成，并可作为化学中间产 物使用。丁醇还在其他涂覆应用中作为涂料稀释剂和溶剂使用，其中，在漆器和室温固化珐 琅器中将其作为挥发相对较慢的潜溶剂使用。丁醇还具有其他应用，例如作为液压液和制 动液的组分(Mutschlechner et al.，2000)。还将其用作香料原料，但这是基于丁醇本身具 有的高度醇类香气。自20世纪50年代起，美国的大多数丁醇是由矿物燃料商业化生产。最常见的方 法以丙烯为原料，通过加氢甲酰化使其形成丁醛，随后用氢气将丁醛还原成丁醇。通过发酵 从玉米、草料、树叶、农业废料和其他生物质生产丁醇。使用丙酮丁醇梭菌通过发酵生产工业丁醇和丙酮起始于1916年。路易·巴斯德 (Louis Pasteur)的学生哈伊姆 魏茨曼(Chaim Weizmann)分离出产生丙酮的微生物。直 到20世纪20年代，丙酮都是所需求的产品，但每发酵产生1磅丙酮就形成2磅丁醇。不断 发展的汽车涂料工业逆转了这种市场需求，到1927年，丁醇成为主要产品，而丙酮则成为.1J广品。丁醇的发酵生产从20世纪40年代到20世纪50年代下降，这主要是因为石油化 学产品的价格下降至低于淀粉和糖底物例如玉米和糖蜜的价格。这种局面是由劳动密集型 分批发酵系统的费用与低产量共同造成的。由发酵获得丙酮和丁醇的生产在20世纪50年 代停止。通过丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇乙醇(ABE)发酵是已知的最古老工业发酵之一。其 生产规模排在第二位，仅次于酵母的乙醇发酵，是有史以来已知的最大规模生物技术工艺 之一。然而，实际的发酵过程非常复杂且难以控制。ABE发酵自20世纪50年代逐渐减少，而 现在几乎所有的丁醇均通过石化途径生产。在典型的ABE发酵中，首先通过丙酮丁醇梭菌 生产丁酸、丙酸、乳酸和乙酸，培养基PH下降并经历代谢的“蝶”变(“butterfly” shift)， 并形成丁醇、丙酮、异丙醇和乙醇。在传统的ABE发酵中，从葡萄糖的丁醇产率很小，通常约 15%并且很少超过25%。丁醇的生产受到严重产物抑制的限制。浓度为的丁醇能够显著抑制细胞生长 和发酵过程。因此，传统ABE发酵中的丁醇浓度通常低于1.3%。与丁醇生产相关的关键问 题是丁醇对发酵微生物的毒性/抑制，导致发酵液中丁醇滴度低(Ezeji et al，2007)。丁 醇在2%的非常低浓度下即对生物系统具有高的毒性(Jones and Wood，1986)。这种毒性 可能是因为丁醇定位于质膜，并且破坏包括膜渗透性、溶质运输、质子动力势的维持、嵌入 膜蛋白的构象和活性在内的多种生理过程。已尝试改进不同梭菌物种对丁醇的耐受水平， 并取得了不同程度的成功(Evan and Wang，1988)。目前对丁醇生产的兴趣使得重新审视丙 酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵，包括用于减少或消除丁醇对培养物毒性的策略。在过去20多年中，已有多种用于改进ABE发酵中丁醇生产的工程尝试，包括细胞 回用和细胞固定化以增加细胞密度和反应器生产率，并使用萃取发酵使产物抑制最小化。 尽管已付出很多努力，但是迄今为止ABE发酵获得的最好结果仍低于2%丁醇浓度、4. 46g/ L/h生产率，并且由葡萄糖获得的产率小于25%。长期以来，ABE发酵法的优化一直是本行 业的目标。考虑到这一点，开发出通过连续培养固定化酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum) 和丙酮丁醇梭菌的替代方法，其获得4. 64g/L/h的最佳丁醇生产率和42%的产率。简而言 之，一种微生物使氢和丁酸的生产最大化，而另一种将丁酸转化成丁醇。与常规的ABE发酵 相比，此方法消除了乙酸、乳酸、丙酸、丙酮、异丙醇和乙醇的产生。ABE发酵法仅产生氢、丁 酸、丁醇和二氧化碳，并且使丁醇的产量倍增，从每蒲式耳玉米1. 3加仑增至每蒲式耳2. 5 加仑。此方法的缺陷也是双倍的必需维持用于两种培养物的两套条件，在固定化系统中保 持完全的厌氧生活，处理在发酵期间产生的气体以及这些气体在保持固定化基质的完整性 中的作用。在传统的ABE发酵中，葡萄糖的丁醇产率是低的，在15% -25%之间，而且发酵中 的丁醇浓度通常低于1. 3% (浓度为的丁醇能够显著抑制细胞生长和发酵过程)。多年 来，已有多种通过使用各种技术将产物抑制最小化来改进丁醇的产率的尝试。在这点上，通过工艺设计、培养基和发酵条件的标准化、菌株改进研发出生产率最 大化且对此重要燃料的耐受性最大的方法最为重要(Agarwal et ah，2005)。据报道，生理 和营养因素，例如初始糖浓度、复合氮源、接种体积、碳酸根离子浓度、生长培养基的PH和温度是影响细胞生长和丁醇生产的最至关重要的因素(Samuelov et al,1991 ；Nghiem et al, 1997 ；Lee et al,1999)。美国专利4，757，010和欧洲专利申请EP 00111683提供了对丁醇耐受性提高的 改进型梭菌菌株。JP03058782提供了作为梭菌属细菌变体的巴斯德梭菌(Clostridium pasteurianum)CA 101菌种(FERM P-10817)，其对发酵的丁醇中间产物具有类似抗性并具 有丁醇生产力。美国专利4，539，293证明了共培养梭菌属微生物的应用，其中一种微生物 有利于丁酸的生产，而另一种支持丁醇的形成。日本专利申请JP 63157989提供了通过在 28-33°C、略酸性pH条件下将不同的菌株巴斯德梭菌变体1-53 (FERM P-9074)在包含碳源、 氮源和其他无机盐的液体培养基中于厌氧状态下培养2-4天来生产丁醇的方法。然而，这些改造菌株的问题在于转基因菌株用于燃料生产不能与野生型菌株相竞 争，因此需要将原料灭菌以保证没有对转基因生物的竞争作用。此外，开发转基因生物或各 种菌株的费用昂贵，且没有发现相关的大批量产品。使用了各种可选的原位/在线除丁醇技术，包括基于膜的系统，例如全蒸发、 液-液萃取和气提。美国专利第4，777，135号描述了通过发酵生产丁醇的方法，所述方法包括在厌氧 条件下，在包含碳氟化合物的培养基中培养产丁醇微生物。由于碳氟化合物不具备环境安 全性，因此该方法在商业上不可行。美国专利4，605，620提供了通过使用包含碳水化合物和磷酸盐的培养基生产丁 醇的方法，其中使用1.0-0. 4毫摩尔的总磷酸盐含量进行试验。此方法具有限制，其中需要 磷酸盐限制培养基。美国专利4，560，658提供了通过使用丙酮丁醇梭菌发酵含碳化合物生产丁醇的 方法，其中在包含足够浓度的溶解一氧化碳的含水介质中进行发酵。然而，一氧化碳的应用 使得此方法对环境不安全。美国专利4，520，104提供了通过使用丙酮丁醇梭菌发酵碳水化合物来连续生产 丁醇的方法。此方法将高稀释率的连续接种生产与将发酵液通过吸收丁醇材料的循环相结 合，从而在发酵反应器中长期保持强健的细胞群。此方法经设计以除去发酵液中产生的丁 醇，以防止其对细胞的毒性。日本专利JP 62278989提供了用于生产丙酮和丁醇的发酵方法，其中将产丁醇的 菌株保持在静止状态，向细胞添加碳源以在短时间内进行丙酮和丁醇生产，回收并浓缩产 丁醇菌株，对其进行热休克并添加到发酵罐中。此方法需要热休克以激活梭菌孢子，并且很 常规。日本专利申请提供了厌氧纤维素分解菌例如产纤维二糖梭菌(Clostridium eellobioparum)ATCC 15832 或白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)ATCC 27211，以及 Clostridium saccharoperbutylacetonicum,将其接种到包含含纤维素材料,例如木料、废 纸或纸浆的培养基中，并在25-45°C、pH 4-9的厌氧条件下培养约2_20天，以从所得培养物 中收集主要由丁醇组成的目标含氧化合物。此方法非常耗时，需要约20天才能完成，因此 大规模生产不可行。日本专利63269988公开了丁醇发酵，其中在接种产丁醇菌株之前使酵母在发酵 罐中进行自身消化和增殖。发酵罐中的空间成为厌氧性，并且通过酵母增殖提高温度以进
6行丁醇发酵。无效的自身消化将导致发酵液被酵母污染。US20050233031提供了生产丁醇的方法，所述方法包括处理植物衍生材料，从而在 发酵过程中提供含糖的水性液体以生产发酵产物。此方法涉及多个步骤，因此繁琐且冗长。日本专利JP 200535328801提供了生产丁醇的方法，其中通过使用为食物残渣以 及日本白酒酒糟和水的制剂制备培养物溶液，并在此培养物溶液中进行丁醇发酵。日本白 酒的应用将其生产试验局限在日本进行。法国专利FR2550222提供了两段法，其中在第一阶段接种丙酮丁醇梭菌，在第二 阶段接种产生乙醇的酵母，当第一阶段的发酵培养基PH达到最小值时，开始进行第二阶 段。此发明特别适合于从甜菜和菊芋汁(Jerusalemartichoke juices)生产丁醇、丙酮和 乙醇。此方法需要预处理，因此较为繁琐。尽管有报道称已开发出用于发酵生产丁醇的微生物，但尚未开发出用于生产丁醇 的经济可行的生物合成方法(Jesse et al，2002)。Mustafa等人提供了用于在线监测丙酮_ 丁醇发酵法的与顺序注射分析偶联的中 红外分光法。这涉及使用很多实验室尚无法获得的高度精密仪器/技巧(Mustafa K. et al. , Spectroscopy Letters，38，677-702 (2005))。用于在线状态评估复杂发酵(丁醇_丙酮发酵)的气相色谱和通路传感器显示了 这样的发酵系统，该系统已设计用于证明气相色谱在丁醇-丙酮和其他复杂糖分解发酵的 在线监测中的应用(McLaughlin JK,Meyer CL,Papoutsakis ET. (1985)Biotechnology and Bioengineering Volume 27，Issue 8，Pages 1246-1257)。然而，表征发酵状态的参数包 括葡萄糖浓度和气体组成以及很多无法观察的参数(例如，YATP、过量ATP和FdH2还原的 NAD)。因此，此方法需要监测大量参数，因此非常繁琐。美国专利4521516、4520104、4560658、4649112 公开了测定丁醇的 HPLC 方法，其中 通过使用0.006N H2SO4W氢型阳离子交换树脂洗脱，对各种组分进行色谱分析。利用差示 折射仪检测洗脱的组分，在记录器上绘图，并使用电子积分器定量。将代表每种组分浓度的 曲线下面积表示为总面积的百分比。“Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography"，Am. Soc. Brew. Chem. Proc, 1973,pp. 43-46 中给出 了所依照的一般程序。 在 1-英尺 HPX-87 氢型柱(可从 Bio-Rad Laboratories，Richmond，Calif 获得)上进行分 离。通过Dubois等人详细描述的苯酚/硫酸法(〃 Colorimetric MethodDetermination of Sugars and Related Substances"，Anal. Chem.，28，350-356 (1956))测量发酵培养基 中的总残留碳水化合物(RTC)。因此，上述这些通常使用GC评估丁醇的方法(Bryant and Blaschek, 1988)需要 在分析样品之前，在己烷或其他溶剂中提取或衍生化丁醇。这使所述方法非常繁琐，而且在 提取或衍生步骤中可能有一些损失。现已报道了多种用于评估丁醇的HPLC方法(Ehrlich et al.，1981)。但是，即便在这些方法中，用于检测丁醇的运行时间也很长(30-50分钟)。 因此，此类方法不能用于分析大量的样品。发明目的由于需要提高丁醇生产产量的方法，本发明提供了用于野生型梭菌菌株的理想培 养条件，其获得增强的丁醇耐受性，并随后提高丁醇的产量。由于需要开发用于分析发酵期间丁醇的方法，本发明提供了通过HPLC进行丁醇
7分析的有效且强力的方法，其克服了与已知的丁醇分析法相关的缺陷。本发明提供了简 单且节约成本的HPLC方法，其中能够在短保留时间内完成丁醇的定量评估，而无需进行提 取。本发明已成功地改进了分析速率，从而有效地监测发酵过程。本发明的目的是提供使用丙酮丁醇梭菌高产量地生产丁醇的改进方法，而该微生 物菌株没有发生任何变化。本发明的目的是提供使用丙酮丁醇梭菌用于增强丁醇生产的最佳发酵条件。本发明的目的是提供具有最佳发酵条件的方法，其使微生物对丁醇的耐受性增 强。本发明的目的是提供用于高产量丁醇发酵的培养条件。本发明的目的是提供用于在单批次发酵条件下提高丁醇产量的方法。本发明的目的是提供使用各种生物质生产生物丁醇的方法。本发明的目的是提供节约成本且可在工业规模实施的丁醇生产方法。本发明的目的是提供用于定量评估丁醇的简单、快速且可靠的HPLC方法。本发明的目的是提供用于测定发酵过程中丁醇的节约成本的HPLC方法。本发明的目的是检测发酵液中的丁醇，其可应用于在常规基础上的大量样品分 析。

发明内容
本发明涉及使用丙酮丁醇梭菌高产量地生产丁醇的有效方法，该微生物菌株没有 发生任何变化而导致丁醇的生产增加。本发明的具体目的是提供导致微生物对丁醇的耐受 性提高的最佳培养条件。本发明的另一个目的是提供节约成本且可在工业规模实施的丁醇 生产方法。与丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌(C. beijerinckii)的ABE发酵相关的问题之一是丁 醇对培养物的毒性。这种毒性导致需要在工艺中连续除去毒性产物，以获得溶剂的最高产 量。本发明的新的方面在于，在单批次方法中高产量(多达20g/L)地生产丁醇，而无需除 去所生产的丁醇。此方法不涉及包括添加营养物的额外步骤的任何补料步骤。也没有为达 到这一高产量所需的任何溶剂分离。与使用连续发酵模式从而增大了污染机会的很多报道 方法不同，本发明的方法在单批次模式中完成。对培养基和驯化的仔细优化获得了能够在 培养液中产生高产量的丁醇并耐受其的菌株。因此，所有这些参数使本发明的方法更加节 约成本。此外，本发明的发明人还成功地以5L规模证明了此方法。一方面，本发明提供了提高丁醇耐受性而无需改造菌株的方法。在一个优选方面， 本发明提供了在本发明的用于提供提高丁醇产量的方法中所涉及的优化培养基条件下对 约2. 5%丁醇浓度的耐受性。对丁醇耐受性高的最可能的原因可能是所述方法优化获得了 最终的生理化学条件组，在该生理化学条件组下上文所述的限制得到了缓解。例如，在优化 条件下，氧化还原电位、渗透压、电子流动可能发生改变。在优化条件下可能激活或诱导丁 醇耐受性和丁醇生产所需的某些酶类。在优化工艺的过程中可调整培养物以获得高丁醇水 平。在一方面，本发明提供了丁醇产量提高的方法。一方面，本发明报道与初始未经优 化的AT培养基(50ml)相比，在包含300ml优化的厌氧糖(AnS)的500ml厌氧瓶中丁醇生产增加高达9倍。一方面，本发明提供了评估使用各种生物质生产的生物丁醇的方法。在一个优选 方面，使用麻风树籽和香蕉茎。还研究了使用在不同条件下例如碱性、酸性和微波消解条件 下预处理的种子和茎时的生物丁醇产量。一方面，本发明提供了可按比例扩大为大规模生产的方法。以下附图构成本发明说明书的一部分，并用于进一步证明本发明公开内容的某些 方面，通过参考一副或多幅附图并结合本文详述的具体实施方式
，能够更好地理解这些方 面的发明。本发明公开提供了使用HPLC定量评估丁醇的简单、有效且可重复的方法。为了获 得少于传统方法的保留时间，研发了用于HPLC的条件。这有助于减少评估丁醇的时间，并 且还有利于有效地监测发酵进程。所开发的HPLC法还可用于大量样品的常规分析。本发 明特别提供了在发酵过程中测定丁醇的HPLC方法。本发明的一个实施方式利用选自一系列离子交换柱的柱。本发明的一个实施方式利用测量折射率的检测器系统。本发明涉及通过简单的HPLC方法在发酵过程中测定丁醇。由于分析无需任何产 物提取，而且注射所需的样品是发酵培养基的上清液，因此，此方法非常简单。样品的分析包括丁醇的检测，其线性高达2.5%。此方法可用于丁醇的定量和定性 评估。此方法特别用于检测发酵液中的丁醇，其可应用于在常规基础上的大量样品分析。


图1 显示在接种84小时后，不同pH对丙酮丁醇梭菌的丁醇生产的影响。观察到，虽然在pH 5.0-7.0的范围内产生丁醇，但最佳生产pH为6. 5，其在84小 时内产生3. 2g/l的丁醇。图2 显示在接种84小时后，不同温度(V )对丙酮丁醇梭菌的丁醇生产的影响。不同温度(25°C、33°C、37°C、39t^P45°C)的影响结果显示，在37士2°C下84小时 产生3.0g/l的丁醇。然而，在25°C和55°C，没有观察到明显的丁醇生产。图3 显示不同碳源(2% )对丁醇生产的影响。当研究营养因素的影响时，观察到所测试的碳源均无法生产如在葡萄糖对照中那 样多的丁醇(3. 2gL_i)。其次，麦芽提取物在84小时中产生2. 4gL_i的丁醇。图4 显示不同的葡萄糖浓度对丁醇生产的影响。发现2. 0% w/v的葡萄糖浓度获得了 3. 丁醇的最大产量。图5 显示不同的麦芽提取物浓度对丁醇生产的影响。改变培养基中次优糖源麦芽提取物的浓度(1. 0-10% )。在AnS培养基中添加5% 麦芽提取物和2%葡萄糖时，产生4. SZgL-1的丁醇。图6 显示不同氮源(1. 0% )对丁醇生产的影响。发现牛肉提取物是所检测的各种氮源中的最佳氮源，其产生5. 2gL_i的丁醇。图7 显示不同浓度的牛肉提取物对丁醇生产的影响。浓度优化显示5. 0% w/v牛肉提取物对丁醇生产是最佳的(7. SgL—1)。图8 显示不同金属离子(0. 5% )对丁醇生产的影响。
当至此所优化的培养基补充有0.5% Na2CO3时，获得了 丁醇生产的显著增加 (11. lgL—1)。其次，钙离子获得了 9. 的丁醇生产。金属离子如Cu没有获得任何量的丁
醇生产。图9 显示不同浓度的碳酸钠对丁醇生产的影响。观察到0. 5% w/v的Na2CO3对丁醇生产是最佳的(11. OgL"1)。图10 显示接种密度对丁醇生产的影响。观察到在的接种密度产生14. SgL"1的丁醇。然而，当接种密度增加到超过2% 时，丁醇的生产下降。图11 显示5L规模的丁醇发酵谱5L规模的发酵谱表明在较大规模下的丁醇生产快得多，在48小时达到20g/L，此 后达到平台期。图12 显示丁醇对未经优化的AnS培养基中丙酮丁醇梭菌生长的影响。图13 显示丁醇对优化AnS培养基中丙酮丁醇梭菌生长的影响。图14 显示用于检测GroEL的蛋白质印迹分析的结果。图15 显示标准丁醇的HPLC色谱。图16 显示存在于样品(发酵液)中的丁醇的HPLC色谱。
具体实施例方式定义本文使用的术语丁醇或生物丁醇是指正丁醇。本文使用的术语丁醇耐受是指细菌在培养基中存在> 1. 3%丁醇的条件下存活并 生长的能力。术语丙酮丁醇梭菌是指具有在厌氧发酵中生产丁醇以及丙酮和乙醇的能力的细 菌。本文使用的术语产量是指在发酵液中产生的丁醇的量(g/L)。本文使用的术语HPLC是指高压液相色谱。本文使用的术语“杂质”是指在此方法期间产生的如丙酮、乙醇等的副产物。生产丁醇的方法由于pH是影响生长和与生长相关的分子生产的重要因素之一，因此对不同pH 下的丁醇生产进行检测。在本发明中，使用丙酮丁醇梭菌生产丁醇的最佳PH为6. 5。这 与Robson and Jones (1982)的发现相符，Robson和Jones报道丙酮丁醇梭菌P262在pH 5. 0-6. 5的范围显示出良好的溶剂生产水平。与此类似，Bielbl (1999)报道拜氏梭菌NCIMB 8052在pH 5. 5显示出的生长和溶剂生产比在pH 5. O或以下的情况好很多。本发明发现37士2°C的温度是由丙酮丁醇梭菌ATCC 10132生产丁醇的最佳温度。 这不同于 McCutchan and Hickey (1954)的早期发现，McCutchan 和 Hickey 报道与 30_33°C 时相当稳定的产量31%相比，梭菌在37°C的溶剂生产减少(至多23% )。研究了碳源对丙酮丁醇梭菌ATCC 10132的丁醇生产的影响，观察到葡萄糖支持 最高的丁醇生产。其次的次优碳源为麦芽提取物。然而，如甘油和蔗糖的碳源也支持适量的 丁醇生产。该菌株完全不能利用如鼠李糖的糖类。最可能的原因是该菌株不能转运2-脱氧葡萄糖。对糖浓度的研究表明2%的葡萄糖支持3. 的丁醇生产。Biebl (1999)的报道 与此类似，其观察到在包含2. 8%葡萄糖的培养基中，丙酮丁醇梭菌ATCC 824的丁醇生产 最高。然而，在大多数研究中，发现6-7%是丁醇生产的最佳葡萄糖浓度。在此方面，Parekh 等人(1998)报道，在包含6.0%葡萄糖的培养基中培养90小时后，拜氏梭菌菌株8052产生 10. Og/1 的丁醇。随后，在一定的范围内(1.0-10%w/v)改变培养基中的麦芽提取物水平，同时保 持葡萄糖浓度恒定(为2%)时，由5%的麦芽提取物产生了 4. Sg!/1的丁醇。与此类似， 还有很多其他工作者研究了营养限制对溶剂生产的启动和维持的影响。例如，Long等人 (1984)报道了当限制碳源浓度时，使用丙酮丁醇梭菌P262的分批发酵仅产生酸。在向培养基中补充5%牛肉提取物后，产生最大SJgr1的正丁醇，与此相比，在对 照(1%蛋白胨)中观察到4. SgL—1的丁醇生产。牛肉提取物成为优良氮源的最可能的原因 是，因为其不仅提供氮，而且还提供维生素和微生物生长所必需的其他营养素。已知金属离子在维持细胞代谢和酶活性方面发挥重要的作用(Isar et al, 2006)。当至此所优化的培养基补充有Na2CO3时，获得了丁醇生产的显著增加。其原因可 能是因为Na+是参与厌氧途径的大多数酶的辅助因子。Strobelet al. , (1991)和Lee et al. , (2000)报道了钠离子是营养摄取的重要因素。这些离子参与跨膜PH梯度的形成、细 胞运动和细胞内的PH调控。在所研究的不同钠离子盐中，发现碳酸盐和碳酸氢盐是用于生 产的最有效的基团，产生约11. 的丁醇。1-2%的接种密度变化对丁醇生产没有显著影响。然而，接种密度增加超过2%导 致溶剂生产下降。最可能的原因是当接种量的提高超过2%时，出现营养限制。本发明提供了不同生理和营养参数对丙酮丁醇梭菌ATCC 10132的丁醇生产的 影响。最初，此菌株在替代巯基乙酸培养基(Alternate Thioglycollatemedium)中84 小时内产生O^gL—1的丁醇。然而，当进行工艺优化时，在pH6.5，37°C的静态条件(间歇 的温和手动振荡)下，于96小时内在300ml优化AnS培养基中产生20. OgL"1的丁醇，其 中所述优化AnS培养基由葡萄糖(2% )、牛肉提取物(5% )、麦芽提取物(5%)、酵母提 取物(0. 5% ), K2HPO4(0. 3% ), Na2CO3(0. 6% ), (NH4)2S04(0· 1% ), CaCl2. 2H20(0. 02% ), MgCl2. 7H20(0. 02% )、Na2S(C). 002% )组成。有趣的是，还发现此菌株在优化培养基和条件 下耐受2. 5%的丁醇。在300ml培养基中对此方法的验证表明此方法能够按比例扩大到较大的规模，并 可产生约20. OgL-1的丁醇。这种产量提高的最可能的原因可能是与较小的罐相比，体积较 大的罐中可获得更大的顶部空间。用于本发明的梭菌菌株显示对2. 5%丁醇的耐受性。对丁醇耐受性高的最可能的 原因可能是所述方法优化获得了最终的生理化学条件组，在生理生化条件组下克服了上文 所述的限制。例如，在优化条件下，氧化还原电位、渗透压、电子流动可能发生改变。在优化 条件下可能激活或诱导丁醇耐受性和丁醇生产所需的某些酶类。在研究(优化工艺)的过 程中可调整培养物。由于此前从未报道过此菌株的实际耐受水平，这也可能是此菌株尚未 发现的固有性质。在一些情况下，据报道通常不产生生物分子的菌株在工艺优化后开始产 生显著量的生物分子(Isar et al，2006)。
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进一步研究了在上述条件下各种生物质在丁醇生产中的应用。具体而言，所研究 的生物质是麻风树籽饼和香蕉茎。在将其用于丁醇生产前，对生物质进行各种预处理。这 些预处理使来自生物质的糖类可用于发酵。预处理包括进行真菌降解、酸处理、碱处理或微 波消解。将麻风树籽饼与真菌培养物白腐菌(Pluroteous osteratus) 一起在23°C下培养 一个月，并使用缓冲液提取生物质。提取后，将不同浓度(1%、3%、5%和10%)的生物质 作为含有0. 5%碳酸钙的厌氧糖培养基中的补充剂使用。使用3%经真菌预处理的麻风树 籽饼，在48小时后获得8. 4g/l的丁醇产量。除此之外，在向补充有0.5%碳酸钙和4%牛肉提取物的AnS培养基中添加大 豆粉时，在96小时后获得了 10. 5g/L的最大丁醇产量。还对用氢氧化钠预处理的香蕉茎和麻风树籽进行了试验。将经碱处理的生物质以 不同的浓度补充到含有0.5%碳酸钙的AnS培养基中。在补充时，与由预消化麻风树籽 饼产生的5. Og/L 丁醇相比，在包含预消化香蕉茎的AnS培养基中获得了 8. lg/L 丁醇的产量。对于补充经微波消解的生物质，在向含有0. 5%碳酸钙的AnS培养基添加2%经微 波消解的香蕉茎时，在84小时后获得了 6. 9g/l的丁醇产量。补充经微波消解的麻风树 籽饼时，在84小时后获得了 7. Og/Ι的丁醇。向0. 5%碳酸钙的AnS培养基补充经0. IN硫酸处理的生物质，在香蕉茎的情 况下，在84小时后获得了 5. Og/Ι的丁醇产量；在麻风树籽饼的情况下，在84小时后获 得了 4. Og/Ι的丁醇产量。通过HPLC定量丁醇的生产本发明涉及HPLC方法在丁醇定量评估中的应用，其耗时短，成本低，工业可行性 高，与现有技术中可用方法的运行时间(30-50分钟)相比，指示正丁醇存在的运行时间短 得多，为7. 3分钟。导致运行时间减少的因素是流动相溶剂乙腈和0. 5mM H2SO4的最佳组合 (1:9)。流速也已被优化至1.5ml/分钟。此方法特别用于检测发酵液中的丁醇，其可应 用于在常规基础上的大量样品分析。本发明涉及开发用于评估通过使用丙酮丁醇梭菌ATCC 10132进行厌氧HPLC系统 上使用PRP 300X (Hamilton)柱评估丁醇，其中在37°C下使用乙腈和0. 5mM H2SO4 (1 9)作 为流动相，流速为1. 5ml/分钟。使用RI作为检测器。如上文所述，在此前有关应用HPLC的报道中，评估丁醇的运行时间长达30-50分 钟，使得难以分析大量的样品。类似地，报道用于评估丁醇的GC方法需要样品的提取或衍 生化，其能导致操作损失。迄今为止，尚未公开显示HPLC的应用将丁醇的评估时间减少至30分钟以下的报 道。本发明的发明人现已开发出提供低至7. 6分钟的样品检测运行时间且不需要任何提取 程序的方法。本发明的重要性在于其有效检测存在于发酵液中的丁醇所花费的时间非常短 (7. 3分钟)。因此，可在非常短的时间内在常规基础上分析大量样品。以下实施例用于说明本发明的优选实施方法。本领域技术人员应理解，在下述实 施例中公开的技术表明本发明的发明人发现的技术能够充分地实施本发明，因此可被视为 构成实施本发明的优选方式。然而，本领域技术人员也应理解，在本发明公开的基础上，对
12所公开的具体实施方式
进行的各种改变仍能获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精 神和范围。
实施例实施例1 生物和生长条件丙酮丁醇梭菌ATCC 10132生长在包含50ml厌氧糖(AnS)培养基的125ml厌 氧瓶中，所述AnS培养基具有以下组成(gL—1)葡萄糖(20.0)、蛋白胨(10.0)、酵母提取 物(5. 0)、K2HPO4 (3. 0)、NaCl (1. 0)、(NH4) 2S04(1. 0)、CaCl2. 2H20 (0. 2)、MgCl2. 6H20 (0. 2)和 Na2CO3 (1. 0)，pH 6. 5。将所述培养基在由丁基橡胶塞密封的玻璃瓶中灭菌(15分钟，121°C )。在顶部空 间中充满N2,并添加Na2S. 9H20(0.02% )以除去痕量的溶解氧(Samuelov et al. 1991 ；Lee et al.，2000)。使用2%的接种量接种还原的培养基，并在间歇温和振荡下在37士 1°C下培 养96小时。实施例2 评估丁醇的方法在所需的培养期后，使用一次性无菌注射器从密封小瓶中取出培养物，并以 8000Xg在Eppendorf离心机(型号54151)中离心10分钟。将上清液过滤通过0. 45 μ的 滤器。在37°C下，使用乙腈和0. 5mM H2SO4 (1 9)作为流动相，以1. 5ml/分钟的流速在PRP 300X 柱(Hamilton)上通过 HPLC(EhrIich et al，1981)分析样品(20 μ 1)。使用 RI 检测 器检测丁醇。实施例3:分批发酵方法用于丁醇生产的各种测试培养基是厌氧糖(AnS)培养基(Isar et al.，2006)； 强化梭菌(RC)培养基(Lin and Blaschek，1983)；可溶淀粉培养基(SSM) (Moreira et al. ,1981)；替代巯基乙酸(AT)培养基(Lin and Blaschek, 1983) ；土豆淀粉培养基(PSM) (Fouad et al.，1976)。AnS是所测试的培养基中最好的一种，获得3. 2g/l的丁醇(表1)。 在AnS培养基中优化丁醇生产，其中研究了不同生理和营养参数的影响。表1 不同培养基中的丁醇生产(g/1) 随后，在选择用于丁醇生产的培养基中研究pH(5-7)和温度(25-45°C )的影响。 发现用于生产的最佳PH是6. 5，在84小时内获得3. 2g/l的丁醇(图1)。不同温度(25°C、 33°C、37°C、39°C和45°C )的影响结果显示，在37士2°C下84小时产生3. Og/Ι的丁醇(图 2)。对最大丁醇生产所需的营养参数包括碳源、碳源、金属离子进行优化。所采用的各 种碳源包括培养基中浓度为2. 0% w/v的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽提取物和甘油。在 84小时中，其他碳源均没有获得与葡萄糖一样多的丁醇生产(3. 2gL_i)(图3)。此外，2.0% w/v的葡萄糖获得了 3.28广的最高丁醇产量(图4)。类似地，在AnS培养基中添加5%麦 芽提取物和2%葡萄糖时，产生4. SZgL-1的丁醇(图5)。对于氮源的优化，将培养基中的蛋白胨(1% w/v)替换成相同浓度的不同无机氮 源(磷酸氢铵、氯化铵、硝酸钠和尿素)和有机氮源(酵母提取物、牛肉提取物、玉米浆和胰 化蛋白胨)。发现牛肉提取物是最好的氮源，其产生5. 28广的丁醇(图6)。浓度优化显示 5. 0% w/v牛肉提取物对丁醇生产是最佳的(7. SgL-1)(图7)。为了评估金属离子的影响，分别向培养基中添加0.5%浓度的不同金属离子(Na+、 Mg+\Ca+\Zn+\K\Mn++)的碳酸盐/硫酸盐/氯化物盐。当至此所优化的培养基补充有0. 5% Na2CO3时，获得了丁醇生产的显著增加(11. lgL—1)。如Cu的金属离子没有获得任何量的丁 醇生产(图8)。 在所研究的包括氯化物、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐的各种钠盐中，碳酸盐对生产最 为有效，其产生11. 28广的丁醇(表2)。此外，当优化Na2CO3W浓度时，发现0.5% w/v对 丁醇生产是最佳的(图9)。表2 所选金属离子的不同盐对丁醇生产的影响 研究了接种量对丁醇生产的影响。使用不同的接种量(1-10% )接种优化培养基。 发现的接种量获得了最大的丁醇产量(14. SgL-1)(图10)。然而，当接种密度增加到超 过2%时，丁醇的生产下降。实施例4 丁醇耐受性的测定
评估本研究所用菌株的丁醇耐受水平。将此菌株接种到50ml包含不同浓度丁醇 (0. 5%,1.0%U. 3%U. 5%U.8%,2. 0%,2. 5% )的优化AnS培养基中。将培养瓶在带有 间歇温和手动振荡的静态条件下，于37°C下培养96小时。发现此菌株耐受培养基中高达 2. 5%的丁醇。实施例5 在300ml培养基中验证此方法在包含300ml优化培养基的500ml厌氧瓶中验证优化培养基中的丁醇生产。在无 菌条件下，借助注射器向培养瓶中添加的接种量，并在37°C下培养96小时。最多获得 20EU1的丁醇生产。实施例6 将生物丁醇生产按比例扩大至5L的规模在IOL的发酵罐(Bioflow IV, NBS, USA)中，将在优化培养基中使用丙酮丁醇梭菌 ATCC 10132的丁醇生产按比例扩大至5L的水平。将优化的AnS培养基在110°C下原位灭 菌15分钟。以2%的接种量接种培养基(0D660nm 0. 6)，并在37 士 1°C下进行发酵84小 时。先将推动器转速调至IOOrpm，并首先用压缩的无菌N2冲洗30分钟以产生厌氧环境，随 后，将压缩的无菌N2以0. 5vvm的速率向发酵罐中间歇喷入。以12小时的间隔周期性地收 集样品，并使用HPLC和GC分析丁醇生产。连续监测并调控例发酵参数如温度、N2供应和振 荡速率。在发酵罐中，从第24小时开始丁醇生产，并在48小时产生20. SgL"1的最大丁醇生 产。此后，丁醇的生产没有显著增加(图11和表3)，表明在较大规模下丁醇的生产时间显 著减少。表3:5L规模的发酵谱 实施例7 对用于生物丁醇生产的各种生物质的研究表4中列出了使用各种生物质获得的结果。1.使用真菌培养物白腐菌预处理的麻风树籽
将精细粉碎的麻风树籽(100g，目径约50mm)悬浮在50ml基础盐类培养基(0. 5% 葡萄糖、0. ΚΗ2Ρ04、0· O5^MgSO4. 7Η20、0· 05%KC1、0. O5%酵母提取物)中。向其中添加 母液 I 和母液 π 各 50ml (母液 I :0. 02% FeSO4. 7H20 ；母液 II :0. 016% Mn (CH3COO)2. 4H20、 0. 004% Zn(NO3)2. 4Η20、0· 1% Ca (NO3) 2. 4Η20、0· 006% CuSO4. 5Η20)。将全部混合物在 121°C 下用高压锅处理30分钟，并接种含2周龄白腐菌(在25°C生长)的5-6个麦芽提取物琼脂 小块。将烧瓶在23°C下培养30天。培养后，加入500ml 50mM的柠檬酸缓冲液(pH 5. 0)，并 通过旋转混合器(200rpm)将内容物充分振荡混合。使用平纹细布(muslin cloth)压榨烧 瓶的内容物，并将不同浓度(1%、3%、5%和10% )的固体生物质作为补充剂添加到125ml 密封厌氧瓶中含有0. 5%碳酸钙的50ml厌氧糖(AnS)培养基中。使用3%经真菌预处理的 麻风树籽饼，在48小时后获得8. 4g/l的最大丁醇产量。除此之外，在向补充有0.5%碳酸钙和4%牛肉提取物的AnS培养基中添加大 豆粉时，在96小时后获得了 10. 5g/L的最大丁醇产量。2.通过氢氧化钠降解法预处理的香蕉茎和麻风树籽(a)将香蕉茎切成小块，并在间歇温和振荡下，将这些香蕉茎块在500ml 0. 5M NaOH中静置24小时。24小时后，使用自来水冲洗这些小块以除去碱，并以不同的浓度将其 添加到含有0. 5% CaCO3的AnS培养基中，以研究其对丁醇生产的影响。在包含预消化 香蕉茎的AnS培养基中获得了 8. lg/L的最高丁醇生产。(b)把麻风树籽精细粉碎，并放入500ml 0. 5M NaOH中，在室温下放置24小时。24 小时后，使用自来水清洗这些小块以除去氢氧化钠。将不同浓度的经预处理的麻风树籽饼 添加到ANS培养基(包含0. 5%碳酸钙)中。向含有0. 5%碳酸钙的AnS培养基中添加1 % 的预处理麻风树籽时，最高产生5. Og/L的丁醇。3.香蕉茎和麻风树籽的微波消解(a)将香蕉茎切成小块，并在微波炉中部分消解10分钟。将消解的香蕉茎在混合 器中粉碎并再将精细粉碎的香蕉在微波中消解5分钟。通过DNS法分析糖。在向含有0. 5% 碳酸钙的AnS培养基添加2%经微波消解的香蕉茎时，在84小时后获得了 6. 9g/l的最大丁
醇产量。(b)将精细粉碎的麻风树籽(20g)添加到500ml蒸馏水中，并在微波炉中煮10分 钟。将微波处理的麻风树籽冷却，并再次在微波炉中处理10分钟。通过DNS法分析糖。结 果显示，在补充0. 5%碳酸钙和0. 5ml甘油的AnS培养基中使用1 %经微波处理的麻风树籽 饼时，在84小时后获得了 7. Og/Ι的最大丁醇产量。4.使用0. IN硫酸预处理的香蕉茎和麻风树籽(a)将香蕉茎切成小块。将这些香蕉茎块中的约IOOg在500ml 0. IN硫酸中放置 24小时。随后使用自来水清洗这些小块，并彻底干燥。将不同浓度的所述预处理的香蕉茎 添加到包含0. 5%碳酸钙的ANS培养基中。结果显示，在向含有0. 5%碳酸钙的AnS培养基 添加酸处理的香蕉茎时，在84小时后获得了 5. Og/Ι的最大丁醇产量。(b)粉碎麻风树籽饼。使用500ml 0. IN硫酸将约50g的粉碎麻风树籽处理24小 时。24小时后，使用自来水清洗这些小块以除去硫酸。将预消解的麻风树籽饼彻底干燥。 将经预处理的麻风树籽饼以不同的浓度添加到ANS培养基(包含0.5%碳酸钙)中。使用
的预处理麻风树籽饼，在84小时后获得4. Og/Ι的丁醇产量。
表4:使用生物质生产丁醇 实施例8 丙酮丁醇梭菌ATCC 10132的溶剂耐受性通过将丙酮丁醇梭菌ATCC 10132置于生长培养基中1. 5% -3. 5%范围的各种丁 醇浓度下，来研究此细菌的丁醇耐受性。检测在未经优化的AnS培养基和优化AnS培养基 中的耐受性。在培养瓶中接种丙酮丁醇梭菌ATCC10132。接种后，将培养基在37°C下培养 144小时，并以12小时的规律间隔监测600nm的0D。结果清楚表明，野生型丙酮丁醇梭菌 ATCC 10132在未经优化的条件下能够耐受高达3.0%的丁醇(图12)，而在优化条件下能够 耐受高达3. 5%的丁醇(图13)。实施例9 丙酮丁醇梭菌ATCC 10132溶剂耐受性的机理通过筛选过表达的热休克蛋白GroEL，评估丙酮丁醇梭菌ATCC 10132溶剂耐受的 机理。将耐受丁醇的丙酮丁醇梭菌ATCC 10132菌株在包含50ml厌氧糖(AnS)培养基(包 含2. 3%丁醇)的125ml密封厌氧瓶中生长，而将未改变(un-adapted)的丙酮丁醇梭菌 ATCC 10132菌株在不含丁醇的AnS培养基中生长。将培养瓶在静态条件下于37°C培养24 小时。通过蛋白质印迹筛选过表达GroEL的细胞。在所需的培养期后，使用一次性无菌 注射器从每个容器中取出1.0ml培养物，并以10，OOrpm在4°C离心20分钟。收集沉淀并分 散在100 μ 1 0. IM Tris缓冲液(ρΗ 8.0)中。使用超声波降解沉淀，并以8500rpm在4°C下 离心1分钟。收集上清液作为粗提物。对于蛋白质电泳，使丁醇耐受株和不耐受株的粗提 物在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳。在提取物中，将提取物中的蛋 白浓度标准化。蛋白质印迹分析电泳后，将蛋白转移到0.2-μπι免疫印迹聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)上。在杂交 前，使用含5%脱脂乳的Tris-缓冲盐水和Tween 20 (TBST)将膜封闭12-16小时。以1 10，000的稀释比将封闭的膜与兔产生的抗GroEL抗体一起温育1小时。 温育后，使用TBST缓冲液清洗膜两次，每次5分钟。以1 10，000的稀释比使用在小鼠中 产生的单克隆抗兔免疫球蛋白-碱性磷酸酶(Sigma)作为第二抗体。将膜与第二抗体一起 温育1小时。所有抗体稀释液均由TBST缓冲液制备。使用TBST缓冲液清洗膜三次，每次 5分钟。使用5mlBCIP-NBT溶液(Sigma)使膜显色。溶剂耐受的丙酮丁醇梭菌ATCC 10132 菌株显示存在GroEL的明显条带(图14，第2道)，而在未改变的菌株中，几乎看不到此条
17带(图14，第1道)。实施例10 通过分馏纯化丁醇为了从发酵液中纯化丁醇，将发酵液离心以分离细胞。将上清液分馏。收集在蒸汽 温度96°C下获得的馏分，并在安装有30mX0. 53mm毛细柱DBWax 624 (J & W Scientific, USA)和火焰电离检测器的Agilent气相色谱仪上通过GC分析丁醇含量。使用N2作为载气。 将分流比设定为10 1。检测温度为300°C。将1微升样品注射(注射温度250°C )到系 统中分析。分馏回收率为47%，纯度为91% (表1)。表5:丁醇的回收 实施例11 基于HPLC的测定的通用参数(a)不同柱、流动相和RT的评估尝试使用3种不同的柱、流动相在HPLC(Shimadzu RID-10A监测器、LC-10AT泵、 LT0-10AS柱加热炉)上评估丁醇。它们包括
( )柱-Aminex HPX-87H(Biorad)检测器-折射率炉温-37 0C流动相-0. 5mM H2SO4流速-0. 6ml/ 分钟保留时间-32. 0分钟 在前两种柱中，即Rezex Organic和Aminex HPX柱中，用于评估丁醇的保留时间 分别为42分钟和32分钟。然而，在Hamilton PRP300X柱，能够在短至7. 3分钟内洗脱丁(b)在发酵的不同时间取样以跟踪反应速率，评估所述方法。在不同培养期收集样品直至第96小时，并使用PRP 300X柱分析丁醇浓度。丁醇 浓度逐步提高，直到在第84小时达到最大。此后，丁醇浓度基本保持恒定。实施例12 分析的标准化条件用于本发明的柱是Hamilton PRP 300X。流动相是乙腈0.5mM H2SO4(1 9)。检测仪器包括折射率(RI)，流速1. 5ml/分钟，37°C。样品制备使用一次性无菌注射器从密封容器中取出样品。随后，以10，OOOrpm离心这些样 品10分钟，并在分析前通过0. 45 μ滤器过滤上清液。发酵培养基的取样过程包括在所需的培养期后，使用一次性无菌注射器从密封的 厌氧瓶收集发酵液。随后，以SOOOXg在Eppendorf离心机中将培养液离心10分钟。随 后，取出上清液，通过0.45 μ滤器过滤，并将20 μ 1过滤的上清液样品注射到PRP 300Χ柱 (Hamilton)中。分析使用Hamilton注射器将样品(20 μ 1)注射到柱中。记录丁醇的保留时间为 7. 3分钟。如图15和16所示，通过测量0. 5-50g/L范围的标准丁醇(Sigma)，计算丁醇的 浓度。这些图中显示的色谱图表明，标准正丁醇在7. 3分钟的保留时间时洗脱(图15)。样 品同样显示7. 3分钟的峰，表明存在正丁醇(图16)。参考文献Agarwal, L. , Isar, J. , Saxena, R. K. (2005). Rapid screening procedures for identification of succinic acid producers.J Biochem Biophys Methods. 63 (1) 24-32.Biebl, H. (1999). Comparative investigations of growth and solventformation in ' Clostridium saccharoperbutylacetonicum ' DSM 2152 and Clostridium acetobutylicum DSM 792. J. Ind. Microbiol. Biotechnol 22:1 15-120.Ehrlieh, G. G. , Georlitz, D. F. , Bourell, J. H. , Eisen, G. V. and Godsy, Ε. M. (1981). Liquid Chromatographic Procedures for fermentation products analysis in identification of anaerobic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 42(5)878-885.Evan, P. J.，and Wang, H. Y. (1988). Enhancement of butanol formation by Clostridium acetobutylicum in the presence of decanol-olely alcohol mixedextractants. App1. Environ. Microbiol. 54 :1662_1667.Ezeji, T. C.，Qureshi, N.，Blsachek，H. P. (2007). Bioproduction of butanol from biomass :from genes to bioreactors. Curr. Opn Biotechnol. 18 :220_227.Fouad M，Abou-Zeid AA Yassein M. (1976). The fermentative production of acetone-butanol by Clostridium acetobutylicum. Acta Biol Acad Sci Hung. 27(2-3) 107-17.Herrera， S. (2004).Industrial biotechnology-a chance at redemption. Nature Biotechnol. 22(6) :671_678·Isar，J.，Agarwal，L，Saran, S.，Gupta，P. and Saxena，R. K. (2006). Effect of process parameters on succinic acid production in Escherichia coli W3110 and enzymes involved in the reductive tricarboxylic acid cycle.Can. J. Microbiol. 52(9) :893_902.Jesse, T. W. , Ezeji, T. C, Qureshi, N. and Blaschek, H. P. (2002). Production of butanol from starch based waste packing peanuts and agricultural waste. J. Ind. Microbial. Biotechnol. 29 :117_123.Jones, D. T. and Woods, D. R. (1986). Acetone butanol fermentationRevisited. Microbiol Rev. 50(4) :484_524.Lee，P. C. , Lee, W. G. , Lee，S. Y. , Chang，H. N. (1999) . Effects of mediumcomponents on the growth of Anaerobiospirillum succiniciproducens and succinic acid production. Process Biochem. 35 :49_55·Lee, P. C.，Lee, W. G.，Kwon, S.，Lee, S. Y.，and Chang，H. N. (2000). Batch and continuous cultivation of Anaerobiospirillum succiniproducens for the production of succinic acid from whey. Appl Microbiol. Biotechnol. 54 :23-27.Lin, Y Land Blaschek，H. P. (1983). Butanol production by a butanol -tolerant train of Clostridium acetobutylicum in extruded corn broth. App1. Environ Microbiol. 45 :966_973.Long, S. , Long, D. Τ. , and Woods, D.R. (1984). Initiation of solventproduction，clostridial stage and endospore format ion in Clostridiumacetobutylicum P262. App1. Microbiol. Biotechnol. 2Q :256_26LMcCutchan, W. N.，and Hickey, R. J. (1954). The butanol-acetonefermentation. Ind. Ferment. 1 :347-388.Moon, S. H. and Parulekar, S. J. (1991) . A parametric study of proteaseproduction in batch and fed-batch cultures of Bacillus firmus. Biotechnol. Bioeng. 37，467-483.Moreira, A. R. , Ulmer, D. C. , Linden, J. C. (1981). Butanol toxicity in the butylic fermentation. Biotechnol Bioeng. Symp. W :567-579.
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权利要求
用于生产溶剂的连续方法，所述方法包括在发酵罐中建立并维持培养物，所述培养物包含产溶剂微生物和营养培养基，所述营养培养基包含可同化碳水化合物和任选的添加剂；将发酵罐中的碳水化合物浓度保持在足以维持所述连续方法的水平；将所述产溶剂微生物的浓度保持在足以维持所述连续方法的水平；其中实施所述方法而不从所述发酵罐除去溶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述产溶剂微生物是丙酮丁醇梭菌ATCC10132。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述溶剂包括丙酮和丁醇中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述可同化碳水化合物是葡萄糖。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述营养培养基中的葡萄糖浓度为约2%。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述可同化碳水化合物是麦芽提取物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述营养培养基中的麦芽提取物浓度在-10%之间。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述可同化碳水化合物是葡萄糖和麦芽提取物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述营养培养基中的葡萄糖浓度为约2%，且所述营 养培养基中的麦芽提取物浓度为约5%。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵在33-39°C之间的温度下进行。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述发酵在37°C的温度下进行。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述氮源是牛肉提取物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述营养培养基中的牛肉提取物浓度为约5%。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述营养培养基中补充有0.5% Na2C03。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述营养培养基中补充有钙离子。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵导致所述发酵培养基中的丁醇浓度高于1%。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵导致所述发酵培养基中的丁醇浓度为1.0%U. 3%U. 5%U. 8%,2. 0%,2. 5%、3%或 3. 5%。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵导致所述发酵培养基中的丁醇浓度为约2.5%。
19.如权利要求1所述的方法，其中相对于未经优化的培养基，在含有可同化碳水化合 物和任选的添加剂的营养培养基存在下的发酵导致丁醇浓度提高约9%。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述培养物包含产溶剂微生物和适合的生物质。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述产溶剂微生物是丙酮丁醇梭菌ATCC10132。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述生物质包含粉碎的麻风树籽。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述粉碎的麻风树籽经过白腐菌真菌培养物的预 处理。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述培养基还包括厌氧糖培养基中的大豆粉、碳 酸钙和牛肉提取物。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述生物质选自由香蕉茎和麻风树籽组成的组。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述生物质经过氢氧化钠的预处理。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述生物质经过硫酸的预处理。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述生物质经过微波的预处理。
29.如权利要求1所述的方法，其中通过分馏分离丁醇。
30.用于快速测定发酵反应中丁醇水平的方法，所述方法包括从发酵罐中的培养物获得发酵液样品，所述培养物包含产溶剂微生物和营养培养基， 发酵工艺的结果是产生丁醇；对所述样品进行高压液相色谱(HPLC)；获得所述培养液中的丁醇水平，其中HPLC的运行时间是20分钟或更少。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述运行时间小于10分钟。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述运行时间为约7.5分钟。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述产溶剂微生物是丙酮丁醇梭菌ATCC10132。
34.如权利要求30所述的方法，其中在HPLC中使用的流动相溶剂包括比例为1 9的 乙腈和硫酸。
35.如权利要求30所述的方法，其中所述流动相的极性为5.0-6. 0。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述HPLC中的流速为约1.5mL/分钟。
37.如权利要求30所述的方法，还包括以下步骤 将所述样品离心以获得上清液；将所述上清液进行微滤；和 将滤液载入HPLC柱。
38.如权利要求30所述的方法，其中检测到的丁醇浓度高达2.5%。
39.基本如本文实施例和附图例证的以上所述的用于连续生产丁醇的方法和分析方
全文摘要
本发明提供了通过丙酮丁醇梭菌ATCC 10132高产量地生产丁醇的方法。使用通过操作各种工艺参数的分批法，此方法能够在较短的时间内完成。此方法也可用于基于生物质的丁醇生产。这为大多数化学工业从有害途径生产生物燃料到生物环保途径的战略转变铺平了道路。
文档编号C12P7/16GK101932716SQ200880122512
公开日2010年12月29日 申请日期2008年12月24日 优先权日2007年12月24日
发明者伊萨尔·贾思明, 兰加斯瓦米·威贴, 维尔玛·普拉迪普 申请人:利莱恩斯生命科学有限公司