具有诱导il-12产生的能力的乳酸杆菌以及用于培养其的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及具有诱导比-12产生的能力的乳酸杆菌（乳杆菌，乳酸菌， Lactobacillus)及其生产方法。
【背景技术】
[0002] 已知乳酸杆菌属具有除了改善肠内菌群的作用之外，具有缓解过敏反应症状或者 改善免疫活性的作用。例如，比-12是由抗原呈递细胞，如树突细胞（树状细胞，demlritic cell)或巨隧细胞分泌的细胞因子。在运种情况下，比-12是非常有效的免疫刺激剂，该免 疫刺激剂激活直接攻击癌细胞或者增强丫 -干扰素（IFN-丫）的产生的天然杀伤细胞（NK 细胞）、淋己因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）或杀伤T细胞（CTL细胞）。同样，比-12具 有将化1/化2平衡移向化1的免疫调节功能。已知乳酸杆菌属具有诱导IL-12产生的能力 (专利文献1)。当乳酸杆菌属经口服摄取时，它可W直接作用于免疫活性细胞参与消化道 免疫W诱导IL-12产生，从而促进过敏症状的免疫刺激或缓解过敏症状。
[0003] 同时，使用多种培养基W培养乳酸杆菌属。在运种情况下，已经普遍使用具有包括 酵母提取物、蛋白腺、肉提取物等的丰富营养物的培养基W促进乳酸杆菌属的生长。然而， 由于乳酸杆菌属的代谢物（例如，乳酸等）引起培养基的抑下降，因此菌种的增殖受到抑 审IJ。因此，进行其中培养基的抑调节在中性抑附近的中和培养。
[0004] 同样，已知培养基条件对乳酸杆菌属的活性是有影响的。例如，专利文献2公开 了通过使用包括玉米浸液（玉米浆，cornste巧liquor)与酪蛋白水解产物的培养基培养 乳酸杆菌属获得了具有高免疫刺激效果的乳酸杆菌菌株。此外，专利文献3公开了通过在 培养基中（pH3. 5至pH5.0)中培养乳酸杆菌属获得了具有高免疫调节效果的乳酸杆菌菌 株。 阳0化][现有技术文献]
[0006] [专利文献]
[0007] (专利文献1)日本专利第4621218号
[0008] (专利文献2)日本专利特许公开第2004-41099号
[0009] (专利文献3)国际公开第2007/138993号
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 然而，如在专利文献2和3中公开的改变培养基条件W增强乳酸杆菌属的活性的 技术在降低生产成本从而培养乳酸杆菌属W获得大量的乳酸杆菌菌株方面是相当不利的， 并且因此，不存在与该技术相容的常规技术。
[0012] 因此，本发明的一个方面提供了能够制备大量的乳酸杆菌菌株并且提高乳酸杆菌 菌株的活性的新技术。 阳〇1引技术方案
[0014] 本发明人已经进行了研究W解决上述问题，并且发现，当进行中和培养W制备乳 酸杆菌菌株从而获得大量的乳酸杆菌属时，与不调节抑培养乳酸杆菌属相比，乳酸杆菌属 的活性下降，但通过将乳酸杆菌属保持在对于中和培养后的培养后期的乳酸杆菌属并不期 望的环境中，乳酸杆菌属的活性可W恢复或进一步增强。因此，基于运些事实已经实现了本 发明。
[0015] 目P，如下设定的，本发明提供了能够诱导产生IL-12的乳酸杆菌菌株，及其制备方 法。
[0016] [1] 一种用于制备具有诱导产生IL-12的能力的乳酸杆菌菌株的方法，该方法的 特征在于，它包括将碱性化学物质添加至培养基中W调节pH，在培养基中培养乳酸杆菌属， 并且在培养的后期通过施加应力将乳酸杆菌属灭菌。
[0017] [2]段落[1]的用于制备具有诱导产生IL-12的能力的乳酸杆菌菌株的方法，其 中，应力是选自由W下组成的组中的至少一种：(a)在不添加碱性化学物质的情况下培养 乳酸杆菌属；化）在其中乳酸杆菌属增殖受到抑制的溫度范围培养乳酸杆菌属；(C)在培养 肉汤（培养液，cul化rebroth)中添加1重量％或更多的盐之后培养乳酸杆菌属；W及（d) 在P册或更低培养乳酸杆菌属。
[001引閒段落山或者凹的用于制备具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌菌株的 方法，其中，培养后在培养肉汤中对乳酸杆菌属进行灭菌，并且随后收集。
[0019] W]段落山至閒中任一项的用于制备具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌 菌株的方法，其中，乳酸杆菌属分离自植物。
[0020] 閒段落山至M中任一项的用于制备具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌 菌株的方法，其中，乳酸杆菌属是属于植物乳杆菌化actobacillusplantarum)、乳酸乳球 菌乳月旨种（L曰ctococcus1曰ctissp.cremoris)、粪月射求菌巧nterococcusf曰ec曰lis)或短 乳杆菌（Xactobacillusbrevis)的微生物。
[OOW [6]段落山至閒中任一项的用于制备具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌 菌株的方法，其中，在80°C或更高对乳酸杆菌属进行灭菌。 阳0巧 [7]段落閒的用于制备具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌菌株的方法，其 中，进行相应的灭菌使得亮度L*值小于或等于65W及色度a*值大于或等于-4,亮度L*和 色度a*值是由W下获得：在培养后在培养肉汤中对乳酸杆菌属灭菌，通过使培养肉汤进行 离屯、、膜分离或沉淀除去培养基，将5g获得的具有4重量％至7重量％的固体含量的菌株 浓缩物加入至直径为35mm的石英玻璃培养皿（Petridish)，并且测量对于菌株浓缩物自 身的L相冲*颜色体系的比色颜色。
[0023] [引一种具有诱导产生IL-12的能力的乳酸杆菌菌株，其特征在于，其通过W下获 得：将碱性化学物质添加至培养基中W调节抑，在培养基中培养乳酸杆菌属，并且在培养 的后期通过施加应力将乳酸杆菌属灭菌。
[0024] [9]段落[引的具有诱导产生IL-12的能力的乳酸杆菌菌株，其通过培养后在培养 肉汤中将乳酸杆菌属灭菌，接着收集乳酸杆菌属。
[00对 [10]段落閒或[9]的具有诱导产生比-12的能力的乳酸杆菌菌株，其通过在 80°C或更高对乳酸杆菌属进行灭菌获得。
[00%] [11]段落巧]的具有诱导产生IL-12的能力的乳酸杆菌菌株，其通过w下获得： 进行相应的灭菌使得亮度L*值小于或等于65W及色度a*值大于或等于-4,亮度L*和色 度a*值是由W下获得：在培养后在培养肉汤中对乳酸杆菌属灭菌，通过使培养肉汤进行离 屯、、膜分离或沉淀除去培养基，将5g获得的具有4重量％至7重量％的固体含量的菌株浓 缩物加入至直径为35mm的石英玻璃培养皿，并且测量对于菌株浓缩物自身的L相冲*颜色 体系的比色颜色。
[0027] 有益效果
[002引根据本发明的一个示例性实施方式，由于中和培养，乳酸杆菌属的活性下降，特别 地，通过对乳酸杆菌属进行中和培养可W恢复或进一步增强诱导产生IL-12的能力W增强 乳酸杆菌属的生长能力，从而获得大量的乳酸杆菌菌株，并且将乳酸杆菌属保持在对于中 和培养后的后期培养阶段的乳酸杆菌属的生长不希望的环境。因此，可W降低制备成本，并 且还制备具有高活性的乳酸杆菌菌株。
【附图说明】
[0029] 图1是通过比较在培养乳酸杆菌菌株后没有灭菌的乳酸杆菌菌株的染色状态与 通过在预定条件下对乳酸杆菌菌株灭菌并且收集乳酸杆菌菌株而获得的乳酸杆菌菌株的 染色状态所获得的图像。
【具体实施方式】
[0030] 只要乳酸杆菌属具有诱导IL-12产生的能力，则对于本发明中使用的乳酸杆菌 属并不特别限制。例如，乳酸杆菌属可W包括属于肠球菌属的微生物，例如粪肠球菌和尿 肠球菌；属于乳酸杆菌属的微生物，如嗜酸乳酸杆菌化actobacillusacido地ilus)、加氏 乳酸杆菌化.gasseri)、马里乳酸杆菌（L.mali)、植物乳酸杆菌（L.plantarum)、布氏乳酸 杆菌（L.buchneri)、干酪乳酸杆菌（X.casei)、约氏乳酸杆菌（X.johnsonii)、鸡乳酸杆菌 (L.gallinarum)、食淀粉乳酸杆菌（L.amylovorus)、短乳酸杆菌（L.brevis)、鼠李糖乳酸 杆菌（L.rhamnosus)、开菲尔乳酸杆菌化.kefir)、类干酪乳酸杆菌化.paracasei)、和卷 曲乳酸杆菌化.crispatus);属于链球菌的微生物，如嗜热链球菌的微生物（Str巧tcoccus thermo地ilus);属于乳球菌属如乳酸乳球菌化actococcuslactis);属于乳酸乳球菌乳 脂种化actococ州Slactissp.cremoris)的微生物；属于双歧杆菌属的微生物，如两歧双 歧杆菌化bifidum)、长双歧杆菌度.longum)、青春双歧杆菌化adolescentis)、婴儿双歧 杆菌度.infantis)、短双歧杆菌度.breve)，W及链状双歧杆菌度.catenulatum)等。
[0031] 如随后将在实施例中描述的，由于菌株具有明显的协同作用，在乳酸杆菌属中，特 别优选应用分离自植物的植物乳酸杆菌或短乳酸杆菌。
[0032] 根据本发明的一个示例性实施方式，在培养之前，乳酸杆菌属充分生长