基因定量、序列分析用二维细胞阵列器件及装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因表达分析、细胞功能分析、生物体组织的分析方法和疾病的诊断、新药研发等。详细而言，涉及单细胞水平的mRNA分析方法。
【背景技术】
[0002]基因表达分析中，使用了下述方法:从细胞组中提取mRNA，制备作为互补链的cDNA并通过PCR等对其拷贝数进行扩增，使用DNA探针阵列(DNA芯片)捕获于对应于靶标的探针位置并进行荧光检测。然而，PCR扩增、使用DNA芯片的方法的定量分析精度低，期待精度高的基因表达剖面分析方法。随着人类基因组分析的完成，强烈需要对于基因表达的定量研究，近来，期望从单个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。作为定量性好的分析方法，有定量PCR，其为下述方法:准备具有与靶标相同的DNA序列的标准试样，在同样的条件下进行PCR扩增，利用荧光探针对扩增的进行情况进行监测并进行比较，从而进行定量分析。当靶标为单细胞时，初始的mRNA的数量少，难以进行定量分析。此外，为了进行多个基因表达的定量分析，将试样分割分别独立地进行定量分析，因此在作为对象的基因的数量多、包括表达量低的基因的情况下，有时无法通过试样分割进行测定。
[0003]在这样的状况下，发明人等考察了下述方法:将全部mRNA变更为cDNA，制作保持于珠子上的cDNA文库(包括全部cDNA的cDNA集合体)并用于定量分析。这表明，通过重复利用cDNA文库，消除了试样分割导致的微量表达基因的测定误差，能够正确地测定单细胞中所含的多个基因的表达量(非专利文献I)。
[0004]上述方法对于通过手工操作进行的反应试剂向含有样品的溶液中的混合、纯化等工艺全部通过手工操作进行。因此，由于分注精度和溶剂的蒸发的问题，反应溶液的体积限于数百纳升?微升等级以上。因此，在对单个细胞进行分析时，还必须使用浓度适当的试剂，因此，反应试剂量(摩尔数)与反应体积成比例增加，试剂成本与此成比例增加。在必须测定多个细胞获得具有统计学意义的数据时，其试剂成本成为非常大的数额。因此，需要利用没有分注精度和蒸发的问题的结构降低反应体积的方法。
[0005]为了解决这个问题，以往采用了使用组合有被称为微流路的小的流路的器件的方法。为了进行单细胞分析而应用微流路的例子记载于非专利文献2。非专利文献2中的图1记载了器件的结构图。其中记载的芯片配置有300个单个单元结构，从而能够同时处理300个细胞。该单元结构在芯片上配置有3X50个，是下述结构:单元结构为长方形，样品溶液在其长度方向上流动，一边流动一边逐级反应。关于反应体积，逆转录反应时为10nL，PCR反应时为50nL，减少了体积。
[0006]进而，为了同时处理大量细胞，需要一次性低成本地对多个细胞进行基因表达分析。为了实现该目的，专利文献I公开了利用多孔质膜等代替珠子来构成cDNA文库的方法。该方法中，使用了能够获得基因表达的二维分布、实现多个细胞中的基因表达分析的器件。使用该器件对单细胞中的基因进行表达分析时无需分离细胞，还可以直接从生物体组织的切片中的细胞提取mRNA进行基因表达分析。然而，为了增加能够分析的基因的数量，需要重复、与测定基因数成比例地进行荧光测定、化学发光测定。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:日本特开2009-276883号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:自然方法第6卷第7期2009年p.503-506 (Nature Methodvol.6, n0.7, 2009, p.503-506)
[0012]非专利文献2:美国科学院院刊第108卷、第34期2011年p.13999-14004 (Proceeding of the Nat1nal Academy of Sciences vol.108, n0.34, 201lp.13999-14004)
【发明内容】
[0013]发明所要解决的课题
[0014]对于再生医学、使用基因进行的诊断或生命现象的基本理解而言，不仅是组织的平均基因表达量、也开始重视对构成组织的一个个细胞的内容物定量地进行分析。对此，期望将细胞一个个地取出并详细地进行分析，同时为了获得具有统计意义的数据，对于多个细胞的细胞中的生物物质进行定量。尤其期望对各种基因的表达量进行定量监测。此时，作为定量对象的生物物质是细胞中的mRNA。这里，为了简便起见，认为基因与mRNA —一对应，对基因表达进行定量与对mRNA进行定量含义相同。一般而言，“测定基因表达”的含义更为宽泛。这种情况下，测定中考虑了从一个基因座读取的mRNA存在多个变异(突变体)、在mRNA的成熟过程、翻译成蛋白的过程中受到各种调控，需要根据需要增加测定对象物质，这里，为了简化讨论，是指对成熟的mRNA进行定量。
[0015]对应于单个细胞中表达的基因的mRNA有分布在数分子数程度至数万分子的可能性。为了高精度地对对应于分子数少的基因的mRNA进行定量，需要转变为效率高、能够定量的形式。因此，通过将来自单个细胞的cDNA文库有效地(80%以上)构建在非专利文献I中记载的珠子上表面，重复对其进行测定，从而能够高精度地对多个基因的基因表达进行定量，但其重复次数限于10?20次左右，因此存在能够测定的基因数也限于10?20个的问题。能够同时测定的细胞数在100细胞左右以下，所需试剂的费用也非常高。因此认为，能够针对多个细胞测定多个、且仅测定需要测定的基因数是产业上重要的技术。
[0016]此外，为了进行单细胞中的基因表达分析，需要一次性分离细胞并导入到各个反应孔中，进行细胞破碎、逆转录，进而将用于PCR扩增的试剂分注至这些反应孔。因此，为了进行分析的自动化，需要用于分注的机器人，分析装置会大型化，价格高。
[0017]进而，当为了避免利用机器人进行分注而使用微流路从细胞提取mRNA进行核酸扩增时，必须使反应液流路列状排列，因此芯片尺寸与排列数成比例地增大，因此，存在微流路器件的尺寸大型化、价格高的问题。
[0018]实际上，如非专利文献2的图1的左下所示，将作为分析对象的细胞导入到最左边的反应槽，使细胞破碎。随后，将样品溶液移至右侧的反应槽，进行逆转录反应，进一步向右移动，进行PCR反应，以这种方式，一边在一个方向上使样品在平面内移动，一边进行样品处理。最后，从最右边回收处理过的样品。当使用微流路时，需要使溶液在基板面内移动，因此单元结构的印记会增大。此外，为了配置向单元结构导入样品、试剂的流路体系；配置处理后的样品排出所需的流路体系，需要占用芯片面积，因此存在如果增加单元结构的序列数，则芯片面积增大、芯片的成本增加的问题。
[0019]该非专利文献2中，关于细胞中的mRNA中的何种程度的比例能够作为样品进行处理、测定、定量仍不明确，为了对单细胞分析中的mRNA等生物化学物质进行定量，本质上的课题在于，能够有效地对靶分子(尤其是mRNA)进行测定。例如，必须对在一个细胞中仅以10分子左右以下的量存在的mRNA进行测定，但如果以能够测定的方式进行了处理的样品的分子数少，则会产生本质上的测定误差(符合泊松分布的取样误差)。
[0020]此外，为了对多个细胞一次性低成本地实现基因表达分析，专利文献I中公开了使用cDNA文库片的方法。虽然能够进行多个细胞的批量测定，但是为了增加能够分析的基因的数量，需要重复使用cDNA文库进行荧光测定。因此，分析基因数量存在限制。
[0021]用于解决课题的方法
[0022]上述课题，即为了提供增加能够一次性测定的细胞数、同时有效地对细胞中的分子(这里是mRNA)进行样品处理的价格低廉的测定器件或装置，本发明中，设为如下所述的器件和装置构成。
[0023]将能够对各细胞进行样品处理的单元结构配置成二维平面状，该样品处理是:将细胞固定于规定的位置，从核酸提取作为定量对象分子的mRNA，进行逆转录，构建cDNA文库等。来自细胞的样品流动的方向垂直于平面状的器件面而将单元结构配置成芯片面状，从而实现了单元结构固定于芯片上的面积的减小。此外，关于样品溶液的回收，将用配置于平面上的单元结构处理过的样品混合并回收，在样品处理的过程中，导入通过对用哪个位置的单元结构处理过的各样品进行分析来辨别的标签序列(标签分子)。由此，不再需要用于按单元结构分别进行样品回收的机构。
[0024]S卩，本发明包括以下的发明。
[0025](I) 一种核酸提取器件，其特征在于，具有:
[0026]用于固定各个单个细胞的细胞捕获部，
[0027]用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路，
[0028]介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部，以及
[0029]将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路，
[0030]所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
[0031](2)根据(I)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含固定有用于核酸捕获的DNA的珠子。
[0032](3)根据(I)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含细孔中固定有用于核酸捕获的DNA的多孔质膜。
[0033](4)根据⑴?(3)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部固定有与细胞表面的物质化学结合的物质。
[0034](5)根据⑵或(3)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含用于确定在芯片上的位置的序列。
[0035](6)根据⑵或(3)所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含根据所捕获的核酸分子的不同而不同的序列。
[0036](7)根据(6)所述的核酸提取器件，其特征在于，具有导入用于对所述核酸捕获部所捕获的RNA进行逆转录的酶的单元。
[0037](8)根据⑴?(7)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方由光学透明的材料构成。
[0038](9)根据(I)?(8)中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方设有核酸捕获部。
[0039](10)根据⑴?⑶中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方以外的区域设有核酸捕获部。
[0040](11) 一种核酸处理装置，其特征在于，具有(I)?(10)中任一项所述的核酸提取器件和导入用于构建cDNA文库的试剂的单元。
[0041](12) 一种核酸处理装置，其特征在于，具有(I)?(10)中任一项所述的核酸提取器件以及导入用于构建cDNA文库的试剂和用于核酸扩增的试剂的单元。<