专利名称：真核细胞中的丁醇生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够生产丁醇和乙醇的真核细胞，用于制备丁醇和乙醇的方法，和用 于从水性溶液中回收乙醇和丁醇的方法。乙醇目前是最大量的替代性(生物)燃料，其主要通过糖的大规模酵母发酵和之 后通过蒸馏分离乙醇而制成。乙醇发酵中使用的主要糖主要来自于甘蔗或玉米。因为乙醇 的价格可能大幅波动，所以存在在相同的乙醇生产设施中生产替代性产物的需要。可以在乙醇发酵过程中生产的一种有吸引力的产物是丁醇。丁醇适合用作替代性 的发动机燃料。丁醇具有比乙醇更高的贮能量(energycontent)，腐蚀性比乙醇更低，并可 可以通过现有的化石燃料管道和加油站来运输。丁醇还可用作重要的工业化学品，例如作 为多种化学品和纺织过程的溶剂，用于塑料的有机合成中，用作化学品中间产物，和在涂层 和食品和调味剂工业中用作溶剂可以使用细菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物种进行的丙 酮-丁醇-乙醇(ABE)过程，通过发酵实现丁醇和乙醇的生物合成，其中A B E的比例 一般为3 6 1。然而，Clostridium发酵不适合大规模进行，因为它们需要无菌的工艺 条件，并且通常对噬菌体感染易感。另一缺点是Clostridium发酵需要在严格的厌氧条件 下进行。真核细胞例如酵母提供了一种非常合适的替代方式，原因是因为基于真核生物的 发酵过程可以在低PH下运行，所以真核细胞对噬菌体或其它感染不易感。因此，真核细胞 的使用不需要无菌的过程，从而降低了感兴趣的产物的成本价格。从W02007/041269中已知一种生产丁醇的酵母。W02007/041269公开了重组的 Saccharomyces cerevisiae，其用至少一种编码下述多肽的DNA分子转化，所述多肽催化丁 醇途径的反应之一。然而，本领域已知的经遗传修饰的该Saccharomyces菌株生产的丁醇 量对于经济上有吸引力的生产丁醇和乙醇的方法而言仍然不足。本发明的目的是用于在真核细胞中生产丁醇和乙醇的改进的方法。根据本发明，用能够以1 2到1 100之间的丁醇乙醇比例生产丁醇和乙醇 的真核细胞实现了该目的。令人惊讶地发现，根据本发明的真核细胞可有利地用于乙醇发酵过程中，例如用 于大规模乙醇生产过程中，仅对发酵和蒸馏设备进行较小的改造或不改造，并且与其中溶 剂仅为乙醇的乙醇发酵过程中的溶剂产率相比，仅导致略微更低的溶剂(丁醇加乙醇)产 率(g溶剂/g糖)。另外，因为与乙醇相比，丁醇对真核细胞更有毒性，所以发现与其中丁醇 为唯一溶剂的发酵过程相比，除了丁醇以外还生产乙醇，得到经济的溶剂(丁醇+乙醇)产 率是有利的。根据本发明的真核细胞生产的丁醇乙醇比例优选地在1 3和1 80之间，优 选地在1 3和1 50、1 4至Ijl 40、1 5至Ij 1 30之间，优选地在1 5禾口 1 20 之间，或在1 5到1 15之间或1 6到1 14之间，或1 7到1 13之间，或更优 选地在1 8到1 12之间，更优选地在1 9到1 11之间。在本文中使用时，丁醇乙醇的比例以w/w比例为基础。惊讶地发现，当根据本发明的真核细胞以优选的比例生产丁醇和乙醇时，丁醇在 水中天然较差的溶解度可被用于从发酵液中分离丁醇。优选地，根据本发明的发酵液中真核细胞生产的丁醇量至少为0.4g/l，优选地为 0. 5g/l，优选地至少为 0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或至少 15 或 20g/l 丁醇， 并通常低于30g/l。在本文中使用时，术语丁醇被用于表示正丁醇或1-丁醇。根据本发明的真核细胞通常是重组的真核细胞。重组的真核细胞被定义为下述细 胞，所述细胞含有酵母中天然不存在的核苷酸序列和/或蛋白质，或者用酵母中天然不存 在的核苷酸序列对所述细胞进行了转化或遗传修饰，或者所述细胞含有内源核酸序列(或 蛋白质)的额外的一个或多个拷贝，或者所述细胞含有内源核酸序列的突变、缺失或断裂。优选地，根据本发明的真核细胞对丁醇和乙醇具有高度耐受。根据本发明的能够生产丁醇的真核细胞可以是包含生产丁醇的任何合适途径 的任何合适的真核细胞。一种合适的途径可以例如是Atsumi et al. (2008), Nature Letters, Vol. 451，p. 86-90公开的用于将2-酮酸降解为醇的非发酵途径。优选地，能够 生产丁醇的真核细胞包含一种或多种生产乙酰乙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、丁烯酰 基-CoA、丁酰基-CoA、丁酰基醛和丁醇的酶。催化这些产物形成的合适的酶例如是乙酰-CoA乙酰基转移酶或硫解酶 (E. C. 2. 3. 1. 9) (SEQ ID NO 1)、3_ 羟基 丁酰基-CoA 脱氢酶(E. C. 1. 1. 1. 1. 57) (SEQ ID NO :2)、3_ 羟基丁酰基-CoA 脱水酶(E. C. 4. 2. 1.55) (SEQ ID NO :3)、丁酰基-CoA 脱氢 酶(E. C. 1. 3. 99. 2) (SEQ ID NO 4)、NAD (P)H-依赖性丁醇脱氢酶(E. C. 1. 1. 1. -) (SEQ ID NO 5)和醇 / 醛脱氢酶(E. C. 1. 1. 1. 1/E. C. 1. 2. 1. 10) (SEQ ID NO 6)，丁醇途径的酶可以 是与真核细胞同源的和/或异源的。酶可例如来自Clostridium sp.例如Clostridium acetobutylicum 或 Clostridiumbeijerinckii。根据本发明的真核细胞可以是任何合适的微生物细胞，优选地是酵母或丝状真 菌。优选地，真核细胞属于 Pichia、Kluyveromyces、Candida、Saccharomyces、Yarrowia 或 Rhizopus 属。一种更优选的真核细胞属于物种 Pichia stipidis^Kluyveromyces lactis、 Yarrowia lipolytica、BrettanomycesbruxelIensiZygosaccharomyces bailiio 优 选地，根据本发明的真核细胞是酵母细胞，优选地为Saccharomyces sp.，优选地为 Saccharomycescerevisiae0优选地，根据本发明的真核细胞是包含至少一种失活的核苷酸序列的真核细胞， 所述核苷酸序列编码生产乙醇所需要的酶。优选地，至少一种失活的核苷酸序列编码醇脱氢酶。对编码酶的核苷酸序列的失活可以通过核苷酸序列(的部分)的突变、缺失或断 裂来实现。在另一个实施方案中，根据本发明的真核细胞优选地包含编码丁酰基-CoA脱氢 酶的核苷酸序列，和至少一种编码异源电子传递黄素蛋白(ETF)的核苷酸序列。根据本发 明的真核细胞中的异源电子传递黄素蛋白可以来自任何合适的起源。优选地，ETF来自与丁 酰基-CoA脱氢酶相同的起源。优选地，ETF来自原核起源，优选地来自Clostridium sp.，
4优选地来自Clostridium acetobutylicum，其中ETF包含两个亚基α亚基(SEQ ID NO: 7)和 β 亚基(SEQ ID NO 9)。优选地，根据本发明的真核细胞还包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶在 胞质溶胶中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性。可能是优选地，具有在胞质溶胶中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的 酶活性的异源酶是催化丙酮酸转化成为乙酰-CoA的酶，例如丙酮酸NADP氧化还原酶 (E. C. 1. 2. 1. 51)。或者，真核细胞包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶催化乙酸转化成为乙 酰-CoA,例如乙酰-CoA合成酶(E. C. 6. 2. 1. 1)。优选地，根据本发明的真核细胞包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶催化 乙醛转化成为乙酰-CoA，优选地为乙酰基化乙醛脱氢酶(E. C. 1.2. 1.3、E. C. 1.2. 1. 4或 E. C. 1. 2. 1. 5)。用于指出给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间关系 时，术语“同源的”被理解为表示在自然界中，核酸或多肽分子由相同物种、优选相同变种或 菌株的宿主细胞或生物生产。当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”表示在其存在的生物、 细胞、基因组或DNA或RNA序列中天然不作为一部分存在的核酸或蛋白质，或者存在于与其 天然存在的不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白 质对于引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或者是合成或重组生产的。在本文中使用时，术语“核苷酸序列”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，并且除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知 类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。 多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术 语包括特定的序列及其互补序列。因此，主链为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA 是该术语在本文中所指的“多核苷酸”。另外，包含稀有碱基(例如肌苷)或经修饰的碱基 (例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是本文所用的术语多核苷酸，其中仅指出两个例 子。应当理解，已对DNA和RNA进行了大量不同的修饰，所述修饰发挥了本领域技术人员已 知的许多有用目的。在本文中使用时，术语多核苷酸包括这些经化学、酶促或代谢修饰的多 核苷酸形式，以及病毒和细胞的特征性DNA和RNA化学形式，所述细胞尤其包括简单细胞和 复杂细胞。在另一方面，本发明涉及在根据本发明能够生产丁醇的真核细胞中提高丁醇生产 的方法，所述方法包括对能够生产丁醇的真核细胞种群进行诱变；并针对提高的丁醇生产 选择突变的真核细胞种群。优选地进行诱变，使得与初始的真核细胞种群相比，突变的真核 细胞种群的20%显示提高的丁醇生产。可以通过本领域已知的多种方法进行诱变，例如紫外光(UV)诱变、电离辐射或使 用诱变剂(mutagentia)。合适的诱变剂是甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、甲磺酸甲 酯(MMS)、硫酸二甲酯(DMS)、硝基喹啉氧化物(NQO)、亚硝基胍(NTG)、氮芥(HN2)、β -丙内 酯、亚硝酸、亚硝基咪唑烷酮(NIL)和氚标记尿苷。优选地，诱变包括将真核细胞种群在存 在NTG时孵育30到60分钟，优选地孵育40到50分钟；并针对提高的丁醇生产选择突变的真核细胞种群。优选地，将存在NTG时真核细胞的所述孵育和针对提高的丁醇生产选择突 变的真核细胞重复一次、两次或三次。优选地，根据本发明的真核细胞包含下述突变，所述突变导致与不包含所述突变 的细胞相比提高的丁醇生产，所述突变可以通过根据本发明的用于提高丁醇生产的方法获得。惊讶地发现，与未进行所述诱变的真核细胞相比，进行了本发明的提高丁醇生产 的方法的真核细胞所生产的丁醇量被提高了至少5%，优选地至少10%，优选地至少20% 或 40%。优选地，根据本发明的真核细胞是保藏号为CBS 122885的Saccharomyces cerevisiae,或保藏号为 CBS 123039 的 Saccharomycescerevisiae。优选地，根据本发明的真核细胞能够在任何合适的碳源和/或酵素上生长并将其 转化为丁醇和乙醇。合适的碳源为纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、 木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。在另一方面，本发明涉及制备丁醇和乙醇的方法，包括在合适的发酵液中发酵根 据本发明的真核细胞，其中丁醇和乙醇以1 2到1 100之间的丁醇乙醇比例被生产。 根据本发明的丁醇和乙醇制备方法中优选的丁醇乙醇比例和优选的生产的丁醇量如上 文所述。惊讶地发现，通过发酵设备的较小改变或者不改变，并且在乙醇和丁醇的回收中 不需要额外的能量需求，就可将根据本发明的方法有利地应用于大规模乙醇发酵工厂中。尽管已知真核细胞例如Saccharomyces cerevisiae生产乙醇和丁醇，但是我们首 先发现以工业规模发酵能够生产丁醇和乙醇的真核细胞是经济上有吸引力的方法。因此， 根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的方法优选地以工业规模进行。在本文中使用工业规模表示丁醇和乙醇的制备，所述制备在至少1、2、4、5、 IOm3 (立方米)，优选地至少20、30、50或至少IOOm3 (立方米)，200或500m3或至少1000到 2000m3的(发酵)体积中进行。丁醇和乙醇制备方法中的真核细胞可以是如上文所述根据 本发明能够生产丁醇的任何合适的真核细胞。根据本发明的丁醇和乙醇制备方法中的发酵液可包含特定真核细胞生长和丁醇 与乙醇的发酵生产所必需的任何合适的养分。真核细胞生长和丁醇生产的必需养分是本领 域技术人员已知的。优选地，发酵液包含碳源例如纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、葡萄糖、 半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生 物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油。碳源可来自甜菜、甘蔗或玉米，但不限于此，优选 地为含有纤维素或半纤维素的来源。优选地，发酵液包含氮源例如尿素，或铵盐例如硫酸 铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵。根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的发酵过程可以是需氧或厌氧的发酵过程。厌氧的发酵过程在本文中定义为在无氧时或者基本不消耗氧，优选地消耗少于5、 2. 5或lmmol/L/h氧时运行的发酵过程，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种 作用。根据本发明的发酵过程也可以首先在需氧条件下运行，随后在厌氧条件下运行。发酵过程也可以在氧有限的、或微需氧的条件下运行。或者，发酵过程可以首先在 需氧条件下运行，随后在氧有限的条件下运行。氧有限的发酵过程是下述过程，其中氧消耗
6受到从气体转移至液体的氧的限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵 设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧有限条件下的过程中，氧消耗速率为约 5. 5mmol/L/h，更优选地约为6mmol/L/h，进一步更优选地约为7mmol/L/h。根据本发明的生产丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的温度下进行，优选地在10 和45V之间，优选地在15和40°C之间，优选地在20和35°C之间，或在25和40°C之间。根 据本发明的生产丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的PH值下进行，例如在2和9之间，优 选地在2. 5和8之间。发酵液中的pH优选地具有低于7、6，优选地低于5. 5，优选地低于 5，优选地低于4. 5，优选地低于4的值，优选地低于pH 3. 5或低于pH 3.0,优选地高于pH
2 · 5 ο在一个优选的实施方案中，根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的方法包括从乙醇 中分离丁醇，以获得含有少于(优选地少于0. 5%w/w) 丁醇的乙醇，和包含少于 /V(优选地少于0.5%w/w)乙醇的丁醇。优选地，所述从乙醇中分离丁醇如下文所述通过 蒸馏进行。在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，从发酵液中回收丁醇和乙醇。对丁醇和乙醇的回收可以通过本领域已知的任何合适的方法进行，所述方法例如 蒸馏、吸附、真空提取、溶剂提取或渗透蒸发(pervaporation)。优选通过蒸馏从发酵液中回 收丁醇和乙醇。优选通过下文所述用于回收丁醇和乙醇的方法回收在根据本发明的丁醇和 乙醇制备方法中生产的丁醇和乙醇。在另一方面，本发明涉及从水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，所述水性溶液以 1 2到1 100之间的丁醇乙醇比例包含丁醇和乙醇，所述方法包括从水性溶液中分离 乙醇/ 丁醇/水混合物；从乙醇/ 丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/ 丁醇/ 水混合物中分离丁醇/水混合物；和回收丁醇和乙醇。惊讶地发现，根据本发明的从包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方 法可通过蒸馏设备的较小改变，有利地用于大规模乙醇发酵过程中。包含丁醇和乙醇的水 性溶液可以是任何合适的水性溶液。优选所述水性溶液是发酵液。发酵液可以以1 2到 1 100的比例包含丁醇和乙醇。优选地，通过制备丁醇和乙醇的下述方法获得发酵液，所 述方法包括发酵上文所公开的根据本发明的真核细胞。水性溶液优选地以上文确定的优选 的丁醇乙醇比例包含丁醇和乙醇。通常，从以1 2到1 100的比例包含丁醇乙醇的水性溶液中分离乙醇/ 丁 醇/水混合物通过通常在塔中的蒸馏(提馏)，在任何合适的温度下进行，所述温度可取决 于水性溶液中丁醇和乙醇的浓度和比例。优选地在塔中通过蒸馏进行乙醇/丁醇/水混合 物的分离，其中底部温度在90°C到110°C之间，优选地在95°C和105°C之间，优选地在98°C 和102°C之间，优选地在99°C和lore之间。优选地，在本发明的回收方法中用于分离(蒸 馏)乙醇/ 丁醇/水混合物的塔顶部的温度在70°C和90°C之间，优选地在75°C和85°C之 间，优选地在78 V和83°C之间，优选地在79°C和81 °C之间进行。用于蒸馏丁醇/乙醇/水 混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于乙醇/丁醇/水混合物中丁醇和乙醇的浓度和比 例，和操作压强。从水性溶液中分离的乙醇/ 丁醇/水混合物可包含任何合适的溶剂浓度。在本 文中使用时，溶剂被定义为乙醇和丁醇的总和。优选地，乙醇/ 丁醇/水混合物包含40和
780wt %之间的溶剂，优选地45和75wt %之间、优选地50和70wt %之间、优选地55和65wt % 之间、优选地58和63wt%之间的溶剂。通常，通过通常在塔中的蒸馏从乙醇/ 丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物，其 中底部温度在90°c和110°C之间，优选地在95°C和105°C之间，优选地在98°C和102°C之 间，优选地在99°C和101 °C之间。通过蒸馏分离乙醇/水混合物的塔顶部的温度在70 V和 90 V之间，优选地在75 °C和85 °C之间，优选地在78 °C和83 °C之间，优选地在79 °C和81 °C之 间。用于分离乙醇/水混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于乙醇/丁醇/水混合物中 丁醇和乙醇的浓度和比例，以及操作压强。通常，通过通常在塔中进行的蒸馏，从乙醇/ 丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合 物。优选地，用于分离丁醇/水混合物的塔的底部温度在100°C和140°C之间，例如在105°C 和 135°C、110°C 和 130°C、115°C 和 128°C 之间，118°C 和 127°C 之间，或 119°C 和 125°C 之间。 通过蒸馏分离丁醇/水混合物的塔顶部优选地具有70°C和100°C之间，例如75°C和95°C之 间，78°C和90°C之间的温度。用于分离丁醇/水混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于 乙醇/ 丁醇/水混合物中丁醇和乙醇的浓度和比例，以及操作压强。在分离乙醇/水混合物之后进行丁醇/水混合物分离的情况下，丁醇/水混合物 的分离用下述(第二)乙醇/ 丁醇/水/混合物进行，所述混合物通常包含提高的丁醇比 乙醇的比例。从乙醇/ 丁醇/水混合物中(优选地通过蒸馏)分离丁醇/水混合物可包括使部 分乙醇/ 丁醇/水混合物达到10°c和40°C之间，优选地20°C和30°C之间的温度。优选地， 达到所述温度范围的部分乙醇/ 丁醇/水混合物包含比乙醇更大量的丁醇，优选地5wt %和 90wt %之间，IOwt %和80wt %之间，20wt %和70wt %之间，优选地30wt %和60wt %之间，优 选地间的丁醇，和0. Iwt %和IOwt %之间，例如Iwt %和间的乙 醇。优选地，将冷却的乙醇/ 丁醇/水混合物加入不混溶的液液分离器中，优选地加入重力 倾析器中，所述冷却的乙醇/ 丁醇/水混合物即达到10°C和40°C之间温度范围的乙醇/ 丁 醇/水混合物。发现使部分乙醇/ 丁醇/水混合物达到10°C和40°C之间的温度是有利的， 因为这导致以较小的投资和对乙醇回收过程的改变有效地回收丁醇。在根据本发明的用于回收乙醇和丁醇的方法中，乙醇和丁醇可以以任何合适的形 式被回收。乙醇和/或丁醇可包含水，这是所谓的含水乙醇和/或含水丁醇。含水乙醇或 含水丁醇典型地包含至少水，例如至少5、10、20或30% ν/ν的水，但是通常低于 50% ν/ν 的水。或者，可以以无水形式回收乙醇和/或丁醇，即乙醇和/或丁醇包含或更 少的水。在以无水形式回收丁醇和/或乙醇的情况下，根据本发明的用于回收丁醇和乙醇 的方法还包括干燥乙醇/水混合物和/或丁醇/水混合物和/或乙醇/丁醇/水混合物， 获得无水乙醇和/或无水丁醇。干燥可以通过已知技术进行，例如共沸剂蒸馏(entrainer distillation)、分子筛、膜气相分离或渗透蒸发。根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法中，不同的蒸馏步骤和/或干燥可以以 任何合适的顺序进行。优选地，根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法包括从水性溶液 中分离乙醇/丁醇/水混合物的第一步骤。对乙醇/水混合物和丁醇/水混合物的分离可 以同时或相继进行。
根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的压强下进行，优选地 在大气压下进行。应当理解，当蒸馏期间的压强偏离大气压时，上文定义的不同混合物的蒸 馏(分离)所优选的温度范围可以改变。压强和温度之间的关系是本领域技术人员已知的。优选地，用于回收丁醇和乙醇的方法以工业规模进行。优选地，用于以工业规模回 收丁醇和乙醇的方法包括用于蒸馏的塔，所述塔可包含5到60个理论级，优选地包含10到 50个理论级，优选地包含15到30个理论级。理论级是蒸馏技术领域的技术人员的普遍理 解。优选地，用于蒸馏的塔的直径为0.5米到10米，优选地在1米和5米之间。不同的蒸 馏可包含大小不同的塔。可以纯化从水性溶液中回收的丁醇。丁醇的纯化可以通过蒸馏或者本领域技术人 员已知的任何其它分离步骤进行。以下的
展示了根据本发明的用于回收乙醇和丁醇的方法的优选的实施方案。图1显示的框图阐述了通过发酵对乙醇和丁醇的生产及其回收。设备1在水性环 境中包含能够在本领域技术人员已知的条件下生产乙醇和丁醇的真核细胞。流046由真核 细胞生产乙醇和丁醇所需要的以及真核细胞的生长所需要的所有底物组成。离开设备1的 流048是以1 2到1 100的丁醇乙醇比例包含丁醇和乙醇的水性流。流048被补入 设备2中，在设备2中溶剂从水流中被回收。大部分水作为流049离开设备2，而乙醇和丁 醇分别作为流045和047离开设备2。图2展示的框图展示了来自图1的设备2的一种优选的实施方案。包含乙醇和丁 醇的水性流010被补入塔3中。在进入塔之前，可以通过例如与流002热交换将流010预 热。在塔3中，从流010中脱去溶剂，产生不含溶剂的水性底部流002和塔3顶部富含溶剂 的蒸汽流001。塔3包含用于分离乙醇和丁醇的足量理论级。可以通过再沸器或直接注入 蒸汽对塔3供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，001应当是从接近 塔顶部处抽取的测流。将离开塔3的蒸汽流001补入塔4中，所述塔4包含通过回流在塔 顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量级别。接近共沸物的乙醇水混合物作为流003离开塔4顶 部。从塔中抽取富含丁醇的液体测流006，冷却至10-40°C后补入不混溶的液液分离器5中， 优选地补入重力倾析器中。冷却的液体会在含8-12衬％溶剂的流009和含约70-80衬％溶 剂的流007中分离。在低于测流抽取塔盘处，将009层补入塔3中，并将007层循环进塔4 中。任选地使用热流006加热其它冷流。脱水丁醇从塔4底部作为流004抽取。任选地， 更高级的醇(杂醇)从塔4中作为测流005抽取。通过再沸器对塔4供热。在丁醇流004 包含杂质的情况下，可优选将流004补入塔6中，在塔6中沸腾温度比丁醇更高的组分通过 回流作为底部流008与丁醇分离。丁醇作为塔6的顶部产物，作为流050被收集。使用再 沸器对塔6供热。图3中展示了来自图1的用于回收丁醇和乙醇的设备2的另一个优选的实施方 案。图3显示框图，其中包含乙醇和丁醇的水性流044被补入塔7中。在进入柱之前，可以 通过例如与物理036热交换而预热流044。在塔7中，从流044中脱去溶剂，产生不含溶剂 的水性底部流036和塔7顶部富含溶剂的蒸汽流035。塔7具有用于分离的足量理论级。 可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔7供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在 这种情况下，035应当是从接近塔顶部处抽取的测流。将离开塔7的蒸汽流035补入塔8中，所述塔8具有通过回流在塔顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量理论级。将接近共沸物的 乙醇水混合物作为流037从该塔顶部抽取。从塔中抽取富含丁醇的液体测流040，冷却至 20-30°C后补入不混溶的液液分离器9中，优选地补入重力倾析器中。冷却的液体会在约含 8-12衬％溶剂的流043和约含70-80衬％溶剂的流041中分离。在高于测流抽取塔盘处，将 流043循环进塔8中。将流041补入塔10中，在塔10中丁醇在回流条件下被脱水。经脱 水的丁醇作为底部流042离开塔10，任选地该流被引入分离的塔例如塔6中，以进一步纯化 产物。水和剩余的乙醇作为流038离开塔10，并且可以被循环进塔7中。任选地使用热流 040加热其它冷流。从塔8底部抽取不含溶剂的水作为流038。任选地，从塔8中抽取更高 级的醇(杂醇)作为测流039。通过再沸器或直接注入蒸汽对塔8供热。图4中展示了图1的用于回收丁醇和乙醇的设备2的另一个优选的实施方案。图 4展示了包含水性流012的框图，所述水性流012包含乙醇和丁醇，其被补入塔11中。在进 入塔之前，可以通过例如与流013热交换将流012预热。在塔11中，从流012中脱去溶剂， 产生不含溶剂的水性底部流013和塔11顶部富含溶剂的蒸汽流011。塔11包含用于溶剂 分离的足量理论级。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔11供热。任选地使用小型冷凝 器产生一些回流。在这种情况下，011应当是从接近塔顶部处抽取的测流。将离开塔11的 蒸汽流011补入塔12中，所述塔12具有通过回流在塔顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量理 论级。从该塔顶部抽取接近共沸物的乙醇水混合物作为流014。任选地，更高级的醇(杂 醇)从塔4中作为测流018抽取。离开塔12底部的流015含有大部分水和丁醇，其被补入 塔13中。由于在塔13中的回流，乙醇和一些水作为顶部流017离开该塔。从塔中抽取富 含丁醇的测流019，并且在冷却至20-30°C后补入不混溶的液液分离器14中，优选地补入重 力倾析器中。冷却的液体会在约含8-12衬％溶剂的流023和约含70-80衬％溶剂的流020 中分离。在低于测流抽取塔盘处，将023层补入塔11中，并将020层循环进塔13中。任选 地使用热流019加热其它冷流。脱水丁醇从塔13底部作为流016抽取。通过再沸器对塔 13供热。可以将流016补入塔185中，在塔15中沸腾温度比丁醇更高的组分通过回流作为 底部流022与丁醇分离。丁醇作为塔15的顶部产物，作为流021被收集。使用再沸器对塔 15供热。图5中展示了图1中设备2的另一个优选的实施方案。图5展示了包含水性流 025的框图，所述水性流025包含乙醇和丁醇，其被补入塔16中。在进入塔之前，可以通过 例如与流026热交换将流025预热。在塔16中，从流025中脱去溶剂，产生不含溶剂的水 性底部流026和塔16顶部富含溶剂的蒸汽流024。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔 16供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，024应当是从接近塔16顶 部处抽取的测流。将离开塔16的蒸汽流024补入塔17中，所述塔17具有通过回流在塔顶 部浓缩乙醇和丁醇的足量理论级。从塔17顶部抽取接近共沸物的乙醇/ 丁醇/水混合物 作为流027。将流027引入分子筛(3人)变压体系18中用于脱水。将富含水的流051补回 塔17，并将经脱水的流029补入塔19中。任选地，更高级的醇(杂醇)从塔17中作为测 流032抽取。水作为流028离开塔17底部。在塔19中，流029通过回流分为由脱水乙醇 组成的顶部流031，和由脱水丁醇组成的底部流030。使用再沸器对塔19供热。可以将流 030补入塔20中，在塔20中通过回流，更高的沸腾组分作为底部流034与丁醇分离。丁醇 作为塔20的顶部产物，作为流033被收集。使用再沸器对塔20供热。
本发明另一方面涉及下述发酵液，所述发酵液可以通过根据本发明的用于以 1 2到1 100之间的丁醇乙醇比例制备丁醇和乙醇的方法获得。本发明还涉及通过根据本发明的方法回收的丁醇和/或乙醇作为化学品或作为 燃料的用途。丁醇作为化学品的用途的例子是例如在有机化学中丁醇作为溶剂的用途，或 者作为生产丁酯或醚例如丙烯酸丁酯的原材料的用途。或者，本发明的丁醇可以被用作燃 料，例如用作燃料例如汽油或柴油的添加剂。
图1.框图，其阐述了通过在设备1中发酵和在设备2中从水性流中分离乙醇和丁 醇，生产乙醇和丁醇的方法。图2.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中 乙醇作为含水乙醇和含水丁醇被回收。图3.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中 乙醇作为含水乙醇被回收，无水丁醇以无水形式被回收。图4.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中 乙醇作为含水乙醇和含水丁醇被回收。图5.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中 回收无水乙醇和无水丁醇。以下的实施例仅用于阐述的目的，不应理解为限制本发明。 实施例实施例1构建包含adh敲除、ETF和acdh的Saccharomyces cerevisiae，和之后 的经典菌株选育(CSI)。1. 1.构建生产丁醇的酵母菌株并敲除ADHl和ADH2基因表1中列出该实验中使用的从乙酰-CoA生物合成丁醇中涉及的Clostridium acetobutylicum酶。如W02008/000632中所述，针对S. cerevisiae对该酶进行了密码子对 优化，并且其通过表1中所列的酵母启动子和终止子进行表达。在GENEART AG (Regensburg，德国)设计并合成两种酵母整合启动子(pB0L34 [SEQ ID N0:13]和pB0L36[SEQ ID NO 14])，所述启动子中每一种含有涉及丁醇生物合成的来 自pB0L34[SEQ ID NO 13]andpB0L36[SEQ ID NO 14]的六种经密码子对优化的基因中的三 种。基因ThiL、Hbd和Crt通过含有AmdS选择标记物的pB0L34表达。最后三种基因 Bed、BdhB和AdhE通过具有AmdS选择标记物的、称作pB0L36的整合载体表达。MJL 用于在s. cerevisiae中生产丁醇的基因和酶，包含启动子(IOOObp)和终止 子(500bp)。
权利要求
能够以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇的真核细胞。
2.根据权利要求1或2的真核细胞，其中所述细胞包含至少一种失活的核苷酸序列，所 述核苷酸序列编码生产乙醇所需的酶。
3.根据权利要求1到3中任一项的真核细胞，其中所述细胞包含编码丁酰基-CoA脱氢 酶的核苷酸序列，和至少一种编码异源电子传递黄素蛋白的核苷酸序列。
4.根据权利要求1到4中任一项的真核细胞，其中所述细胞包含编码下述异源酶的 核苷酸序列，所述异源酶具有在胞质溶胶中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活 性。
5.根据权利要求1到4中任一项的真核细胞，其中所述细胞是酵母，优选地是 Saccharomyces 属。
6.真核细胞，其为具有登录号CBS122885的Saccharomycescerevisiae，或具有登录 号 CBS 123039 的 Saccharomyces Cerevisiae0
7.用于提高能够生产丁醇的真核细胞的丁醇生产的方法，所述方法包括-对能够生产丁醇的真核细胞种群进行诱变；和-针对提高的丁醇生产选择突变体真核细胞种群。
8.用于制备丁醇和乙醇的方法，所述方法包括在合适的发酵液中发酵根据权利要求1 到6中任一项的真核细胞，其中丁醇和乙醇以1 2到1 100之间的丁醇乙醇比例被生产。
9.根据权利要求8的方法，其中发酵液中生产的丁醇量至少为0.4g/l。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所述真核细胞是酵母，优选地属于 Saccharomyces 属。
11.根据权利要求8到10中任一项的方法，其中从所述发酵液中回收丁醇和乙醇。
12.根据权利要求8到11中任一项的方法，所述方法还包括将丁醇与乙醇分离，获得含 有少于丁醇的乙醇和含有少于乙醇的丁醇。
13.用于从包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，其中所述丁醇乙 醇比例在1 2到1 100之间，所述方法包括从水性溶液中分离乙醇/ 丁醇/水混合物； 从乙醇/ 丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/ 丁醇/水混合物中分离丁醇/ 水混合物；以及回收丁醇和乙醇。
14.根据权利要求13的方法，其中所述水性溶液是发酵液。
15.根据权利要求13或14的方法，其中分离丁醇/水混合物包括使部分乙醇/丁醇/ 水混合物达到10°C到40°C之间的温度。
16.根据权利要求1到15中任一项的方法，所述方法以工业规模进行。
17.能够通过根据权利要求8到12中任一项的方法获得的发酵液，所述发酵液以1 2 到1 100之间的丁醇乙醇比例包含丁醇和乙醇。
18.能够通过根据权利要求8到16中任一项的方法获得的丁醇和/或乙醇作为化学品 或作为生物燃料的用途。
全文摘要
本发明涉及能够以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇的真核细胞。本发明还涉及用于制备丁醇和乙醇的方法，所述方法包括在合适的发酵液中发酵真核细胞，其中丁醇和乙醇以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例被生产，还涉及从其中丁醇∶乙醇的比例在1∶2到1∶100之间的包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，所述方法包括从水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合物；和回收丁醇和乙醇。
文档编号C12P7/16GK101970673SQ200880100437
公开日2011年2月9日 申请日期2008年7月11日 优先权日2007年7月23日
发明者恩特-凯斯特·迪克, 罗拉纳·麦德勒尼·拉姆斯多克 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司