具有增强的l-缬氨酸生产力的菌株及使用菌株的l-缬氨酸生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及具有增强的心鄉氨酸生产力的菌株W及使用所述菌株生产k鄉氨酸 的方法。
【背景技术】
[0002] 在微生物中，k鄉氨酸（支链氨基酸的一种）是从丙酬酸开始，经由乙酷乳酸、二 径基异戊酸和酬异戊酸生物合成的。通过乙酷径酸合酶、乙酷径酸还原异构酶、二径酸脱水 酶和转氨酶B催化的反应产生运些中间代谢产物。然而，运些酶还参与从下酬酸和丙酬酸 开始的k异亮氨酸的生物合成，而且k亮氨酸也从酬异戊酸（一种中间代谢产物）开始， 经由2-异丙基苹果酸、3-异丙基苹果酸和酬异己酸生物合成。因此，因为支链氨基酸（即 k鄉氨酸a-异亮氨酸和k亮氨酸）使用相同的酶用于其生物合成过程，所W已知工业上 通过发酵生产一种类型的支链氨基酸具有难度。此外，存在的一个问题是工业的批量生产 受到由k鄉氨酸（其为终产物）或其衍生物引起的反馈抑制的限制。
[0003] 在做出了很大努力来开发具有增强的心鄉氨酸生产力的菌株之后，本发明人发 现，经转化而具有失活的k鄉氨酸操纵子调节区的菌株比母本菌株具有更优异的k鄉氨 酸生产力，从而完成了本发明。
[0004] [现有技术文献] 阳00引[专利文献]
[0006] (专利文献 1)KR10-1990-0007948B1
[0007] (专利文献 2)KR10-2008-0025355A1
【发明内容】
阳00引技术问题
[0009] 本发明的一个目的是提供一种新的经转化的k鄉氨酸生产菌株，其通过完全缺 失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调节区中编码前导肤的核巧酸序列增强了k鄉氨酸 操纵子的表达。
[0010] 本发明的另一个目的是提供通过使用所述新的k鄉氨酸生产菌株来生产k鄉氨 酸的方法。
[0011] 本发明的再一个目的是提供ilvBN操纵子的调节区变体。 阳〇1引技术方案
[0013] 本发明的一个实施方案提供了新的经转化的k鄉氨酸生产菌株，其通过完全缺 失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调节区中编码前导肤的核巧酸序列解除了对k鄉氨 酸操纵子的弱化控制，其中所述前导肤如SEQIDNo:1的氨基酸序列所示。
[0014] 本发明的另一个实施方案还提供了通过使用新的k鄉氨酸生产菌株来生产心鄉 氨酸的方法。
[0015] 此外，本发明的另一个实施方案提供了k鄉氨酸操纵子的调节区变体，其具有如 SEQIDNo:3或SEQIDNo:4所示的氨基酸序列。
[0016] 有益效果
[0017] 如上所述，存在运样的效果：通过完全缺失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调 节区中编码前导肤的核巧酸序列，由于乙酷径酸合酶（一种参与k鄉氨酸生物合成的酶） 的表达提高，本发明的新的k鄉氨酸生产菌株具有增强的k鄉氨酸生产力，其中所述前导 肤如SEQIDNo:1的氨基酸序列所示。
[0018] 此外，根据使用本发明的新的k鄉氨酸生产菌株来生产k鄉氨酸的方法，存在W 高效率和高产率生产k鄉氨酸的效果。
【附图说明】
[0019] 图1是示出了ilvBN操纵子的示意图，其包括：野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032的 ilvBN操纵子的调节区；调节区变体值valL)，其中编码前导肤的整个核巧酸序列缺失；调 节区变体值valP)，其中前导肤中的暂停位点缺失；调节区变体值valS)，其中前导肤中之 暂停位点的最后一个氨基酸被替换为终止密码子；和调节区变体值valA)，其中前导肤和 弱化子两者均缺失。
[0020] 图2是示出了野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032之ilvBN操纵子的调节区的详细 图。
[0021] 图3是图1的调节区变体值valL)的详细图，其中编码前导肤的整个核巧酸序列 缺失。
[0022] 图4是图1的调节区变体值valP)的详细图，其中前导肤中的暂停位点缺失。
[0023] 图5是图1的调节区变体值valS)的详细图，其中前导肤中之暂停位点的最后一 个氨基酸被替换为终止密码子。
[0024] 图6是图1的调节区变体值valA)的详细图，其中前导肤和弱化子两者均缺失。 阳0巧]本发明的实施方式
[00%] 本发明的一个实施方案设及新的经转化的k鄉氨酸生产菌株，其通过完全缺失 或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调节区中编码前导肤的核巧酸序列增强了心鄉氨酸操 纵子的表达，其中所述前导肤如SEQIDNo:1的氨基酸序列所示。
[0027] 在本发明中，术语鄉氨酸操纵子（ilvBN操纵子）"包含编码乙酷径酸合酶的 基因ilvBN，其是在产生k鄉氨酸的微生物中参与心鄉氨酸生物合成的第一步并且由2分 子的丙酬酸合成乙酷乳酸的酶。
[0028] 更具体地，ilvBN操纵子包含调节区和编码乙酷径酸合酶的结构基因，其中所述调 节区包含启动子、编码前导肤的核巧酸序列、位于前导肤的暂停位点（pausesite)和弱化 子（参见，图1和。。
[0029] 在本发明中，通过完全缺失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调节区中编码前导 肤的核巧酸序列，增强了编码乙酷径酸合酶的结构基因的表达，从而改善了k鄉氨酸生产 力。具体地，编码前导肤的核巧酸序列中的部分缺失或替换的位点可能在暂停位点中，更具 体地，暂停位点的末端可被替换为终止密码子。
[0030] 在本发明中，为了提供通过完全缺失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的调节区中 编码前导肤的核巧酸序列来增强k鄉氨酸操纵子之表达的新的经转化的k鄉氨酸生产菌 株，首先，可构建重组载体，所述重组载体在ilvBN操纵子的调节区中具有完全缺失的或部 分缺失的或替换的编码前导肤的核巧酸序列。
[0031] 在本发明的一个具体的实例中，为了构建所述载体，使用棒杆菌属 (CorynebacteriumSP.)的染色体作为模板，通过聚合酶链式反应扩增在ilvBN操纵子的 调节区值va比、DvalP、DvaK)中具有完全缺失的或部分缺失的或被替换的编码前导肤的 核巧酸序列的调节区。然后，将扩增的调节区插入到载体中W构建重组载体。此后，分别用 所述重组载体转化母体菌株。
[0032] 用于构建重组载体的载体可W是天然状态或重组状态的质粒、黏粒、病毒或隧菌 体。例女日，P肥15、113、入EMBL3、入EMBL4、入FIXII、入DA甜II、入ZAPII、入gtlO、入gtll、 化aronAA和化aronSlA等可用作隧菌体载体或黏粒载体；并且pDZ载体、基于地R、基于 pUC、基于地luescriptll、基于pGEM、基于pTZ、基于P化和基于祀T的载体等可用作质粒载 体。可用的载体没有特别的限制，而且也可使用已知的表达载体。
[0033] 在本发明的一个具体的实例中，使用pDZ。载体pDZ是一种用于插入到棒杆菌属的 微生物之染色体中的载体，其由在韩国专利公开No. 2008-0025355中所公开的方法制备。
[0034] 通过将扩增的调节区值valLDvalP和DvaK)分别插入到pDZ载体中，来构建重 组载体pDZDva化、pDZDvalP和pDZDvalS。
[0035] 在本发明中，通过重组载体待转化的母体菌株可W是能够产生k鄉氨酸的任何 微生物，而不受特别的限定。具体地，可使用埃希氏菌属巧scherichiaSP.)的微生物或 棒杆菌属的微生物，更具体地，可使用谷氨酸棒杆菌。更具体地，可使用谷氨酸棒杆菌ATCC 13032作为母体菌株。此外，可使用对k鄉氨酸或其衍生物有抗性的k鄉氨酸生产菌株， 具体地，可使用谷氨酸棒杆菌KCCM11201P。
[0036] 在使用谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutami州m)KFCC10661 (韩国专利申请 号1988-0016543 ;公开号1990-0007948)作为母体菌株进行随机诱变后，当在一起添加了 a氨基下酸（ABA)、a-径基鄉氨酸（AHV)、嚷挫丙氨酸灯A)和正鄉氨酸（NV)的基本培养 基上扩散时，谷氨酸棒杆菌KCCM11201P(本发明人在先前注册的专利No. 10-1117022中公 开的菌株）是对浓度分别为20mM、20mM、40mM和50mM的a-ABA、AHV、TA和NV具有共同抗 性的变体。其中ABA是异亮氨酸衍生物，AHV、TA和NV是鄉氨酸衍生物。共同抗性的变体是 具有提高的k鄉氨酸生产力的优秀菌株，其比母体菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10661的k鄉 氨酸生产力提高了 4倍。
[0037] 已经发现1(01111336?、1(01111337?和1(01111338?(运些是具有重组载体的谷氨酸 棒杆菌KCCM11201P的转化菌株）比母体菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11201P具有更优异的k鄉 氨酸生产力。 W38] 谷氨酸棒杆菌KCCM11336P是通过用重组载体pDZDvalL转化谷氨酸棒杆菌KCCM11201P而产生的菌株。通过将调节区变体值valL)插入到pDZ载体中来制备pDZva化， 其中所述调节区变体值valL)缺失了编码前导肤（具有SEQIDNo:1的氨基酸序列）的整 个核巧酸序列。谷氨酸棒杆菌KCCM11336P被命名为KCJ-456并于2012年11月19日保藏 于韩国微生物保藏中屯、，登记号KCCM11336P。 W39] 谷氨酸棒杆菌KCCM11337P是通过用重组载体pDZDvalP转化谷氨酸棒杆菌 KCCM11201P而产生的菌株。通过将调节区变体值val巧插入到pDZ载体中来制备pDZvalP， 其中所述调节区变体值val巧在具有SEQIDNo:1的氨基酸序列的前导肤中缺失了暂停位 点。谷氨酸棒杆菌KCCM11337P被命名为KCJ-457并于2012年11月19日保藏于韩国微生 物保藏中屯、，登记号KCCM11337P。
[0040] 谷氨酸棒杆菌KCCM11338P是通过用重组载体pDZDvalS转化谷氨酸棒杆菌 KCCM11201P而产生的菌株。通过将调节区变体值v