专利名称：在真核细胞中生产丁醇的制作方法
在真核细胞中生产丁醇
本发明涉及能够生产丁醇的经转化的真核细胞，以及通过使用所述经 转化的真核细胞生产丁醇的工艺。
近几年中，丙酮/丁醇/乙醇(ABE)发酵工艺作为从生物质生产商业化学 品(如丁醇和丙酮)的有希望的工艺而受到了可观的关注。产溶剂的 (solventogenic) C/oWn'Aa将碳水化合物发酵为丙酮、丁醇和乙醇在数十年 间是公知的。C/o^7'A"通过将合适的碳源转化为乙酰-CoA来生产丁醇。 底物乙酰-CoA随后进入产溶剂(solventogenesis)途径，使用六个协同酶反 应来生产丁醇。所述反应和催化这些反应的酶列于下文
2乙酰-CoA ->乙酰乙酰-CoA + HSCoA (乙酰-CoA乙酰基转移
酶)
乙酰乙酰-CoA + NAD(P)H -> 3-羟基丁酰-CoA + NAD(P)+
(3-羟基-CoA脱氢酶) 3-羟基丁酰-CoA ->巴豆酰-CoA + H20 (3-羟基丁酰-CoA脱水酶) 巴豆酰-CoA + NAD(P)H -> 丁酰-CoA +NAD(P)+ (丁酰-CoA脱氢酶) 丁酰-CoA + NAD(P)H -> 丁醛+ CoA + NAD(P)+ (丁醛脱氢酶)
丁醛+ NAD(P)H -> 丁醇+ NAD(P)+ (丁醇脱氢酶)
丁醇的形成需要通过乙酰基转移酶将乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA。该反应后通过3-羟基丁酰-CoA脱氢酶将乙酰乙酰-CoA转化为3-羟 基丁酰-CoA，之后通过3-羟基丁酰-CoA脱水酶(也称作巴豆酸酶)将3-羟基丁酰-CoA转化为巴豆酰-CoA，以及通过丁酰-CoA脱氢酶将巴豆酰-CoA转化为丁酰-CoA，然后通过丁醛脱氢酶将丁酰-CoA转化为丁醛，最 后通过丁醇脱氢酶将丁醛转化为丁醇(Jones, DT. , Woods, D. R., 1986, Microbiol. Rev., 50， 484-524)。
然而，丁醇的生产受制于差的工艺经济学，因为产生的丁醇对微生物细胞是有毒的，因此效价较低。许多研究已经涉及提高C70^7V/^菌株对
丁醇的抗性，并因而取得了效价的提高。例如在US 6,960,465中显示热 休克蛋白在C7oWW^/m aceto^0^'cwm中的过表达导致与野生型菌株相比 提高的丁醇生产产率。
因为C/o^^fl对氧是敏感，所以C7^/n^fl-发酵必须在严格的厌氧条 件下进行，这使得难以大规模进行这类发酵。由于厌氧条件下的低ATP-增益，厌氧发酵通常导致低的生物质浓度。另外，C/o^nVfez对噬菌体敏 感，导致发酵期间细菌细胞的裂解。因为C/o^n'J^发酵在中性pH下进 行，所以为防止发酵液被例如乳酸菌污染，无菌条件是必要的，这导致了 以工业规模发酵的高成本(Zverlov et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 71 , p. 587-597， 2006， Spivey, Process Biochemistry November 1978)。 在
C/0^7V/&中生产丁醇的另一缺点是还产生了不想要的副产物，如丙酮、乙 酸盐和丁酸盐，这降低了丁醇相对碳的产率。
WO2007/041269公开了经至少一种DNA分子转化的重组微生物，例 如酵母如SaccAaramjc" cwev&ae，所述DNA分子编码催化如上文所述的 丁醇途径的反应之一的多肽。然而，WO 2007/041269中公开的经遗传修饰 的^cc/wram;;c^菌株中产生的丁醇量仅为0.2至lj 1.7 mg/l之间，这比经典 ABE发酵中生产的丁醇量低约10,000-100,000倍。
本发明的目的是提供下述备选的真核细胞，所述真核细胞能够生产比 现有工艺水平中已知更高量的丁醇。
根据本发明，该目标通过经转化的真核细胞达成，所述细胞包含一条 或多条编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁 酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶和/或 NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在转化 细胞后赋予细胞生产丁醇的能力。
本发明还涉及选自 J5/ erg/〃i 、 Pem,c/〃/wm、尸z'c/n.a、 f/t(yver函少ces、 7arra術.a、 Cawc/^/a、 //aw56聽/a、 //t/m/co/a、 7bnz/a5pora 、 ZWc/zosporow 、 ^Sre"awom，cas、 ZygoMccAarom^ycas^尸acA"o/ew禾口 Tawac/aEyma构成的组 的经转化的真核细胞，其包含一条或多条编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱 氢酶或乙醛脱氢酶和/或NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中 所述核苷酸序列在转化细胞后赋予细胞生产丁醇的能力。
在本文中使用时，经转化的真核细胞被定义为用本文定义的一条或多 条核苷酸序列遗传修饰的或转化的真核细胞。未经转化或遗传修饰的真核 细胞是不包含一条或多条下述核苷酸序列的细胞，所述核苷酸序列使得细 胞能够生产丁醇。因此，未经转化的真核细胞是天然不生产丁醇的细胞。 在本文中使用时，丁醇是正丁醇或l-丁醇。
在本发明的范围内，醇脱氢酶或乙醛脱氢酶催化与丁醛脱氢酶相同的 反应。本发明中的醇脱氢酶或乙醛脱氢酶可也具有丁醇脱氢酶活性。
优选地，根据本发明的真核细胞表达了选自下组的一条或多条核苷酸
序列，该组由以下组成
a. 编码乙酰-CoA乙酰基转移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选
自下组，该组由以下组成
i. 编码乙酰-CoA乙酰基转移酶的核苷酸序列，所述乙酰-CoA乙酰基 转移酶包含与SEQ ID NO:l的氨基酸序列至少具有20%,优选地至少具有 25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少具有15%，优选地至少具有 20%、 25%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，
b. 编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 选自下组，该组由以下组成
i.编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，所述3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少具有25%，优选地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 与SEQ ID N0:4的核苷酸序列至少具有20%，优选地至少具有 25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，
c. 编码3-羟基丁酰-CoA脱水酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 选自下组，该组由以下组成
i. 编码3-羟基丁酰-CoA脱水酶的核苷酸序列，所述3-羟基丁酰-CoA 脱水酶包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少具有30%，优选地至少具有 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 与SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少具有25%,优选地至少具有 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，
d. 编码丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下 组，该组由以下组成
i. 编码丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，所述丁酰-CoA脱氢酶包含与 SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少具有20%,优选地至少具有25%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨基酸序列，
ii. 与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少具有15%，优选地至少具有 20%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，
e. 编码醇脱氢酶或乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选 自下组，该组由以下组成
i. 编码醇脱氢酶或乙醛脱氢酶的核苷酸序列，所述醇脱氢酶或乙醛脱 氢酶包含分别与SEQ ID N0:9和/或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少具有 20%，优选地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨 基酸序列，
ii. 分别与SEQ ID NO:IO或SEQ ID NO: 12的核苷酸序列至少具有 15%，优选地至少具有20%、 30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性 的核苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和
iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，禾口
f. 编码NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列选自下组，该组由以下组成
i. 编码NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，所述NAD(P)H-依 赖性丁醇脱氢酶包含与SEQ ID NO: 13和/或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列 至少具有30%，优选地至少具有40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的氨 基酸序列，
ii. 与SEQ ID NO:14禾口/或SEQ ID NO 16的核苷酸序列至少具有 25%,优选地至少具有30%、 40%、 50%、 55%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%序列同一性的核 苷酸序列，
iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和iv.核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序
列不同。
序列同一性和相似性
序列同一性在本文中被定义为两条或更多氨基酸(多肽或蛋白质)序 列或两条或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系，其通过比较序列确 定。通常，序列同一性或相似性在被比较序列的整个长度上比较。在本领 域中，"同一性"还表示氨基酸或核酸序列之间的序列亲缘关系程度，其 根据情况由这类序列字符串之间的匹配测定。"同一性"和"相似性"可 通过本领域技术人员己知的多种方法容易地计算。测定同一性的优选的方 法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。测定同一性和相似性的方 法被编纂在公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似
性的优选的计算机程序方法包括例如BestFit、 BLASTP、 BLASTN和 FASTA (Altschul, S.F.etal.,J.Mol.Biol. 215:403-410 (1990))，公众可从 NCBI和其它来源获得(BLAST Manual, Altschul, S.， et al.， NCBI NLM NIH Bethesda, MD 208940。使用BLASTP进行氨基酸序列比较的优选的参数为 缺口开放IO.O，缺口延伸0.5， Blosum62矩阵。使用BLASTP进行核酸序 列比较的优选的参数为缺口开放10.0，缺口延伸0.5， DNA完全矩阵 (DNA同一性矩阵)。
杂交核酸序列
编码在本发明的细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们分别与 SEQ ID NO. 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16的核苷酸序列在中度杂交条件 下，或优选地在严格杂交条件下杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文 中被定义为下述条件，所述条件允许至少约25个核苷酸，优选地约50、 75或100个核苷酸，最优选地约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约65 t:的温度下，在包含约1M盐的溶液中，优选地在6 x SSC中或具有相当 离子强度的任何其它溶液中杂交，并在包含约0.1 M或更少盐的溶液中， 优选地在0.2 x SSC中或具有相当离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，且优选地，洗涤进行至少一个 小时，且至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90%或更 多序列同一性的序列特异杂交。
中度条件在本文中被定义为下述条件，所述条件允许至少约50个核 苷酸，优选地约200个或更多核苷酸的核酸序列，在约45"C的温度下，在 包含约1M盐的溶液中，优选地在6 x SSC中或具有相当离子强度的任何 其它溶液中杂交，并在包含约1 M盐的溶液中，优选地在6 x SSC中或具 有相当离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少 进行10小时，并且优选地，洗涤进行至少一个小时，并且至少将洗涤溶 液更换两次。这些条件通常会允许具有高达50%序列同一性的序列特异杂 交。本领域技术人员应当能够修改这些杂交条件，从而特异地鉴定同一性 在50%和90%之间变化的序列。
编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶和/或NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列可以来自原核或真核起源。编码乙酰-CoA 乙酰基转移酶的原核核苷酸序列可例如是SEQ ID. NO: 2中所示的 C/oWr,^wm aceto^0^'cwm的,/n工基因。编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶的原 核核苷酸序列可以例如是序列SEQ ID NO: 4中所示的C/oWnWt/m ^"o^0^c謂的AM基因。编码3-羟基丁酰-CoA脱水酶的原核核苷酸序 列可以例如是如序列SEQ ID NO: 6中所示的C/os^W/wm acetoZ M(y"cwm的 cW基因。编码丁酰-CoA脱氢酶的原核核苷酸序列可例如是如序列SEQ ID NO: 8中所示的C/o^r,Wwm ac"ok^y//cww的6ed基因。编码醇脱氢酶或乙 醛脱氢酶的原核核苷酸序列可以例如分别是如序列SEQ ID NO: 10中SEQ ID NO: 12所示的C/o对nWMm acetoZw^/Zcwm的adAE或a<iAEl基因编石马 NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的原核核苷酸序列可以例如是分别如SEQ ID NO: 14禾口 SEQ ID NO: 16中所示的C/o步W謹脏toZ —Zc應的腿A或 k/AB基因。
为了提高被引入的酶在本发明的真核细胞中以活性形式表达的可能 性，可以对相应的编码核苷酸序列加以适应性改造，从而针对选择的真核宿主细胞的密码子使用优化其密码子使用。编码酶的核苷酸序列对选择的 宿主细胞密码子使用的适应性可以被表述为密码子适应指数(CAI)。密码子 适应指数在本文中定义为的相对适应性的度量，所述相对适应性是基因的 密码子使用趋向于高度表达的基因的密码子使用的相对适应性。各密码子 的相对适应性(W)是各密码子使用与针对相同氨基酸的最丰富密码子使用的 比例。CAI指数被定义为这些相对适应性数值的几何平均值。非同义密码
子和终止密码子(依赖于遗传密码)排除在外。CAI数值范围从0到1， 更高的数值表示更高比例的最丰富密码子(见Sharp and Li， 1987， Nucleic Acids Research 15: 1281-1295;还见Jansen et al.， 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8):2242- 51)。经适应的核苷酸序列优选地具有至少0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6或0.7的CAI。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的真核细胞被一条或多条核苷 酸序列遗传修饰，使用如PCT/EP2007/05594中所公开的密码子对优化技 术，针对真核细胞的密码子使用对所述核苷酸序列进行了适应性改造。密 码子对优化是用于在宿主细胞中生产多肽的方法，其中编码所述多肽的核 苷酸序列已在其密码子使用、尤其是关于使用的密码子对的方面被修饰， 从而获得编码多肽的核苷酸序列的提高的表达和/或多肽的提高的生产。密 码子对在本文中被定义为编码序列中一组两个先后的三联体(密码子)。
惊人地发现，使用密码子对优化方法针对选择的宿主细胞对被转化的 真核细胞中的核苷酸序列进行了适应改造时，与用未经密码子对优化的核 苷酸序列转化的真核细胞相比，前一真核细胞生产的丁醇量提高。
可通过公知的方法，如易错PCR或定向进化，来获得真核宿主细胞中 体内酶活性的进一步提高。定向进化的一种优选的方法描述于 WO03010183和WO030腦l中。
根据本发明的真核细胞可以是任何合适的宿主细胞，优选地来自微生 物起源。优选地，宿主细胞为酵母或丝状真菌。更优选地，宿主细胞属于 iSacc/^z-om少cay 、 J5/ efgz7/ws 、 尸ew/cz'〃/wm 、 尸Zc/n'a 、 X/w_yverom_yces 、 7a厂row/a、 C"awfifzV/a、 //awseww/a 、 //w附/co/a、 7brw/a5/ orfl 、 JWcAosporow 、 Sre"flwomyces、 PacA3As0/e打或 Ybmadaz_yma属。更ifc选的宿主细胞属于mana.朋ws 、 K /acfc 〖/jer附oto/eraws 、 yam w'a /—/,'ca 、 C朋c^fl sowore/is7、、 C g/aZ ra/a、 //"awseww/a / o/少mo^p/ja、 7bn/Axs/ ora fife/6厂wecAi/、
Mvarwm、 》SaccAaram_yces Z7a3^m/s或SaccAarcwyces1 cerev&ae禾中。优选地， 真核细胞是SaccAaromyc&y cerevz、/fle。
优选地，根据本发明的真核细胞是酵母，优选地为Sacc/^ra/^c^ ce"v^ae，其包含一个或多个选自下组的基因，该组由SEQ ID NO. 17、 SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 19、 SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 21或SEQ ID NO 22 ，和SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24组成。
编码下述酶的核苷酸序列可以与核酸构建体连接，以协助转化根据本 发明的真核细胞，所述酶生产乙酰乙酰基-CoA、 3-羟基丁酰-CoA、巴豆 酰-CoA、 丁酰-CoA、 丁醛和丁醇。核酸构建体可以是带有编码如上所述 丁醇代谢途径的所有六种酶的基因的质粒，或者核酸构建体包含两种或三 种下述质粒，所述质粒分别带有编码丁醇途径六个酶的三个或两个基因， 所述基因以任何合适的方式分布。可使用任何合适的质粒，例如低拷贝质 粒或高拷贝质粒。选自乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢 酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶 和NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的酶对宿主细胞来说可以是固有的，并且 赋予细胞生产丁醇的能力可能不需要用一条或多条编码这些酶的核苷酸序 列转化。可通过经典的菌株改进获得宿主细胞对丁醇生产的改进。
核酸构建体可以被保持为游离状态，并因此包含用于自主复制的序 列，例如常染色体复制序列。如果宿主细胞是真菌起源的，则合适的游离 体核酸构建体可例如基于酵母2ai或pKDl质粒(Gleer et al., 1991 , Biotechnology 9: 968-975)或AMA质粒(Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489)。或者，各核酸构建体可以以一个或多个拷贝被整合进宿主细 胞的基因组中。整合进宿主细胞基因组可通过非同源重组随机发生，但是 优选地，可通过如本领域所公知的同源重组将核酸构建体整合进宿主细胞 的基因组中(见例如WO90/14423、 EP-A-0481008、 EP-A-0635 574和US6,265,186)。
任选地，可选择的标记物可存在于核酸构建体中。本文使用的术语 "标记物"是指编码下述性状或表型的基因，其允许选择或筛选含有标记 物的宿主细胞。标记物基因可以是抗生素抗性基因，从而可使用适当的抗 生素从未被转化的细胞中选择被转化的细胞。然而，优选地使用非抗生素 抗性标记物，如营养缺陷标记物(URA3， TRP1 , LEU2)。用核酸构建体转化 的宿主细胞可以不含标记物基因。不含重组标记物基因的微生物宿主细胞 的构建方法公开于EP-A-0 635 574中，其基于双向标记物的使用。或者， 可向本发明的核酸构建体中整合可选择的标记物如绿色荧光蛋白、/^Z、 萤光素酶、氯霉素乙酰转移酶、]3-葡萄糖苷酸酶，以允许筛选被转化的细 胞。WO0540186中描述了引入异源多核苷酸的一种优选的无标记物方法。
在一个优选的实施方案中，下述核苷酸序列各自与下述启动子可操作 地连接，所述核苷酸序列编码生产乙酰乙酰-CoA、 3-羟基丁酰-CoA、巴豆 酰-CoA、 丁酰-CoA、 丁醛和丁醇的酶(例如本文定义的酶)，所述启动 子引起相应的核苷酸序列在根据本发明的真核细胞中足量表达，以赋予细 胞生产丁醇的能力。
在本文中使用时，术语"可操作地连接"是指多核苷酸元件(或编码 序列或核酸序列)以功能性关系相连。当核酸序列被置于与另一核酸序列 的功能性关系中时，该核酸序列是"可操作地连接"的。例如，如果启动 子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作 地连接。
在本文中使用时，术语"启动子"是指下述核酸序列，其发挥控制一 个或多个基因转录的功能，按照转录方向位于基因转录起点的上游，并在 结构上通过DNA-依赖性RNA聚合酶结合位点、转录起点、和任何其它 DNA序列的存在来鉴定，所述其它DNA序列包括但不限于转录因子结合 位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知直接或间接 作用以调节来自启动子的转录量的任何其它核苷酸序列。"组成型"启动 子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。"诱导型"启动子是在 环境或发育调节下有活性的启动子。对于编码待表达的酶的核苷酸序列而言，可用于达成编码酶的核苷酸 序列表达的启动子可能不是固有的，即启动子对与其可操作地连接的核苷 酸序列(编码序列)而言是异源的。优选地，启动子对宿主细胞是同源 的，即内源的。
真核宿主细胞中的合适启动子可以是GAL7、 GAL10或GAL 1、 CYC1、 HIS3、 ADH1、 PGL、 P簡、GAPDH、 ADC1、 TRP1、 URA3、 LEU2、 ENO、 TPI和A0X1 。其它合适的启动子包括PDC、 GPD1 、 PGK1、 TEF1禾卩TDH。
本发明中可使用在细胞中有功能的任何终止子。优选的终止子得自宿 主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，将这类 终止子与下述突变组合，所述突变在本发明的宿主细胞中防止无义密码子 介导的mRNA衰变(见例如Shirley et al., 2002， Genetics 161 :1465-1482)。
优选的启动子和终止子示于SEQ ID NO. 25到30中。
用于表示给定(重组)的核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细 胞之间的关系时，术语"同源的"被理解为表示在天然中，核酸或多肽分 子由相同物种的宿主细胞或生物产生，优选地由相同变种或菌株产生。
在关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质的方面，使用术语"异源的" 表示下述核酸或蛋白质，其不作为其存在的生物、细胞、基因组或DNA 或RNA序列的部分天然存在，或其存在于与其天然存在的细胞或位置基 因组或DNA或RNA序列中的位点不同的地方。异源核酸或蛋白质对其被 引入的细胞而言不是内源的，其得自另一细胞或被合成或重组地生产。
可过表达如上所述的丁醇途径中的一个或多个酶，以达成细胞对丁醇 的足量生产。本领域存在多种可获得的手段，用于在本发明的宿主细胞中 过表达酶。具体地，可通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数，例如 通过在宿主细胞的基因组中整合基因的额外拷贝，来过表达酶。
根据本发明的一种优选的宿主细胞可以是天然能够进行醇发酵(例如 厌氧的醇发酵，尤其是乙醇发酵)的真核细胞，能够生产乙醇的一组真核 细胞是例如酵母，如5bcc/wram少c" cwevWae。如果真核细胞能够进行乙醇发酵，则优选一个或多个编码丙酮酸脱羧酶的基因被敲除，从而将代谢 转换至丁醇途径。
为了进一步提高丁醇生产，可优选如下增加真核宿主细胞中的胞质乙 酰COA库在存在可发酵碳源(例如葡萄糖或半乳糖)和乙酸盐、或乙酸 盐来源如脂肪酸的混合物时，培养真核细胞，从而提供具有足量胞质乙酰-
CoA的细胞。
优选地，根据本发明的宿主细胞还对醇具有高耐受，所述醇例如乙 醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、无醇、肌醇、庚醇或辛醇。 高的醇耐受性可天然地存在于宿主细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修 饰，所述遗传修饰可包括经典的菌株改进技术或定向进化。根据本发明的 优选的经转化的真核细胞可能够在本领域己知的任何合适碳源上生长，并 将所述碳源转化为丁醇。经转化的真核细胞可能够直接转化植物生物质、 纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊 精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，优选 的宿主生物表达下述酶，例如将纤维素转化为葡萄糖单体和将半纤维素转 化为木糖和阿拉伯糖单体所必需的纤维素酶(内纤维素酶和外纤维素酶) 和半纤维素酶(例如内-和外-木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化 为葡糖醛酸的果胶酶或将淀粉转化为葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，宿主 细胞能够转化选自下组的碳源，该组由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、
乳糖和甘油组成。宿主细胞可例如是如WO03/062430、 WO06/009434、 EP1499708B1、 WO2006096130或WO04/099381中所述的真核宿主细胞。
另一方面，本发明涉及用于生产丁醇的工艺，所述工艺包括在合适的 发酵培养基中发酵根据本发明的经转化的真核细胞，以及任选地回收丁 醇。
生产丁醇的工艺中使用的发酵培养基可以是任何合适的发酵培养基， 所述培养基允许具体的真核宿主细胞生长。发酵培养基的必需元素是本领 域技术人员已知的，并可针对所选择的宿主细胞对其进行适应性改变。
优选地，发酵培养基包含乙酸盐。惊人地发现在存在乙酸盐时培养真 核细胞时，与无乙酸盐时培养的细胞相比产生增加的丁醇量。发酵培养基200 间，优选地在1和4 g/1之间，优选地在 1.5和3.5 g/l之间。
优选地，发酵培养基包含选自以下的碳源植物生物质、纤维素、半
纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、 核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘 油。优选地，发酵培养基还包含氮源，如尿素，或铵盐如硫酸铵、氯化 铵、硝酸铵或磷酸铵。
根据本发明的发酵过程可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也
可使用独立的水解和发酵(SHF)过程或同时糖化和发酵(SSF)过程。还可使 用这些发酵过程模式的组合，以获得最佳生产力。如果在发酵过程中使用 淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源(其中可能必需添加水解酶，如 纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶，以水解底物)，则SSF过程是尤其有吸 引力的。
生产丁醇的过程中使用的经转化的真核细胞可以是本文上文定义的任
何合适的宿主细胞。发现在生产丁醇的过程中使用根据本发明的经转化
的真核细胞是有利的，因为大部分真核细胞不需要无菌条件来繁殖，并且
对噬菌体感染不敏感。另外，可以在低pH下培养真核宿主细胞，以防止
细菌污染。
优选地，根据本发明的真核细胞是兼性厌氧微生物。因为兼性厌氧微 生物可以需氧地繁殖至高细胞浓度，然后在厌氧条件下生产丁醇，所以兼 性厌氧微生物是优选的。然后可以在高细胞浓度下进行该厌氧周期，这大 幅减小了所需的发酵提及，并且最小化被需氧微生物污染的风险。 根据本发明的生产丁醇的发酵过程可以是需氧或厌氧的发酵过程。 厌氧发酵过程在本文中被定义为在无氧时进行的发酵过程，或是下述
发酵过程其中基本上不消耗氧，优选地消耗少于5、 2.5或1 mmol/L/h
氧，且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。根据本发明的发 酵过程也可以首先在需氧条件下进行，然后在厌氧条件下进行。
发酵过程也可以在氧受限或微量需氧(microaerobical)条件下进行。或 者，发酵过程可首先在需氧条件下，随后在氧受限的条件下进行。氧受限发酵过程是下述过程，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧 限制的程度通过进入气流的量和组成，以及使用的发酵设备的实际混合/质 量转移特性来确定。优选地，在氧受限条件下的过程中，氧消耗速率至少
为5.5 mmol/L/h，更优选地至少为6 mmol/L/h，进一步更优选地至少为7 mmol/L/h。
根据本发明的过程中丁醇的生产可在宿主细胞的生长期期间、稳定 (稳定状态)期期间或两者期间发生。可能在不同的温度下进行发酵过 程。
生产丁醇的过程优选地在对真核细胞最适的温度下进行。各经转化的 真核细胞的最适生长温度可不同，这是本领域技术人员已知的。最适温度 可高于对于野生型生物来说在非无菌条件下在最小感染敏感度和最低冷却 成本下高效生长的最适温度。
经转化的真核细胞生长的最适温度可以高于20°C、 22°C、 25°C、 28°C，或高于30°C、 35°C或高于37°C、 40°C、 42°C，并优选地低于 45°C。然而在丁醇的生产期，最适温度可能低于平均，从而优化生物质稳 定性并降低丁醇溶解度。该时期期间的温度可以低于45°C，例如低于42 °C、 40°C、 37。C，例如低于35°C、 30。C或低于28°C、 25°C、 22。C或低于 20°C，优选地高于15°C。
根据本发明的生产丁醇的过程可在任何合适的pH值下进行。如果经 转化的真核细胞是酵母，则酵母培养基中的pH优选地具有下述值，所述 值低于6，优选地低于5.5，优选地低于5，优选地低于4.5，优选地低于 4，优选地低于pH 3.5或低于pH 3.0，或低于pH2.5，优选地高于pH2。 在这些低pH下进行发酵的一个优点是可以预防发酵培养基中污染细菌的 生长。
可通过本领域已知的方法从发酵培养基中回收丁醇，例如通过蒸馏、 真空萃耳又(vacuum extraction)、溶齐峰耳又或渗透蒸发(pervaporation)。
发现根据本发明的生产丁醇的过程导致产生下述浓度，所述浓度高于 5mg/l发酵液，优选地高于10mg/1，优选地高于20mg/1，优选地高于30 mg/l发酵液，优选地高于40mg/1，更优选地高于50 mg/1，优选地高于60mg/l，优选地高于70，优选地高于80mg/1，优选地高于100 mg/l，优选地 高于lg/1，优选地高于5g/1，优选地高于10g/1，但是通常低于70g/1。
本发明还涉及可通过根据本发明的过程获得的包含丁醇的发酵液。发 现所述发酵液不含或含有低浓度的丁酸盐和丙酮。
通过本发明的发酵过程生产的丁醇可以用于任何已知的丁醇应用中。 其可例如被用作染料、例如用作柴油或汽油的添加剂。或者，发酵生产的 丁醇可以通过本领域已知的方法被转化为丙烯酸丁酯。
遗传修饰
标准的遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶，以及对宿主细胞的额 外遗传修饰)是本领域已知的方法，例如描述于Sambrook and Russel (2001 ) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press，或F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience， New York (1987)中。用于转化和遗传修饰真菌宿主细胞的方 法可从例如EP-A-O 635 574 、 WO 98/46772、 WO 99/60102禾U WO 00/37671己知。
以下实施例仅用于阐述的目的，而不应被理解为限制本发明。
实施例
一般性的
寡核苷酸由Invitrogen (Carlsbad CA,美国)合成。
DNA测序在SEQLAB ( Gottingen,德国)进行或由Baseclear (Leiden,荷兰)进行。
限制性酶由Invitrogen或New England Biolabs提供。
使用的菌丰朱&c^n'c/n'a co" DH10B electromax感受态细胞 (Invitrogen)。方案由制造商提供。
SDS-PAGE体系(Invitrogen)
NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen) 。
SimplyBlue SafeStainMicrowave方案
实施例1
通过同源重组在5Vzcc/ aram;;c^ cerev&ae中克隆丁醇生物合成途径， 并生产丁醇。
l丄基因和构建体
为了在51. cereWw'ae中引入丁醇途径，总计克隆了 8个C/Wn'^/m flceto/)M(y/z'cw附基因
Azl，编码乙酰CoA-乙酰基转移酶[E. C. 2.3.1.9] (SEQ ID. NO:2)
AM，编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[E. C丄l丄57] (SEQIDNO:4)
cW，编码巴豆酸酶或3-羟基丁酰-CoA脱水酶[E. C.4.2丄55] (SEQ ID NO:6)
6cd，编码丁酰-CoA脱氢酶[E. C丄3.99.2] (SEQIDNO: 8) 'a^E或^/AEl，均编码醇脱氢酶或乙醛脱氢酶[E.C.1.2.1.10] (SEQ
ID NO: 10和SEQ IDNO:12)
^ttA、 Z^/ B， 二者分别编码NADH-依赖性丁醇脱氢酶A禾Q B [E. C. :l.l丄-](SEQ ID NO: 14和16)
表达构建体在DNA2.0 (Menlo Park CA，美国)合成。两个高拷贝穿 梭载体pRS425和pRS426 derived (Sirkoski R. S. and Hieter P. Genetics, 1989: 122(1 ):19-27)被制造为各表达3个丁醇生物合成基因。
如Raymon CK. et al Biotechniques (1999) 26:134-141所述，所有合成 的构建体都含有用于三重同源重组的40 bp同源侧翼。^n'L基因和Z M基 因被合成为由双向GAL1-10启动子表达并由GAL1-10终止子终止的一个 片段。cW禾卩6ct/从相似的构建体表达。at/ZiE和a^El基因在GAL7启动 子和终止子以及Z)WA和6WB之间合成，得到4种不同的构建体。
1.2.转化》S. cgrgvWag
通过,/ T7M^构建体与a^E或at/AEl表达构建体和经线性化的 pRS425表达载体(LEU2)在X ce"WWae CEN.PK102-3A (ura3-52和leu2-3)中的三重(tripartite)体内同源重组，制造前两个表达构建体，得到pRS425THE和pRS425THEl 。
通过cW/6W表达构建体和或表达构建体与经线性化的 pRS426表达载体(URA3)在CEN.PK102-3A中的三重体内同源重组，制造 后两个表达载体，分别得到pRS426CBA和pRS426CBB。
每种质粒含有处于半乳糖诱导型启动子后的3个基因。
从经转化的5*. ce"油^菌株中分离质粒，并用表达载体转化co// DH10b，以选择和检验正确的质粒。
用a) pRS425THE和pRS426CBA、 b) pRS425THE和pRS426CBB、 c) pRS425THEl和pRS426CBA 、 d) pRS425THEl禾tl pRS426CBB转化 CEN.PK102-3A。将转化体涂布在酵母氮基(YNB) w/o AA (Difco) + 2%葡萄 糖上。将各质粒组合的总计IO个转化体接种在YNB w/o AA (Difco) + 0.1 %葡萄糖+2%半乳糖中，并在烧瓶中、在需氧条件下、在10ml培养物中 厌氧或氧受限的条件下培养。用于厌氧培养的培养基补充有溶于乙醇中的 0.01 g/1麦角固醇和0.42 g/1吐温80(Andreasen and Stier， 1953, J. cell. Physiol, 41 , 23-36; Andreasen and Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281 )。所有的 酵母培养物在3(TC下培养。培养和诱导过夜后，将细胞离心，并如下文所 述通过HPLC测量上清液中的丁醇浓度。
1.3.通过HPLC分析丁醇
HPLC分析前置柱(pre-column): Biorad Microguard阳离子H+管。 柱Biorad Aminex HPX-87H。流动相0.01 N H2S04。沉淀试剂:3.3N HC104。
RI检测Waters 410差示折射计。
实施例2
使用限制性酶在^cc/mro,c" ce^vWae中克隆丁醇生物合成途径并使用
经密码子对优化的基因生产丁醇。
2丄基因和构建体
为了在cweWw'fle中表达，向实施例1第1.1段中给出的8个天然基 因应用PCT/EP2007/05594中公开的密码子对方法。这导致产生了 8个经密码子对优化的变体
SEQ ID NO. 17:经密码子对优化的(CPO) Azl基因
SEQIDN0.18:经密码子对优化的AZ^/基因
SEQ ID NO. 19:经密码子对优化的cW基因(逆时针方向)
SEQ ID NO. 20:经密码子对优化的6cd基因
SEQ ID NO. 21:经密码子对优化的基因
SEQ ID NO 22:经密码子对优化的《WE1基因
SEQ ID NO 23:经密码子对优化的6WA基因
SEQ ID NO 24:经密码子对优化的MAB基因
在DNA2.0 (Menlo Park CA,美国)合成这8个设计的经密码子对优 化的基因。如下文所述使用经密码子对优化的基因制造表达构建体。
2.2.转化5". cereWw.ae
如下构建前两个表达构建体用^ al/M rt限制性酶双消化pRS415载 体(LEU)，随后在该载体中连接与AcI/A^I限制性片段组合的/^fll/^cl限 制性片段，所述AcI/M^I限制性片段含有血L/AM片段，所述^ dA4"I 限制性片段由^/AE或^ttEl基因组成。在该三重连接后，使用连接混合 物转化五.co// DH 10B (Invitrogen)，分别得到构建体pRS415THE和 pRS415THEl。随后将这些构建体用于在& cer，'5/ae CEN.PK102-3A (ura3-52禾口leu2-3)中的转化。
如下构建后两个表达载体用S謹HI/A^1限制性酶双消化pRS416载 体(URA)，随后在该载体中连接与^ cI/A^1限制性片段组合的5"mHIMwI 限制性片段，所述J^I/A^I限制性片段含有cW/6W片段，所述 5amHI/血cI限制性片段由MAA或M/ B基因组成。在该三重连接后，将 连接混合物用于转化五.co/,' DH 10B (Invitrogen)，分别得到构建体 pRS416CBA禾n pRS416CBB。随后将这些构建体用于在S. cere由/ae CEN.PK102-3A (ura3-52和leu2-3)中的转化。
每种质粒含有处于在半乳糖诱导型启动子和终止子后的3个基因。图 1中展示了构建体的图解。启动子和终止子的序列表如下SEQIDNO. 26: GAL7终止子；SEQIDN0 27: GAL IO终止子，逆时针方向；SEQIDN0 28: GAL10启动子，逆时针方向； SEQIDN0 29: GAL 1启动子；SEQIDNO30: GAL 1终止子。
用a) pRS415THE和pRS416CBA、 b) pRS415THE和pRS416CBB、 c) pRS415THEl和pRS416CBA，或d) pRS415THEl和pRS416CBB转化51. ce^w^ae CEN.PK102-3A。将转化体涂布在酵母氮基(YNB) w/o AA (Difco) + 2%葡萄糖上。将各质粒组合的总计10个转化体接种在YNB w/o AA (Difco) + 0.1 %葡萄糖+ 2%半乳糖中并处于需氧条件下。随后将经转化的 酵母在用橡皮塞子和铝盖封闭的烧瓶中，在10 ml培养物微量需氧地培 养。所有的酵母培养物在25。C下培养。诱导过夜后，在培养40、 48和64 小时后取出培养物的小份试样。将细胞离心，并如下文所述通过顶空色谱 (Headspace Gaschromatography, HS-GC)测量上清液中的丁醇浓度。
2.3.通过HS-GC分析丁醇
在装备了闪烁电离检测器和自动注射体系的HS-GC上分析样品。柱 J&W DB-1长度30 m， id 0.53 mm， df 5 /mi。使用以下的条件氦作为运 载体，流速5ml/分钟。柱温度被设定为ll(TC。注射器被设定为14(TC且 检测器在30(TC下运行。使用Chromeleon软件获得数据。在顶空采样器中 将样品在6(TC下加热20分钟。将lml顶空挥发物自动注射在柱上。
包含经密码子优化的a^E和kttA或b丑A，或和MAA或 Z^/AB的所有不同的转化体都能够生产丁醇。在培养40小时后，上清液中 的丁醇浓度在5 - 10 mg丁醇/l之间，培养48小时后，在8 - 13 mg 丁醇/1 之间，培养64小时后，在15和20 mg丁醇/l之间。包含未经密码子对优 化的基因的X ce"v^ae菌株在培养64小时后生产0.1-2 mg/1。
实施例3:乙酸盐对丁醇产量的影响 用生产丁醇的酵母菌株CEN.PK102-3A菌株测定发酵培养基中存在乙 酸盐对丁醇产量的影响，所述菌株如实施例2中所述用pRS425THE和 pRS426CBB转化。将该酵母菌株接种在Verduyn培养基(Verduyn, C,Postma， E.， Scheffers W. A.， van Dijken, J. P. (1992), Yeast 8， 501-517)中，所 述培养基被如下调节用尿素(2 g/l)代替硫酸铵，半乳糖(40 g/l)是唯一的 碳源，并用溶于乙醇中的2g/l乙酸钾、0.01 g/l麦角固醇和0.42 g/l吐温80 补充培养基(Andreasen and Stier, 1953， J. cell. Physiol, 41 ， 23-36; Andreasen and Stier, 1954， J. Cell. Physiol, 43: 271-281 )。参照培养物不含2 g/1乙酸 钾。将细胞在烧瓶中于50 ml培养基中微量需氧地培养，所述烧瓶用橡胶 塞子和铝盖封闭。将烧瓶在25"C柔和摇动。在600 nm处1.5的光密度下 (72小时后)，将细胞离心并如实施例2中所述通过HS-GC测量上清液 中的丁醇浓度。
包含乙酸盐的培养物中丁醇的产量为20 mg/l。不含有乙酸盐的培养物 中丁醇的产量为13mg/l。
权利要求
1.经转化的真核细胞，其包含一条或多条编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶和/或NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在转化所述细胞后赋予所述细胞生产丁醇的能力。
2. 根据权利要求1的细胞，其中使用密码子对优化，使所述核苷酸序 列适应所述真核细胞的密码子使用。
3. 根据权利要求1或2的真核细胞，其表达一条或多条选自下组的核 苷酸序列，该组由以下组成a. 编码乙酰-CoA乙酰基转移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选 自下组，该组由以下组成i. 编码乙酰-CoA乙酰基转移酶的核苷酸序列，所述乙酰-CoA乙酰基 转移酶包含与SEQ ID NO:l的氨基酸序列至少具有20%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 与SEQ ID NO:2的核苷酸序列至少具有15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，b. 编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 选自下组，该组由以下组成i. 编码3-羟基丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，所述3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少具有25%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 与SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少具有20%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；禾口iv.核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序列不同，c. 编码3-羟基丁酰-CoA脱水酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下组，该组由以下组成i. 编码3-羟基丁酰-CoA脱水酶的核苷酸序列，所述3-羟基丁酰-CoA 脱水酶包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少具有30%序列同一性的氨基 酸序列，ii. 与SEQ ID NO:6的核苷酸序列至少具有25%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；禾口iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，d. 编码丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自下 组，该组由以下组成i. 编码丁酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，所述丁酰-CoA脱氢酶包含与 SEQ IDNO:7的氨基酸序列至少具有20。/。序列同一性的氨基酸序列，ii. 与SEQ ID NO:8的核苷酸序列至少具有15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，e. 编码醇脱氢酶或乙醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选 自下组，该组由以下组成i. 编码醇脱氢酶或乙醛脱氢酶的核苷酸序列，所述醇脱氢酶或乙醛脱 氢酶包含分别与SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列至少具有 20%序列同一性的氨基酸序列，ii. 分别与SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12的核苷酸序列至少具有 15%序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和iv.核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同，和f.编码NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸 序列选自下组，该组由以下组成i. 编码NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的核苷酸序列，所述NAD(P)H-依 赖性丁醇脱氢酶包含与SEQ ID NO: 13和/或SEQ ID NO: 15的氨基酸序列 至少具有30%序列同一性的氨基酸序列，ii. 与SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO 16的核苷酸序列至少具有25% 序列同一性的核苷酸序列，iii. 核苷酸序列，其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交；和iv. 核苷酸序列，其由于遗传密码子的简并性而与(iii)的核酸分子的序 列不同。
4. 根据权利要求1到3中任一项的细胞，其中所述细胞是包含下述异 源核苷酸序列的&cc/^ram;;c^ cere油/ae，所述异源核苷酸序列编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、 丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶和NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶。
5. 根据权利要求1到3中任一项的细胞，其为包含一条或多条下述核 苷酸序歹U的》Sflcc/^rom_ycas cergv&ae，所述一条或多条核苷酸序歹U选自由 SEQ ID NO. 17、 SEQ ID NO. 18、 SEQ ID NO. 19、 SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 21或SEQ ID NO 22，和SEQ ID NO 23或SEQ ID NO 24组成的组。
6. 根据权利要求1到5中任一项的细胞，其中编码丙酮酸脱羧酶的一 个或多个基因被敲除。
7. 根据权利要求1到6中任一项的细胞，其能够转化选自下组的碳 源，该组由淀粉、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽 糖糊精、核糖、核酮糖、纤维素、半纤维素、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、 蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油组成。
8. 用于生产丁醇的工艺，所述工艺包括在合适的发酵培养基中发酵如前述权利要求中任一项所定义的经转化的真核细胞，以及任可选地，回收 丁醇。
9. 根据权利要求8的工艺，其在低于5的pH下进行。
10. 根据权利要求8或9的工艺，其特征是所述发酵培养基包含乙酸±卜
11. 包含丁醇的发酵液，其可通过根据权利要求8到10中任一项所述 的工艺获得。
全文摘要
本发明涉及经转化的真核细胞，其包含编码乙酰-CoA乙酰基转移酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、3-羟基丁酰-CoA脱水酶、丁酰-CoA脱氢酶、醇脱氢酶或乙醛脱氢酶和/或NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶的一条或多条核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在转化细胞后赋予细胞生产丁醇的能力。本发明还涉及生产丁醇的工艺。
文档编号C12N15/53GK101595218SQ200780040436
公开日2009年12月2日 申请日期2007年10月30日 优先权日2006年10月31日
发明者威廉默斯·西奥多瑞斯·安东尼厄斯·玛丽亚·拉特·德, 罗拉纳·麦德勒尼·拉姆斯多克, 马可·亚历山大·伯格·范德恩 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司