专利名称：：一种发酵生产丁醇和丁二酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种发酵生产丁醇和丁二酸的方法。技术背景经过40亿年漫长的演化过程，地球上才形成今天精确、高效、科学、稳定的生态系统。然而，短短150年间工业体系的快速发展，不仅使全球面临严重的资源和能源危机，而且引发全球气候变暖等诸多严重社会问题，我国已经成为温室气体C02的主要贡献者，排放量己经居世界第二位，并将持续增加。C02既是对大气"温室效应"影响最大的气体，又是地球上最丰富的碳资源。人们可以通过C02减排和碳封存两种方法，同时结合提高能源生产和使用效率以及增加低碳或非碳燃料的生产和利用等手段来达到减缓大气C02浓度增长的目标。利用微生物固定C02同时代谢生产有机酸、醇等是一个非常有前景的发展领域。丁醇(Butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过140万吨。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛垸值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。发酵法生产丙酮丁醇(又称ABE发酵)曾经是仅次于乙醇的全球第二大发酵工业。20世纪80年代以后，由于化学合成技术的不断发展和国际原油价格的持续走低，丁醇发酵逐渐淡出市场。2003年以来，随着石油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，丁醇发酵工业已迎来产业复苏的大好时机。1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇，1912年魏兹曼(Weizmaiin)发现了一种梭菌ao欲Wwmflc"o^/^/cwm能够将淀粉转化为丙酮、丁醇及乙醇。迄今，用于丙酮丁醇发酵最主要的两株野生菌为丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(C/oWW&"maceto6M^//cMm，简称丙丁菌)及拜氏梭状芽孢杆菌(C/oWnW/wm6e|/e〃'"cA://)，这两种菌均为严格厌氧菌。这两株菌都能利用淀粉，但在系统发育上相距较远(George,H.ande.al,爿c柳"e,/so/rapawo/,awd6wtowo/prodwc"owAyC7o败Www6ez)'m-"cA://C7o5^〃V^'wwAw/^/ZcwmjaweC7oWn.cZ/wmawawf/6w2yr/cwm.Appl.Environ.Microbiol"1983.45:p.1160-1163)。在C.aceto^/)^cwm中，丁醇发酵可以分为两个阶段发酵初期，碳源主要转化为乙酸和丁酸；随着发酵时间延长发酵液pH下降，当底物过量、pH<4.5、乙酸和/或丁酸超过临界浓度、且磷酸盐或硫酸盐限制细胞生长时，细胞开始大量合成丁醇、丙酮和乙醇(合称总溶剂)。根据文献，在多数未经基因改造的菌株发酵过程中溶齐U比(丁醇丙嗣乙醇，质量比)基本为6:3:1(Nolling,J.ande.al,Gewomese《wewceJ,Bacteriol"2001.183:p.4823-4838)。从上面的代谢途径可以看出，厌氧发酵C.0(^0^0;&"附时，不论产酸阶段还是产溶剂阶段都会产生大量co2:根据文献，多数未经基因改造的菌株发酵过程中溶剂比(丁醇丙酮乙醇，质量比)基本为6:3:1，按此比例计算发酵生产1吨总溶剂的过程中至少可以产生1.49吨C02，同时副产一定量H2。大量发酵废气直接排放，不仅会增加环境负担，而且会降低碳源的利用率。目前对发酵废气综合利用方面的研究和应用还刚刚起步，发酵废气中C02纯度较高时，如白酒发酵(张广然，白酒发酵中的C02回收和利用，酿酒，2003.30(4):p.66-67)，可以用低压、中压或高压法直接将C02液化回收；废气成分越复杂，分离回收的成本越高。丁二酸又称琥珀酸(Succinicacid，succinate),是一种常见的天然有机酸。自1546年首次从琥珀中分离出来以后，丁二酸已经在农业、食品、医药等领域广泛应用。丁二酸是一种重要的化学品，可以用于表面活性剂、清洁剂、溶剂等领域，在食品行业中可以用作pH改良剂、风味物质或抗菌剂，也可以用作动物饲料添加剂及植物助长剂等。丁二酸在工业上也是一种重要的四碳化合物，可以转化为很多重要的化学品，如脂肪酸、1，4-丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等(Song,H.andS.Lee,/Vo凼c"o"o/swcc/w/cflc/d6少6acfen'a/々rmewto"ow.EnzymeandMicrobialTechnology.,2006.39(3):p.352-361.)，还可以作为单体用来合成生物可降解材料PBS(聚丁酸琥珀酸)和聚氨酉旨(Willke,T.andK.Vorlop,/"t/usWa/6/oco"vens/o"o/re"e而6/e7^owrcesawa/fer"a&vetocowvew"owa/c/zew&^y.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2004.66:p.131-142)。目前已有超过250种以苯为原料的化工产品可以通过丁二酸转化获得，因此丁二酸的市场需求不断增加。目前市场上销售的丁二酸都是以液化石油气或石油为原料化学法生产的。由于化学法由丁垸转化为马来酐生产丁二酸的成本过高，丁二酸的产量和销量并不高，应用领域受到很大限制；近年来由于生物技术的进步，发酵法生产丁二酸的成本不断下降，已经低于化学合成法(Willke,T.andK.Vorlop，/m^WnWZ>/oco"vera/o"o/rewewa6/emsowces<xyawate/-w<af"vetocowew"owa/c/em&^y.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2004.66:p.131-142)。而且，发酵法生产丁二酸以葡萄糖等可再生资源为原料，而且生物转化过程中可以固定温室气体C02，因此对于资源安全和环境安全都明显优于化学合成法。丁二酸是生物三羧酸(TCA)循环的中间产物，也是很多厌氧代谢过程的终产物，因此，多数微生物、动、植物都能合成丁二酸。但是能高产丁二酸的体系主要是真菌及细菌，已经发现能够生产丁二酸的菌株主要有J"awo6/o5^n7/t/mswc"'"/c^rocfwc6叫v4c"'woZa"'〃Mjswcc,"oge"M,Maf朋/^z'w/a5^cc/"/c^wWmc6wsMBEL55E，Js/erg/〃tww/ger,v4s/erg/〃tis^m〖ga^us，5^wsoc/z/am;vywzVea,丄ewZ/"wstfege"er，尸em.cz.〃/M附v/"i/^""m以及酵母菌iSacc/wfro附j;cescerev/w.ae等。前二者的石开究较多，丁二酸合成能力也较高。近年来也有很多研究者利用基因工程的方法构建重组大肠杆菌生产丁二酸。这些菌株合成丁二酸的途径不尽相同，有些主要是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应(Lee,P.,etal.,Swcc/"/cac/t/jWocw"/oww/Arec^cedybrm^^/ow/Ae■sowrce..Biotech.Bioeng.,2001.72(1):p.41-48)，有些是利用更为复杂的反应途径(Werf，M.V.d.,etal.,五"v/ro,e她///戸'o/og/ca/々cto^sq^fe"/wgAeswcc/"她/vWmCra&o(^n'"gca/-6o/^ra&々-me"她'o"m'"。6"c/〃t^/30Z.ArchMicrobiol,1997.168:p.332-342)。无论哪种途径合成丁二酸的过程中都需要二氧化碳，因此，C02的供给会影响到丁二酸的合成。有人研究过提高胞外C02供给对丁二酸合成的影响，发现C02供给抑制了v4朋mWo^W〃Mm犯cc/m'c^ra^cmy的生长，但促进了丁二酸的合成(Lee，P.,etal.，<Swcc/"/cac/d/vWmc"o"爿waera6/o—n'〃,swcc/m'cz》ro^cemve^fecteo/f/ze朋c/C6^^"pp/yg/wctwecowce/^raHow.EnzymeandMicrobialTechnology.,1999.24:p.549-554)。另外，Lee等研究发现，增加112供给也对丁二酸合成产生正面影响，而且H2:C02以体积比1:19的比例供给时对丁二酸合成的促进作用最显著(Lee,P.,etal"SW"'"/c"c/d//Wwc"'o"Z少cowcewfr(3"o".EnzymeandMicrobialTechnology.,1999.24:p.549-554)。根据化学计量式可知，每生产lmol丁二酸需要固定lmol二氧化碳，即每生产1吨丁二酸至少需要补加0.37吨二氧化碳。目前丁二酸发酵过程中二氧化碳的补给主要有两种方法一是直接通入二氧化碳，二是利用碳酸盐(如碳酸钠、碳酸钙或碳酸镁等)。这两种方法都需要增加额外的发酵成本。
发明内容本发明的目的是提供一种发酵生产丁醇和丁二酸的方法。本发明提供的发酵生产丁醇和丁二酸的方法，是在不同的体系中同时微生物发酵生产丁醇和丁二酸，并将发酵生产丁醇产生的气体通入发酵生产丁二酸的体系中。该技术方案包括两个微生物发酵系统——丁醇发酵和丁二酸发酵，前者发酵过程中释放大量C02，后者在利用葡萄糖转化为丁二酸的过程中同时固定C02，将这两个过程集成起来，丁醇发酵过程产生的C02和H2用于丁二酸发酵，既减少丁醇发酵时的废气排放，又为丁二酸发酵过程提供C02和H2，以实现碳源的循环利用和节能减排。所述方法中，所述发酵生产丁醇的微生物可为丙酮丁醇梭菌(C/o^^wmflceto6M0;//c"w)或拜氏梭菌(C/oWWaf/wm6ez)'eW"c故)，所述发酵生产丁二酸的微生物可为产琥珀酸厌氧螺菌(J"flera6/o^/r说wmswcc/m'")^oafwcew),琥珀酸放线杆菌"c""o6a"'〃wsswcc/"oge"es)，产琥珀酸巴斯德氏菌(Maf""/e/m/awcc/w/czjwWwcera)MBEL55E，黑曲霉"5perg/〃"51w/ger),烟曲霉(A/erg飾syiwZga加)，或酵母菌(iSflcc/wromycescem^'57'cre)。所述方法中，所述发酵生产丁醇的底物为玉米粉或葡萄糖，所述发酵生产丁二酸的底物为葡萄糖。所述方法中，所述发酵生产丁醇的微生物优选为丙酮丁醇梭菌(C/oWnVZ/wmflceto6i^//cMm)SB-1CGMCCNo.2287;所述发酵生产丁二酸的微生物优选为琥珀ywcc/wogewes)ATCC55618。所述方法中，所述发酵生产丁醇产生的气体经过滤除菌直接通入所述发酵生产丁二酸的发酵罐或经缓冲罐、气体流量计控制通入发酵生产丁二酸的发酵罐的量。所述方法中，所述发酵生产丁醇的培养基优选为玉米粉糊化液；所述玉米粉糊化液中玉米粉的浓度为60-90g/L;所述发酵生产丁二酸的培养基优选为每升含葡萄糖30.0-50.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g，K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g,FeS04.7H200.005g。所述方法中，所述发酵生产丁二酸的pH为5.5-7.0。所述方法中，所述发酵生产丁二酸过程流加葡萄糖补充碳源，葡萄糖浓度维持在5-50g/L(共补加葡萄糖80-120gl")。所述方法中，所述可产生C02的微生物发酵生产丁醇的初始浓度为106-107cfU/L;所述可利用C02的微生物发酵生产丁二酸的初始浓度为106-107cfo/L。所述方法中，所述发酵生产丁醇的培养基体积大于或等于所述发酵生产丁二酸的培养基体积。通过如下技术构思进行分析和实验验证得到本发明的上述技术方案1)两个大宗化学品发酵过程集成的思路；2)丁醇发酵工艺优化；3)丁二酸发酵工艺优化；4)丁醇发酵产气与丁二酸发酵耗气过程的结合；5)丁醇发酵产气量与丁二酸发酵耗气量的相符性分析，不需要增加存储单元；6)丁醇发酵尾气中的H2对维持丁二酸发酵环境提高丁二酸产量有利。本发明的方法由两个重要大宗化学品的工业发酵体系组成，并通过尾气/进气管道串联起来利用厌氧发酵玉米淀粉或葡萄糖生产丁醇、丙酮等，该过程中产生的尾气(主要是H2和C02)经过滤除菌直接通入到丁二酸发酵体系中，C02在丁二酸合成反应中被利用，而H2则可以维持丁二酸发酵体系的厌氧环境，提高丁二酸产率。该工艺的应用可以使丁二酸发酵过程中不再添加碳酸盐，而丁醇和丁二酸发酵过程效率也不受影响。本发明将产生二氧化碳的体系和消耗二氧化碳的体系集成到一个系统中进行，提高了碳源利用率和设备利用率，减少了发酵工业废气的排放，降低了发酵成本；在两个发酵体系中只需加设一根通气管道和一个空气过滤装置，就可形成集成工艺，具有设备简单，操作方便，成本低等特点。与传统的独立发酵工艺相比，本发明的方法采用的集成工艺，具有以下特征1)两个系统串联，简化了中间处理环节，降低了设备投资；2)丁醇发酵产生的气体经过简单的过滤除菌后供丁二酸发酵使用，简化了丁醇发酵尾气处理工艺；3)丁醇发酵产生的C02用于丁二酸合成反应，提高了碳源利用率，降低了丁二酸发酵的原料成本；4)丁醇发酵产生的C02和H2同时通入到丁二酸发酵体系，可以提高丁二酸得率和产率，縮短发酵周期，降低发酵成本。图1为发酵生产丁醇与丁二酸串联集成发酵工艺设计图；图中，l为丁醇发酵罐；2为丁二酸发酵罐；3为阀门；4为气体过滤器。图2为琥珀酸放线杆菌(J^'"o6flc/〃附犯cc/"oge"^)ATCC55618发酵生产丁二酸过程产物生成量变化曲线图3为丙酮丁醇梭菌(C/o^n'fifemaceto6w^"cww)SB-1(CGMCCNo.2287，中国微生物菌种保藏中心)发酵生产丁醇过程产物生成量变化曲线图4为丁二酸合成过程所需C02与丁醇合成过程产生C02的量时变曲线图具体实施方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所述的百分含量，如果没有特别说明，均为质量百分含量。实施例l、本发明发酵生产丁醇和丁二酸的筛选和效果验证本发明的发酵生产丁醇和丁二酸是分别用可产生co2的微生物发酵生产丁醇，用可利用C02的微生物发酵生产丁二酸；其生产设备简图如图l所示，图1中，1为丁醇发酵罐；2为丁二酸发酵罐；3为阔门；4为气体过滤器；丁醇发酵罐1的尾气通过阀门3和气体过滤器4通入丁二酸发酵罐2。下述实施例用丙酮丁醇梭菌(C/oWnV//wmaceto^0;//cMm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)进行丁醇发酵，用琥珀酸放线杆菌"c"wo6fl"7/usSMCcfwogewes)ATCC55618进行丁二酸发酵。1、丙酮丁醇梭菌(C7o欣Wwmaceto6w0^cwm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)的发酵种子液的获得1)丙酮丁醇梭菌(C/o欲WMmaceo^0^CMm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)的获得七八月份采集云南腾冲温泉附近植物根际的土样40份。将土样分别加入装有lOmLRCM培养基(培养基组成每升培养基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸钠3.0g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,丁醇，pH6.8)的厌氧管中，混合后，在10(TC沸水中加热90S，杀死营养体细胞，于37r温箱中培养。定期观察，挑出有气泡产生的厌氧管，应用亨盖特滚管技术，分离单菌落。将单菌落挑出扩培后，转移玉米粉培养基(质量百分含量为7%的玉米粉溶液)，37'C培养，观察发酵现象，挑出有醪盖形成的试管，总共得到产丁醇的菌株105株。对这些菌株在玉米粉培养基(质量百分含量为7%的玉米粉溶液)中，37。C进行重新发酵，对发酵醪进行液相色谱分析，比较各菌株的溶剂总产量和丁醇的比例，经发酵筛选，选出一株发酵速度快，产生的丁醇比例高的菌株，即为丙酮丁醇梭菌(C/oW〃W/Mmflceo6wO^CMW)SB-1CGMCCNo.2287。丙酮丁醇梭菌(aoWWWwwaceto6z^//cMw)SB-1CGMCCNo.2287营养细胞的形态呈两端圆形短杆状，单一或双联，有鞭毛，可运动，细胞有2.64.7X0.50.7微米。SB-1的生理生化特征鉴定按照伯杰氏细菌鉴定手册进行，结果见表l。表l.SB-1的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>蜜二糖不可以发酵甘油不可以发酵纤维素不可以发酵丙酮丁醇梭菌(C/oWn'WMmaceto6w&//cwm)SB-1己于2007年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCW.2287。对丙酮丁醇梭菌(C/o;^WwmacetoZmO;//cwm)SB-lCGMCCNo.2287进行了16SrDNA序列扩增，测序表明，SB-1的16SrDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，并在NCBI网站上进行BLAST比对。结果表明，SB-1的16SrDNA序列ClostridiumacetobutylicumATCC824(U16166.1)的16SribosomalRNA(rrn)gene的同源性为100%，与ClostridiumacetobutylicumVKPMB-4786(AM231184.1)、Clostridiumacetobutylicum6MSU(AM231182.1)、Clostridiumacetobutylicum7MSU(AM231183.1)16SrRNA的同源性均为99%。2)丙酮丁醇梭菌(C7a^Wwm。cetoZ)M&//cwn)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)种子培养①丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/wmflcetoZmO^cwm)SB-1的活化取2ml含孢子的丙酮丁醇梭菌(aoWrWwmaceto^O^CMm)冻存液，沸水热激60秒取出，冷水迅速冷却后接种到含10mlRCM培养基(每升培养基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸钠3.0g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH6.8)的厌氧管中，37°C,150rpm，培养16h得到培养液，室温放置，等待接种培养。②丙酮丁醇梭菌(C/oWn'WMwaceto6w0^cwm)SB-1的种子培养取活化好的丙酮丁醇梭菌(C/oWWwmflceto^0;//cwm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)培养液，以体积百分含量为5%接种量接种到含50mlRCM培养基的厌氧瓶中，37°C,150rpm，培养10-12h。然后再次接种到含50mlRCM培养基的厌氧瓶中(接种量体积百分含量为5%，107cfo/L)，37°C,150rpm，培养16h，得到生长至对数期的丙酮丁醇梭菌(C/oWn'c^macetok^//cwm)SB-l培养液，作为种子液。2、琥珀酸放线杆菌"c""o6ac/〃wsywcc/wogewes)ATCC55618的发酵禾中子液的获得1)琥珀酸放线杆菌(爿c""o^c/〃Mswcc/"oge"es)ATCC55618菌种活化无氧条件下由冻存管取100pi琥珀酸放线杆菌""/"o6flc/〃wwcc/"oge"es)9ATCC55618冻存液涂布到LB培养基(每升培养基含葡萄糖10.0g，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaC110.0g，pH6.5。在其中加入琼脂15.0g即为固体培养基)固体斜面进行活化，37。C培养12h后，再挑取一环菌苔接入固体LB平板，37。C培养12h后获得单菌落。2)琥珀酸放线杆菌Uc""o6a"7/^y;wcc/"ogewey)ATCC55618种子培养从步骤1)得到的LB平板上挑取一个单菌落，接种于含50mlLB培养基的厌氧瓶中，37°C，150rpm，培养16h得到生长至对数期的琥珀酸放线杆菌(Uc"wo^c/〃wswcc/"oge"es)ATCC55618培养液，作为种子液。3、发酵生产丁醇和/或丁二酸分别进行如下方法一至五的方法进行发酵生产丁醇和/或丁二酸，比较传统发酵方法和本发明方法的效果方法一、琥珀酸放线杆菌"c""o6ad〃M^cc/"oge"es)ATCC55618发酵生产丁二酸——以Na2C03调节pH并补充发酵过程所需的C02将图1所示的7升丁二酸发酵罐2中装有4升已灭菌的琥珀酸放线杆菌(^c"wo^c说us幼cc/wogewey)ATCC55618发酵培养基(每升培养基含葡萄糖30.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g,K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g，FeS04.7H200.005g)，将上述方法培养好的琥珀酸放线杆菌"c""o6flc/〃ws犯cd"ogewM)ATCC55618种子液以体积百分含量为5%(107cfb/L)的接种量接入发酵罐2中，37°C，200rpm培养80小时，发酵过程中以Na2C03调节pH为6，同时流加葡萄糖(保持发酵液葡萄糖的浓度为5-50gr1，共补加葡萄糖ioogr1)补充碳源。发酵过程中，取发酵液，用液相色谱检测丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的浓度变化。发酵过程产物生成曲线分别如图2所示；发酵60小时的主要产物浓度如表2所示，发酵80小时的主要产物浓度如表3所示，结果表明发酵60小时丁二酸浓度达到61.5g/L，发酵过程中发酵60小时消耗Na2CO360g/L;继续延长发酵时间，丁二酸浓度最高达到80.0g/L(发酵80小时)。丁二酸发酵副产物极少，能检测到的副产物仅有乙酸、乙醇和乳酸，浓度很低。表2.各方法中丁醇和丁二酸发酵体系主要产物浓度(60小时)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>方法四10.53.41.715.463.00.52.01.260.0方法五10.53.31.715.361.81.12.32.30表3.各方法中丁醇和丁二酸发酵体系主要产物浓度(80小时)实施方案丁醇发酵体系主要产物浓度(g/L)丁二酸发酵体系主要产物及碳酸盐消耗(g/L)丁醇丙酮乙醇总溶剂丁二酸乙酸乳酸乙醇补加Na2C03方法一////801.82.42.275.0方法二////671.54.21.10方法三11.03.41.716.1/////方法四11.03.51.716.282.01.22.41.275.0方法五11.03.41.716.1訓1.72.42.30方法二、不额外通入C02及添加碳酸盐时的琥珀酸放线杆菌(^c""oZ^"7/mATCC55618发酵生产丁二酸将图1所示的7升丁二酸发酵罐2中装有4升已灭菌的琥珀酸放线杆菌"c""o6ac/〃a^wcc/woge"es)ATCC55618发酵培养基(培养基同方法一)，将按照上述方法培养好的琥珀酸放线杆菌ATCC55618种子液以体积百分含量为5%(107cfU/L)接入该发酵罐2中，37°C，200rpm培养，发酵过程中以NaOH调节pH为6，同时流加葡萄糖(保持发酵液葡萄糖的浓度为5-50gr1，共补加葡萄糖100gr1)补充碳源。发酵过程中，取发酵液，用液相色谱检测丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的浓度变化。发酵60小时的主要产物浓度如表2所示，发酵80小时的主要产物浓度如表3所示，结果表明，发酵60小时后丁二酸浓度达到53.0g/L，继续延长发酵时间，发酵80小时后丁二酸浓度最高达到65.0g/L，远远低于添加Na2C03的工艺。方法三、丙酮丁醇梭菌(C/oWW^wwacWo6^y/z'CM附)发酵生产丁醇丙酮丁醇梭菌(C/o欲Wwwaceto6M&"cMm)发酵培养基(玉米培养基)玉米粉最终浓度为75g/L，糊化30min后灭菌。玉米粉的糊化方法将一定重量的玉米面放入一定体积的常温水中，搅拌均匀后浸泡5min左右，倒入已经沸腾的水中，搅拌以免糊底，使玉米粉最终浓度为75g/L。将图1所示的7升丁醇发酵罐1中装有4升预先灭菌的RCM培养基，将按照上述方法培养好的丙酮丁醇梭菌(C/o欣Wwmflceto^/^CMm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)种子液以体积百分含量为5%(107cfWL)接入该丁醇发酵罐l中，37。C静置培养。发酵尾气经过滤除菌后直接排放。发酵过程中，取发酵液，用液相色谱检测丁醇、丙酮、乙醇、总溶剂(生成丁醇、丙酮、乙醇的总量)的量变化。丁醇发酵过程产物生成量变化曲线如图3所示；发酵60小时的主要产物浓度如表2所示，发酵80小时的主要产物浓度如表3所示，结果表明，发酵60小时后丁醇浓度达到10.5g/L。丁醇发酵罐1的主要副产物为丙酮和乙醇，二者均为重要的溶剂和化学品。根据图2和图3两个体系的发酵过程代谢产物时变曲线，可以计算出丁醇发酵产生的C02量和丁二酸发酵过程消耗的C02量，结果如图4所示，结果表明丁醇发酵产生的C02量和丁二酸发酵过程消耗的C02量时变曲线基本吻合。说明，同样体积的发酵体系中，丁醇发酵产生的C02基本可以满足丁二酸发酵所需。方法四、使用本发明提供的集成工艺实现丁醇与丁二酸串联发酵如图1所示的装置，发酵罐1的尾气管道连接一个空气过滤器4后与发酵罐2的通气入口相连。其中，图1所示的7升丁醇发酵罐1中装有4升预先灭菌的玉米培养基，将培养好的丙酮丁醇梭菌(C/o欣W"maceto6^y"cwn)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)种子液以体积百分含量为5%(107cfu/L)接入发酵罐l中，37"C静置培养。图1所示的7升发酵罐2中装有4升已灭菌的琥珀酸放线杆菌发酵培养基，将培养好的琥珀酸放线杆菌(A^o6""7/M^"cdMogewM)ATCC55618种子液以体积百分含量为5%(107cfti/L)接入发酵罐2中，37°C，200rpm培养，发酵过程中以Na2C03调节pH为6，同时流加葡萄糖(保持发酵液葡萄糖的浓度为5-50gl'1，共补加葡萄糖100gr1)补充碳源。发酵过程中，取发酵罐l中发酵液，用液相色谱法检测丁醇、丙酮、乙醇、总溶剂(生成丁醇、丙酮、乙醇的总量)的量变化；取发酵罐2中发酵液检测丁二酸、乙酸、乳酸、乙醇的浓度变化。发酵60小时的主要产物浓度如表2所示，发酵80小时的主要产物浓度如表3所示，结果表明，丁醇与丁二酸集成发酵60小时后，碳酸钠添加量为60g/L，丁醇和丁二酸浓度分别达到10.5g/L和63.0g/L。延长发酵时间(发酵80小时)，丁酸和丁二酸浓度最高分别达到11.0g/L和82.0g/L。该工艺条件下丁二酸合成浓度略高于独立的丁二酸发酵。丁醇发酵(发酵罐l)的主要副产物为丙酮和乙醇，丁二酸发酵(发酵罐2)副产物为乙酸、乙醇和乳酸。方法五、使用本发明提供的集成工艺实现丁醇与丁二酸(不加碳酸盐及C02)串联发酵如图1的实验装置，发酵罐1的尾气管道连接一个空气过滤器4后与发酵罐2的通气入口相连。其中，图1所示的7升丁醇发酵罐1中装有4升预先灭菌的RCM培养基，将培养好的丙酮丁醇梭菌(C/o^7'c//wmaceto6w(y//cwm)SB-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCCNo.2287)种子液以体积百分含量为5%(107cfii/L)接入发酵罐l中，37'C静置培养。发酵罐2中装有4升已灭菌的琥珀酸放线杆菌发酵培养基，将培养好的琥珀酸放线杆菌"c""o6fl"7/w"wcc/"oge"")ATCC55618种子液以体积百分含量为5%(107cfu/L)接入发酵罐2中，37°C，200rpm培养，发酵过程中以NaOH调节pH为6.2，同时流加葡萄糖(保持发酵液葡萄糖的浓度为5-50gl"，共补加葡萄糖100gr1)补充碳源。发酵60小时的主要产物浓度如表2所示，发酵80小时的主要产物浓度如表3所示，结果表明，丁醇与丁二酸发酵60小时后，丁醇和丁二酸浓度分别达到10.5g/L和61.8g/L;延长发酵时间(发酵80小时)，丁酸和丁二酸浓度最高分别达到11.0g/L和80.8g/L。与丁醇独立发酵、丁二酸发酵体系中添加碳酸盐的结果基本一致，但该工艺条件下节约不需添加Na2C03。丁醇发酵(发酵罐l)的主要副产物为乙醇和丙酮，丁二酸发酵(发酵罐2)的主要副产物为乙酸、乙醇和乳酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>权利要求1、一种生产丁醇和丁二酸的方法，是在不同的体系中同时微生物发酵生产丁醇和丁二酸，并将发酵生产丁醇产生的气体通入发酵生产丁二酸的体系中。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇的微生物为丙嗣丁醇梭菌(C7asfn'￡//wmacetoZ>M(y//cwm)或手羊氏梭菌(C7oWnV//wm6e々'e〃'wcA://)，所述发酵生产丁二酸的微生物为产琥珀酸厌氧螺菌""aen^/(w/zW〃"mswcc/m'c^Wwcms),琥珀酸方文线杆菌"c/"oZac飾j犯cc,"oge"es),产琥珀酸巴斯德氏菌(Ma朋/ze/附/aSMcc/"/")ra血cew50MBEL55E，黑曲霉(y4，rg/〃wsw/ger)，烟曲霉(A/erg〃/Ms^m扭加)，或酵母菌(iS^cc/z(3ram少cescem^s/ae)。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇的底物为玉米粉或葡萄糖，所述发酵生产丁二酸的底物为葡萄糖。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇的微生物为丙酮丁醇梭菌(C/oWnVfemacetoZm&//cMW)SB-1CGMCCNo.2287;所述发酵生产丁二酸的微生物为琥珀酸放线杆菌Uc"'"o6ac/〃ww"cc/"ogewej)ATCC55618。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇产生的气体经过滤除菌直接通入所述发酵生产丁二酸的发酵罐或经缓冲罐、气体流量计控制通入发酵生产丁二酸的发酵罐的量。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇的培养基为玉米粉糊化液；所述玉米粉糊化液中玉米粉的浓度为60-90g/L;所述发酵生产丁二酸的培养基为每升含葡萄糖30.0-50.0g,酵母粉10.0g,(NH4)2S045.5g,K2HP04.3H208.6g,NaH2P045.0g,MgS04.7H206.0g,FeS04.7H200.005g。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁二酸的pH为5.5-7.0。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁二酸过程流加葡萄糖补充碳源，葡萄糖浓度维持在5-50g/L。9、根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于所述可产生C02的微生物发酵生产丁醇的初始浓度为10、1(^cfU/L;所述可利用C02的微生物发酵生产丁二酸的初始浓度为106-107cfU/L。10、根据权利要求9中任意一项所述的方法，其特征在于所述发酵生产丁醇的培养基体积大于或等于所述发酵生产丁二酸的培养基体积。全文摘要本发明公开了一种发酵生产丁醇和丁二酸的方法。该方法，一种生产丁醇和丁二酸的方法，是在不同的体系中同时微生物发酵生产丁醇和丁二酸，并将发酵生产丁醇产生的气体通入发酵生产丁二酸的体系中。该方法将丁醇发酵体系与丁二酸发酵体系串联起来，利用丁醇发酵产生的CO<sub>2</sub>和H<sub>2</sub>促进丁二酸合成。既实现了CO<sub>2</sub>综合利用，减少温室气体排放；又减少了丁二酸生产过程的碳酸盐使用量。本方法并不需要复杂的设备改造，只需要在丁醇发酵罐尾气管道上增加一个过滤除菌装置后与丁二酸发酵罐进气管道连接即可。实验证明，本发明的方法可以在不额外补加碳酸盐的情况下维持甚至增加丁二酸的合成浓度，同时丁醇合成不受影响。文档编号C12P7/46GK101250561SQ20081010408公开日2008年8月27日申请日期2008年4月15日优先权日2008年4月15日发明者张延平,寅李,王少华,郑文超申请人:中国科学院微生物研究所