前导肤和暂停位点的序列分别如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2 所示，而DvalP和DvalS的氨基酸序列分别如SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示。 W例此外，k鄉氨酸操纵子ilvBN的整个调节区的核巧酸序列、前导肤的核巧酸序列 和暂停位点的核巧酸序列分别如SEQIDNo:21，SEQIDNo:22和SEQIDNo:23所示。 Dva化、DvalP、DvalS和DvalA的核巧酸序列分别如沈QIDNo:24至沈QIDNo:27所示。
[0070] 实施例2 :衍生自心鄉氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11201P的具有k鄉氨酸 操纵子失活调节区之菌株的构建
[0071] 为了构建具有k鄉氨酸操纵子经修饰调节区的菌株，将k鄉氨酸生产菌株谷氨 酸棒杆菌KCCM11201P用作母体菌株。
[0072] 通过电穿孔，用在实施例1中构建的pDZDva化、pDZDvalP、pDZDvalS和pDZDvalA 载体分别转化谷氨酸棒杆菌KCCMl120IP。
[0073] 通过第二次交叉过程，获得了在谷氨酸棒杆菌KCCM11201P的染色体上分别具有 k鄉氨酸操纵子经修饰调节区的k鄉氨酸生产菌株。
[0074] 通过分析祀位点的核巧酸序列，最终证实启动子中的碱基替换；当使用SEQID No:8的引物与DvalL和沈QIDNo:15的引物；DvalP和沈QIDNo:16的引物；DvalS和 SEQIDNo:17的引物；W及DvalA和SEQIDNo:18的引物的组合时，通过PCR分析基因是 否被扩增。 阳0巧]用pDZDva化、pDZDvalP和pDZDvalS载体转化的菌株分别被命名为谷氨酸棒杆菌KCJ-456、谷氨酸棒杆菌KCJ-457和谷氨酸棒杆菌KCJ-458,并于2012年11月19日保藏于 韩国微生物保藏中屯、，登记号分别为KCCM11336P、KCCM11337P和KCCM11338P。
[0076] 此外，将用pDZDvalA载体转化的菌株定名为谷氨酸棒杆菌KCCM11201P_DvalA。
[0077] 实施例3 :用于k鄉氨酸生物合成的具有k鄉氨酸操纵子失活调节区之过表达 载体的构建
[0078] 由谷氨酸棒杆菌KCCM11201P(其是k鄉氨酸生产菌株）构建用于k鄉氨酸生物 合成的过表达载体。 W79] 此外，由在实施例2中制备的谷氨酸棒杆菌KCCM11336P、谷氨酸棒杆菌 KCCM11337P、谷氨酸棒杆菌KCCM11338P和谷氨酸棒杆菌KCCM11201P_DvalA各自构建具有k鄉氨酸操纵子经修饰调节区的表达载体。
[0080] 为了构建所述载体，使用SEQIDNo: 19和SEQIDNo:20的引物，使用谷氨酸棒 杆菌KCCM11201P、谷氨酸棒杆菌KCCM11336P、谷氨酸棒杆菌KCCM11337P、谷氨酸棒杆菌 KCCM11338P和谷氨酸棒杆菌KCCM11201P_DvalA的染色体DNA作为模板，通过PCR法扩增基 因。然后，用限制性酶Ba恤I和甜al处理扩增的基因，然后将其插入到用相同的酶处理过 的祀CCG117载体中W构建用于k鄉氨酸生物合成的各种过表达载体，所述过表达载体是 pECCGl17-DvalW、pECCG117-DvalL、pECCGl17-DvalP、pECCGl17-DvalS和pECCGl17-DvalA。
[0081] 实施例4 :用于k鄉氨酸生物合成的具有k鄉氨酸操纵子失活调节区之过表达 菌株的构建
[0082] 通过电穿孔将在实施例3中制备的各种表达载体祀CCG117-DvalW、 pECCG117-Dva化、祀CCG117-DvalP、pECCG117-DvalS和祀CCG117-DvalA引入到谷氨酸棒 杆菌ATCC13032中W分别构建谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalW、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_ DvalL谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalP、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalS和谷氨酸棒杆菌 ATCC13032_DvalA。当载体被转化，就获得了卡那霉素抗性。因此，通过研究在含有25iig/ mL浓度之卡那霉素的培养基中是否发生生长来证实转化。
[0083] 实施例5 :在具有k鄉氨酸操纵子失活调节区的菌株中生产k鄉氨酸
[0084] 为了从各种k鄉氨酸生产菌株生产k鄉氨酸，按照如下方法培养在实施例2中 制备的谷氨酸棒杆菌KCCM11336P、谷氨酸棒杆菌KCCM11337P、谷氨酸棒杆菌KCCM11338P和 谷氨酸棒杆菌KCCM11201P_DvalA。培养谷氨酸棒杆菌KCCM11201P(其是母体菌株）作为对 照。 W85] 此外，通过与上述用于生产心鄉氨酸相同的方法来培养谷氨酸棒杆菌 ATCC13032_DvalW、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalL、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalP、谷氨 酸棒杆菌ATCC13032_DvalS和谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalA菌株。
[0086] 将一个销环的菌株接种到含有25mL生产培养基的250mL角挡板 (盈1冬碑蓄喜司么互叫 1 ):烧瓶中，并在3〇。(：下^2〇〇巧m进行生产72小时。生产培 养基的组成示于下表1中。
[0087] 培养完成后，通过HPLC测定产生的k鄉氨酸的量。在培养基中每种菌株的k鄉 氨酸浓度示于下表2和表3中。
[0088] 表 1
[0089]
[0090] 表 2
[0091] 谷氨酸棒杆菌KCCM11201P、KCCM11336P、KCCM11337P、KCCM11338P和KCCM11201P_ DValA的鄉氨酸生产力
[0092]
[0093] 表 3
[0094] 谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DValW、ATCC13032_DVa化、ATCC13032_DValP、 ATCC13032_DValS和ATCC13032_DValA的鄉氨酸生产力 阳0巧]
阳〇化]如表2所示，已经发现除了谷氨酸棒杆菌KCCM11201P_DValA，经转化的使k鄉氨 酸操纵子的调节区失活的菌株与k鄉氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11201 (其为母体菌 株）相比具有改善的心鄉氨酸生产力。具体地，谷氨酸棒杆菌KCCM11338P与母体菌株相 比示出改善了 25%的心鄉氨酸的生产力。
[0097] 此外，如上表3所示，已经发现k鄉氨酸生产菌株（其为具有k鄉氨酸操纵子修 饰调节区的谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalL、谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalP和谷氨酸棒 杆菌ATCC13032_DvalS菌株）具有比谷氨酸棒杆菌ATCC13032_DvalW(其被转化W具有谷 氨酸棒杆菌KCCM11201P的k鄉氨酸操纵子的调节区）高9至13倍的k鄉氨酸生产力。
[0098] [符号说明]
[0099] Pro:启动子
[0100] Leader化ptide:编码前导肤的核巧酸序列 阳101] Pausesite:暂停位点
[0102] Attenuator:弱化子
[0103] Gene:结构基因
[0104] [登记号] 阳105] 保藏机构名称：韩国微生物保藏中屯、（国际） 阳 106]登记号：KCCM11336P阳107] 登记日期：20121119 阳10引保藏机构名称：韩国微生物保藏中屯、（国际） 阳 109]登记号：KCCM11337P[0110]登记日期：20121119 阳111] 保藏机构名称：韩国微生物保藏中屯、（国际） 阳11引 登记号：KCCM11338P阳113] 登记日期：20121119 阳114] 阳115] 阳116]
【主权项】
1. 经转化的L-缬氨酸生产菌株，其通过完全缺失或部分缺失或替换ilvBN操纵子的 调节区中编码前导肽的核苷酸序列来增强L-缬氨酸操纵子的表达，其中所述前导肽如SEQ IDNo:1的氨基酸序列所示。2. 根据权利要求1所述的菌株，其中所述前导肽包含如SEQIDNo:2所示的氨基酸序 列的暂停位点。3. 根据权利要求2所述的菌株，其中编码所述暂停位点的核苷酸序列的全部或部分缺 失，或者编码所述暂停位点的核苷酸序列的一部分被替换。4. 根据权利要求3所述的菌株，其中编码所述暂停位点的SEQIDNo:23的核苷酸序 列的第13位至第15位核酸被替换为终止密码子。5. 根据权利要求1所述的菌株，其中所述菌株是棒杆菌属（Corynebacteriumsp.)的 微生物。6. 根据权利要求5所述的菌株，其中所述菌株是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)〇7. 生产L-缬氨酸的方法，所述方法包括： 在培养基中培养根据权利要求1至6中任一项所述的菌株； 从所述菌株的培养基中回收L-缬氨酸。 8. L-缬氨酸操纵子的调节区变体，其具有如SEQIDNo:3或SEQIDNo:4所示的氨基 酸序列。
【专利摘要】本发明涉及新的L-缬氨酸生产菌株，其被转化以使得L-缬氨酸操纵子的调节区中编码前导肽的碱基序列完全缺失或部分缺失或替换，从而加强L-缬氨酸操纵子的表达。此外，本发明涉及用于使用所述新的L-缬氨酸生产菌株生产L-缬氨酸的方法。根据新的缬氨酸生产菌株以及使用所述菌株的本发明L-缬氨酸生产方法，存在以高效率和高产率生产L-缬氨酸的有益效果。KCCM11336P20121119
【IPC分类】C12N15/63, C12N15/77, C12P13/08, C12N1/21
【公开号】CN105026550
【申请号】CN201480013323
【发明人】金蕙园, 李智惠, 宋秉哲, 金宗贤, 李翰衡, 全爱智
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】WO2014142463A1