通过基因表达分析进行研究、判定或评价的方法

专利名称：：通过基因表达分析进行研究、判定或评价的方法
技术领域：
：本发明涉及对SART应激负荷动物投入被检物质后，对其神经组织的基因表达变化进行分析，由此在基因水平上对SART应激负荷导致的病态以及该被检物质的药理作用，例如镇痛作用、自律神经失调的改善作用或者抗应激作用进行研究、判定或评价的方法。
背景技术：
：对实验动物以饲养环境温度白天每1小时变换温度、夜间为低温的方式饲养数日，对动物负荷SART(SpecificAlternationofRhythminTemperature)应激，即反复寒冷应激，由此能够制作得到小鼠、大鼠、豚鼠等的SART应激负荷动物。SART应激负荷动物被认为是疼痛过敏、自律神经失调、应激状态的病态模型动物，能够根据喜多等的方法(日薬理誌，71巻，195页，1975年)制作。例如，在使用大鼠的情况下，将饲养温度在上午10点至下午5点间每1小时在24。C和一3'C之间交互变换，之后，从下午5点至次日清晨的上午10点之间维持在一3°C，使其自由摄取水和饲料，饲养4天以上，使其负荷反复寒冷应激。在大鼠，低温的温度设定为一3'C，在小鼠为4'C，在豚鼠为0°C，由此能够分别制作SART应激小鼠、SART应激豚鼠模型。已知这样制作得到的SART应激负荷动物具有以下的特征，g卩，因反复寒冷应激而导致疼痛阈值降低，变得不安、郁闷，体重也下降，CRH(促肾上皮质激素释放激素)、去甲肾上腺素、IL-lp的释放分别亢进，5-羟色胺(5-HT)的释放受到抑制。此外，本发明中作为被检物质使用的痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取液，含有从接种过痘菌病毒的家兔的炎症皮肤组织提取并分离得到的非蛋白性的活性物质。迄今为止，已知该痘菌病毒接种炎症组织提取液对于SART应激负荷动物具有疼痛阈值降低(疼痛过敏)的抑制作用(镇痛作用)，CRH、去甲肾上腺素、IL-lp的释放亢进的抑制作用，5-羟色胺(5-HT)的释放抑制的促进作用，对体重减少的抑制作用(自律神经失调的改善作用，抗应激作用)等(参照非专利文献1和2)。以痘菌病毒接种的家兔炎症皮肤提取液为有效成分的医药品制剂(商品名Neurotropin)，规定作为使用该SART应激负荷动物进行镇痛效力实验的效力检测的定量实验。痘菌病毒接种的家兔炎症皮肤提取液制剂是一种已经明确广泛适用于腰痛症、颈肩腕综合征、症状性神经痛、肩周炎、变形性关节炎、带状疱疹后神经痛等疼痛性疾病，除此以外还广泛适用于皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)伴随的瘙痒、过敏性鼻炎、亚急性脊髓视神经病后遗症等的冷觉、异常知觉、痛觉等的非常独特的制剂，其皮下注射、肌肉注射、静脉注射用的注射剂和片剂作为医疗用医药品己被允许制造并在市场上出售。近年来，在美国正在进行关于难治性神经性疼痛RSD(反射性交感神经萎縮症，CRPS-typel)的临床实验。另外，有报告称，痘菌病毒接种炎症组织提取物对纤维肌痛症有效(参照专利文献1)。关于纤维肌痛症的发病原因和机制，目前推测为压力等导致的心理原因、病毒感染、遗传、免疫异常以及神经递质的异常等，但仍然没有被阐明。近年，纤维肌痛症和SART应激负荷动物的病态显示出共性。另一方面，作为痘菌病毒接种炎症组织的提取物显示镇痛作用的机制，报告了活化下行性病痛抑制系统的机制，本发明的发明人等以阐明SART应激负荷导致的病态和痘菌病毒接种炎症组织提取物的药理作用的机制为目的，使用SART应激负荷的大鼠的神经组织(脊髓后根神经节、脊髓后角、脑组织)，通过实时定量PCR(RealtimePCR)进行研究。但是，以实时定量PCR能够进行分析的基因数量有限，因此，无法对表达量受到痘菌病毒接种炎症组织提取物影响的全部的基因进行网罗式的探索。非专利文献l:基礎^臨床，15巻，5号，2459页，1981年非专利文献2:応用薬理，32巻，3号，599页，1986年专利文献1:国际公开WO2004/039383号公报
发明内容本发明的目的在于提供一种在基因表达水平上对SART应激负荷导致的病态以及该被检物质的药理作用，例如镇痛作用、对自律神经失调的改善作用或者抗应激作用进行研究，判定或评价的方法，以及对疼痛性疾病、自律神经失调和应激性疾病有效的物质进行筛选的方法。本发明的发明人等对于痘菌病毒接种炎症组织的提取物对SART应激负荷动物的镇痛作用，从改善疼痛的下行性抑制系统的应激导致的机能低下的机制着眼，进行了深入研究。其结果，通过对SART应激负荷动物投与被检物质之后，对该动物的神经组织的基因表达进行网罗式的探索，确定表达量受到SART应激负荷以及该被检物质影响的基因，从而完成本发明。发明的效果本发明提供一种对SART应激负荷动物投与被检物质之后，对其神经组织的基因表达变化进行网罗式的分析，由此在基因水平上对该被检物质的药理作用，特别是镇痛作用、自律神经失调的改善作用或者抗应激作用进行研究、判定或评价的方法，由此对疼痛性疾病、自律神经失调、应激性疾病等有效的物质进行探索，对该物质进行效果的判定、评价，或者对该物质的靶基因进行分析。具体实施例方式SART应激负荷动物能够采用上述的方法制作。另外，作为被检物质的痘菌病毒接种炎症组织提取物能够通过将痘菌病毒接种动物使其发痘，将发痘的组织破碎，添加提取溶剂除去组织碎片之后，进行除蛋白处理，使用吸附剂进行吸附，之后将吸附成分溶出而得到。例如，可以通过如下的工序制造痘菌病毒接种炎症组织提取物。(a)收集接种痘菌病毒使其发痘的兔子、小鼠等的皮肤组织，破碎发痘组织，添加水、苯酚水溶液、生理盐水或苯酚加甘油水溶液等提取溶剂后，通过过滤或离心分离得到提取液(滤液或上清)。(b)将上述提取液调整为酸性pH，加热，除蛋白处理。接着将除蛋白后的溶液调整为碱性，加热后过滤或离心分离。(c)将得到的滤液或上清调整至酸性，使其吸附在活性炭、高岭土等吸附剂上。(d)向上述的吸附剂中加入水等提取溶剂，调整为碱性pH，使吸附成分溶出，由此能够得到痘菌病毒接种炎症组织提取物。下面，对上述各工序进行更详细的说明。关于(a)))将痘菌病毒接种家兔等兔子并使其发痘，收集炎症皮肤组织并破碎，添加其1至5倍量的提取溶剂，使其成为乳化悬浊液。提取溶剂可以使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性至弱碱性的缓冲液等，也可以适当添加甘油等的稳定剂、苯酚等杀菌防腐剂、氯化钠、氯化钾、氯化镁等盐类等。此时，也可以通过冻融、超声波、细胞膜溶解酶或者表面活性剂等的处理破坏细胞组织，使提取容易进行。关于(b)将得到的乳状提取液通过过滤或离心分离等除去组织碎片之后，进行除蛋白处理。除蛋白操作可以根据通常进行的公知的方法进行，可以适当使用加热处理、使用蛋白变性剂，例如酸、碱、尿素、胍、丙酮等有机溶剂等的处理、等电点沉淀、盐析等方法。接着，采用除去不溶物的通常的方法，例如使用滤纸(纤维素、硝化纤维素等)、玻璃滤器、西莱特(Cdite)、塞式过滤板等进行过滤、超滤、离心分离等除去析出的不溶蛋白。关于(c)使用盐酸、硫酸、溴化氢等酸将这样得到的含有有效成分的提取液调整为酸性，优选调整为pH3.5至5.5，进行向吸附剂吸附的操作。作为可以使用的吸附剂，可以列举活性炭、高岭土等，在提取液中添加吸附剂并搅拌，或者使提取液通过填充有吸附剂的柱，能够使有效成分吸附到该吸附剂上。在提取液中添加吸附剂的时候，通过过滤或离心分离等除去溶液，从而能够得到吸附有有效成分的吸附剂。关于(d)为了使有效成分从吸附剂中溶出(脱离)，能够通过在上述的吸附剂中添加洗脱溶剂，室温或者适当加热或者搅拌而溶出，以过滤或离心分离等通常方法除去吸附剂而实现。作为所使用的溶出溶剂，可以使用碱性溶剂，例如调整为碱性pH的水、甲醇、乙醇、异丙醇等或者这些溶剂的适当的混合溶液，优选使用调整为pH9至12的水。另外，关于痘菌病毒接种炎症组织提取物的制造，在例如上述专利文献1等中记载了更具体的制造方法。此外，动物的脊髓后根神经节和脊髓后角等神经组织采用通常的方法采集即可。实施例1.实验材料首先，如下制作SART应激负荷动物的神经组织样品。(1)动物对6周龄的Wistar系雄性大鼠进行SART应激负荷，制作SART应激大鼠。使大鼠自由摄取饲料以及自来水，5天内反复进行寒冷应激负荷，第六天解除应激负荷，以供实验。(2)痘菌病毒接种炎症组织提取物作为痘菌病毒接种炎症组织提取物，使用将根据上述专利文献1中的实施例2制造得到的痘菌病毒接种的兔子的炎症皮肤由来的提取物调整为20NU/mL的物质(痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物)。NU规定为使用疼痛阈值比正常动物低的慢性应激动物SART应激小鼠，根据Randall-Selitto法进行实验，得到的镇痛效力的ED5Q值。1NU为ED50值为100mg/kg时的痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物的镇痛活性含有成分lmg所显示的活性。(3)痘菌病毒接种炎症组织提取物的给药对上述的SART应激负荷大鼠，从SART应激负荷开始之日开始，将痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物以每lkg体重给药200NU的给药量1天1次连续腹腔内给药(正常被检物质给药组以及SART应激被检物质给药组)。以同样的日程对正常对照组以及SART应激负荷对照组投与生理盐水。给药的液体量为每lkg体重10mL。分组如下正常对照组(n=3)、正常被检物质给药组(n=3)、SART应激负荷对照组(n=4)、SART应激负荷被检物质给药组(n=4)。(4)疼痛阈值的测定使用压力刺激镇痛效果测定装置，根据Randall-Selitto法进行实验，测定疼痛阈值。即，以一定的加压速度对大鼠右后肢脚趾施加压力刺激，测定动物表现出逃避或者嘶叫反应时的加压重量(g)作为疼痛阈值。5天的SART应激负荷结束后，进行最后一次痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物的给药，给药30分钟后测定痛觉阈值。由此，得到以下结果。(1)痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物对于SART应激负荷大鼠的疼痛阈值降低的效果SART应激负荷5日后的SART应激负荷对照组的疼痛阈值与正常对照组相比显著低下。与此相对，SART应激负荷被检物质给药组最后一次给药30分钟后测定疼痛阈值的结果，与SART应激负荷对照组相比，观察到显著的改善。另一方面，不进行SART应激负荷而投与了痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物的正常被检物质给药组的痛觉阈值没有变化。(2)样品如上所述，在能够确认SART应激负荷导致的疼痛阈值降低和痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物的镇痛效果之后，将各组大鼠断头并回收血液，取出脊髓后根神经节以及脊髓后角，分别浸存于RNAlater(商品名，Ambion公司制)中，为了防止RNA降解，将其置于冰箱中孵育1晚后，在一80'C冷冻保存。2.实验方法接着，使用以上述方法得到样品，通过DNA阵列(DNA微阵列、DNA芯片等)对SART应激负荷动物的脊髓后根神经节(DRG)和脊髓后角(DH)的基因表达量进行网罗式的定量，并对这些基因表达变化对病态的意义进行阐明。详细说明如下。(1)总RNA的调制和品质鉴定各样品的总RNA使用RNeasyLipidTissueMiniKit(商品名，Qiagen公司制)和RNase-FreeDNaseSet(商品名，Qiagen公司制)提取并精制，用2100Bioanalyzer(商品名，Agilent公司制)对RNA的品质进行鉴定。全部样品的总RNA的吸光度(260/280)比均为2.02.1，各样品为不含蛋白质的核酸成分。通过微芯片电泳分析RNA有无分解，结果可以确认在全部样品中都存在18S核糖体RNA的尖峰，并且不存在基线紊乱以及分解物的峰，据此可以判断RNA样品没有分解。由于这些样品中的总RNA每个都符合品质鉴定，所以作为DNA阵列实验的样品使用。(2)DNA阵列实验(与Cyanine3标记互补的RNA(Cy3-cRNA)调制和杂交)使用RatGenomeOligoMicroarrayKit(商品名，Agilent公司帝!j，商品号G4131A)进行基因表达的网罗式分析。探针的调制、杂交以及洗净方法根据Agilent1色法对应的DNA微阵列试剂盒的操作说明(Verl.O)进行。通过逆转录反应从总RNA制得双链互补的DNA之后，使用LowRNAInputLinearAmplification&LabelKit在Cy3标记胞嘧啶3磷酸(Cy3-CTP)存在的条件下进行扩增和标记，使用RNeasyMiniKit(商品名，Qiagen公司制)对Cy3-cRNA进行精制。使用U-3300Spectrophotometer(商品名，Hitachi公司制)对样品的浓度和荧光色素的摄入进行确认之后，使Cy3-cRNA扩增1000倍以上，并且，当全部样品的Cy3摄入率达到9pmoL/昭以上时，达到Agilent的操作说明中表示的基准范围内(915pmoL/|Lig)。因此，从总RNA制作得到的Cy3-cRNA的扩增效率和荧光色素的摄入率在操作说明的基准范围内，可以确认正在进行正确的扩增以及荧光色素的摄入。使用GeneExpressionHybridizationKit(商品名，Agilent公司制)中的试剂将上述得到的Cy3-cRNA片段化后，与杂交缓冲液混合，滴加于RatGenomeOligoMicroarraySlide上，在65°C进行17小时的杂交。反应结束后，使用DNA微阵列扫描仪，在分解能量为lO]iim的条件下，对洗净并干燥后的DNA微阵列上的与各探针互补结合的Cy3-cRNA量的荧光强度进行测定。(3)数据分析荧光强度的数值化和数据处理使用数值化变换软件FeatureExtractionVer8.5(商品名，Agilent公司制)，进行各点内一定范围的荧光强度的数值化和异常点的检测，排除背景值和统计学上不具有显著差异的点。[2]基因表达量的修正和縮小目标基因组群的范围使用基因表达分析软件GeneSpringVer7.3(商品名，SiliconGenetics公司制)对阵列间和探针间的基因表达水平进行修正后，根据下述的方法进行表达模式异常的基因的排除和目标基因的选择。(A)基于表达模式(Flag)的选择除去Flag异常的基因。(B)基于通过方差分析得到的基因表达水平的显著性差异的基因的选择通过对正常对照组(n=3)，SART应激负荷对照组(n=4)以及SART应激负荷被检物质给药组(n=4)间的方差分析(onewayONOVA)，选出基因表达水平具有显著性(P<0.05)差异的基因。(C)目标基因组群的选择为了根据SART应激负荷和被检物质对基因表达的组合效果縮小目的基因的范围，选择与正常对照组相比SART应激负荷组中基因表达增加1.25倍以上，并且与SART应激负荷组相比SART应激负荷被检物质给药组中表达减少1.25倍以上的基因组群。相反地，选择与正常对照组相比SART应激负荷组中基因表达减少1.25倍以上，并且与SART应激负荷组相比SART应激负荷被检物质给药组中表达增加1.25倍以上的基因组群。目标基因的推定所选择的目标基因的功能使用基因数据库GenBank以及文献数据库PubMed进行调査。3.结果根据上述实验方法得到的结果如下。(1)目标基因组群的选择将DNA阵列上的41071个与探针结合的基因所发出的荧光量数值化，并排除表达模式(Flag)异常的基因。在剩下的基因组群(DRG-Flag:19371个基因，DH-Flag:20623个基因)中，选择正常对照组、SART应激负荷组、SART应激负荷被检物质给药组的3组间通过方差分析(onewayANOVA)可以确认具有显著性(P<0.05)差异的基因(DRG-ANOVA:1538个基因，DH-ANOVA:3570个基因)。从通过方差分析选择得到的基因组群中，以上述目标基因的选择方法，选择可以确认在各样品中表达量发生变化的以下的基因组群，表示在表1至表5中。下表中，(-)表示没有基因符号的分子，(predicted)表示推测的分子，另外，SART的数值表示为以正常对照组为1.00时的SART应激负荷组的表达量，SART-NSP的数值表示为以SART应激负荷组为1.00时的SART应激负荷被检物质给药组的表达量。12[1]脊髓后根神经节(DRG)中确认表达量发生变化(SART应激负荷时促进表达，投与被检物质时抑制表达)的37个基因(表l和表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>[2]脊髓后根神经节中确认表达量发生变化(SART应激负荷时抑制表达，投与被检物质时恢复表达)的12个基因(表3)[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[3]脊髓后角(DH)中确认表达量发生变化(SART应激负荷时促进表达，投与被检物质时抑制表达)的10个基因(表4)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>脊髓后角中确认表达量发生变化(SART应激负荷时抑制表达，投与被检物质时恢复表达)的27个基因(表5)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)目标基因的功能分析上述选择的目标基因的功能使用基因数据库GenBank以及文献数据库PubMed进行调查，将类似的功能总结于表6至表11中表示。下表中，(-)表示没有基因符号的分子，(predicted)表示推测的分子。脊髓后根神经节(DRG)中确认表达量发生变化(SART应激负荷时促进表达，投与被检物质时抑制表达)的37个基因中，确认含有具有巨噬细胞的趋化性和活化以及炎症相关功能的基因(表6和表7)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>脊髓后根神经节中确认表达量发生变化(SART应激负荷时抑制表达，投与被检物质时恢复表达)的12个基因中，确认含有具有细胞生长发育相关功能的基因等(表8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如上所述，本实验中，确认了SART应激负荷动物的脊髓后根神经节中，趋化因子、巨噬细胞、细胞粘着、炎症相关功能的基因表达被上调。这些基因表达的上调，可以认为与巨噬细胞类细胞向脊髓后根神经节内游走及其活化的促进所导致的痛觉过敏以及应激导致的疾病等相关。另一方面，确认了SART应激负荷动物的脊髓后角中，髓鞘形成以及C1通道功能相关的基因表达下调。髓鞘形成相关的基因表达下调可以认为是痛觉过敏的原因，具有诱发脱髓样变性的可能性，而诱导超极化的氯离子通道功能相关的基因表达下调与痛觉过敏的产生有很强的相关性。本实验中，提示痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物具有通过调节这些基因表达从而发挥镇痛作用以及抗应激作用的可能性。如上所述，上述实验中，因SART应激负荷以及投与痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物而确认表达改变的基因，可能是SART应激负荷动物中疼痛阈值降低等的生理机能异常或者应激性疾病的病因相关的基因，可能是痘菌接种家兔炎症皮肤提取物相关的目标基因。因此，当这些基因的表达变化被被检物质介导而正常化时，则该被检物质可能是对腰痛症、颈肩腕综合征、症候性神经痛、肩周炎、变形性关节炎、带状疱疹后神经痛、RSD、纤维肌痛综合症等疼痛性疾病以及神经性疼痛、自律神经失调或者应激导致的生理机能异常等有效的药物。产业上的可利用性如上所述，根据本发明的方法，可以确认能够检出并鉴定因SART应激负荷以及投与痘菌病毒接种家兔炎症皮肤提取物而表达改变的基因。因此，本发明作为通过对SART应激负荷动物投与被检物质后对神经组织的基因表达进行分析，由此研究、判定或评价该被检物质的镇痛作用、自律神经失调的改善作用或抗应激作用等的药理作用的方法有用。权利要求1.一种对被检物质的药理作用进行研究、判定或评价的方法，其特征在于该方法基于对投入有被检物质的SART应激负荷动物的神经组织进行的基因表达分析。2.如权利要求l所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于-所述药理作用为镇痛作用、自律神经失调改善作用或抗应激作用。3.如权利要求1或2中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于所述SART应激负荷动物为大鼠。4.如权利要求13中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于所述神经组织为脊髓后根神经节或脊髓后角。5.如权利要求14中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于所述基因表达分析是采用DNA阵列的分析。6.如权利要求15中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于-进行基因表达分析，与正常动物进行比较，将在SART应激负荷动物中表达发生改变的基因作为指标。7.如权利要求15中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于-进行基因表达分析，与未投入被检物质的SART应激负荷动物进行比较，将在投入有被检物质的SART应激负荷动物中表达发生改变的基因作为指标。8.如权利要求6或7所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于作为表达发生改变的基因，以表1表5中记载的基因中的任1种或2种以上作为指标。9.如权利要求18中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于-所述被检物质为痘菌病毒接种炎症组织的提取物。10.如权利要求9所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于所述被检物质为痘菌病毒接种家兔炎症皮肤的提取物。11.一种用权利要求18中任一项所述的方法进行了研究、判定或评价的药剂。12.如权利要求ll所述的药剂，其特征在于-所述药剂为镇痛剂。13.如权利要求ll所述的药剂，其特征在于所述药剂为自律神经失调治疗剂。14.如权利要求ll所述的药剂，其特征在于所述药剂为抗应激剂。15.如权利要求ll所述的药剂，其特征在于-有效成分为痘菌病毒接种家兔炎症皮肤的提取物。16.SART应激负荷动物在权利要求18所述的研究、判定或评价的方法中的使用方法。17.SART应激负荷动物在被检物质为痘菌病毒接种家兔炎症皮肤的提取物的权利要求18所述的研究、判定或评价的方法中的使用方法。■全文摘要本发明提供一种在基因水平上对SART应激负荷动物导致的病态以及被检物质对该病态的镇痛作用、自律神经失调的改善作用、抗应激作用等药理作用进行研究、判定或评价的方法。对SART应激负荷动物投入被检物质之后，对其神经组织的基因表达变化进行网罗式分析，由此在基因水平上对SART应激负荷动物导致的病态以及该被检物质的药理作用，特别是镇痛作用、自律神经失调的改善作用以及抗应激作用进行研究、判定或评价，从而能够探索对疼痛性疾病、应激性疾病、自律神经失调等有效的物质，对该物质进行效果的判定和评价，或者对该物质的靶基因进行分析。文档编号C12Q1/68GK101528947SQ200780040398公开日2009年9月9日申请日期2007年9月5日优先权日2006年9月6日发明者内木充,冈田智行申请人:日本脏器制药株式会社