专利名称：培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基以及保存该菌株的方法
技术领域：
本发明涉及一种适合于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，该菌株已由本发明人分离并筛选，还涉及保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法。
自然界是一个产生和消亡的大循环，其中的任何生物都无法例外。湿地也是如此，它充满了释放到自然界的腐败蛋白的粘性物质，最终地净化，使地球以亘古以来的方式保持着美丽。虽然这一切发生的机制还远远未能为人所知，但是现在已经知道这主要与微生物的行为相关，因而从中得以开发出现代的各种净化系统，包括活化污泥加工，及其在生活废水和工业废水的处理厂中的应用。如果考虑到涉及此种净化的细菌，其各种特性的方面的复杂性，无疑有必要进行进一步的特别分析和确证。
广泛的各类物质都是此种净化的对象，而又不可能最终对所有的物质进行试验。因而我们的主要方面集中于有气味物质(多为腐败物和有害物的产物)，它们可以方便和快速地通过嗅觉确定，并可以大致分为有气味硫化合物、有气味氮化合物和有气味碳化合物。经过细致的研究，对于小分子有气味化合物，即，有气味硫化合物诸如硫化钠和甲基硫化物、有气味氮化合物诸如氨水、吲哚、和甲基吲哚、以及有气味碳化合物诸如乙酸和丁酸，已经有了结论性的研究结果，使得在净化和除臭的研究上获得了极大的进展。就是说清除细菌获取这些有气味的物质作为食物，而非毒药，并利用它们作为其自身的细胞组分或者能量来源，细菌具有某种特定的带有除臭能力的有效行为。在自然界中已经发现了大量的具有这种特性的细菌，它们不分钟点地辛勤净化，直到它们最满意为止。我们自身的身体也具有一个微观世界，特别是肠道它是一个直接与外部世界相连的器官，它本身也是自然环境的一部分。因此毫无疑问，净化“专家”存在于肠内。
基于上述的发现，本分明人研究了能够寄生于肠道内的非致病性的肠道清洁细菌。即，本发明人在活体内如肠道、口腔、阴道内、以及草本、树叶、农业水果、发酵食品、土壤和下水道中挑选出乳酸杆菌属。结果探查出以前未知的一组能够在肠道中表现出有效净化能力的属于乳酸杆菌属的菌株。这些细菌包括相当宽范围的属于现代分类作乳酸杆菌属的菌种，例如L.casei，L.salivarius，L.brevis，和L.plantarum，它们被统记为乳酸杆菌Lactobacillus clearans。
乳酸杆菌Lactobacillus clearans是新的能够降低硫化钠和氨水的乳酸杆菌(日本已审查的专利申请(Kokoku)4-623)，它是一种有用的细菌，通过降低硫化钠、氨水、甲基硫醇、乙基硫醇、二甲基硫化物、二乙基硫化物、乙醛、甲基吲哚、吲哚、甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺等等，从而在肠道中表现出有效的净化能力。因而，本发明人发现这些能够在肠道中表现出有效的净化能力的乳酸杆菌属的菌种，作为细菌生物学研究的一个发现，这些菌种具有完全新的功能，并被授予了这些菌种的专利(1714431)。显然，乳酸杆菌Lactobacillus clearans不仅仅降低肠道中有气味的有害物质，而且还是一组构成肠道菌群的细菌，能够合成维生素和氨基酸并控制体外细菌的生长，对那些被认为是有益的细菌具有很大的作用，这些有益菌的行为对身体是有好处的诸如免疫活化行为，它们通常是乳酸杆菌属和双歧杆菌属，而相反地，对于那些由于它们的有害性和病原性被认为是有害的细菌，通常是韦荣氏球菌属和梭菌属，诸如韦尔奇氏菌属也具有作用，并且控制病原菌的生长，降低其毒性，等等。表1表示了乳酸杆菌Lactobacillus clearans和通常所知的乳酸杆菌属菌种的功能差异。表1乳酸杆菌Lactobacillus clearans和通常所知的乳酸杆菌属菌种的功能比较
在思考为什么乳酸杆菌Lactobacillus clearans会产生时，可以有下列的推论。诞生时为熔化状态的地球在4,600,000,000年前冷却，产生了水蒸气，形成了最初的海洋。然而还没有氧，但是海洋是由酸性热水组成，含有岩浆产生的硫、铁、等等。有机物质诸如氨基酸和核酸在海洋中于某一时刻通过化学反应合成了一些出来，聚集并浓缩成油滴的形式。最终，油滴诞生了生命形式并不断发展，消耗海洋中的有机原料直至灭绝的边缘。然而，在这些生命形式中，厌氧细菌显然能够利用无机材料诸如溶解于海洋中的硫以获得能量，并从二氧化碳合成有机材料。这些厌氧细菌进化了很长的时间，分化成为最初的光合细菌，它能够释放出氧，它们是今天的乳酸杆菌属古老的祖先。它们在净化来自岩浆的有气味的有害物质中起着重要的作用，还好大多数岩浆沉入了洋底，而氧也增加了，使得环境利于生命继续并逐步繁荣起来，并形成了后来的生命的爆炸现象。在此过程的某一时刻，大多数乳酸杆菌在与其它更为适应的细菌的生长的争斗中屈服了，而适应于浩瀚世界的苛刻环境，离开了充满了碳水化合物、氨基酸、维生素等等的营养富集的生存区域，来到低碳的更为恒定的环境，它们原有的净化能力，即，对有气味的和有害的硫化合物的净化能力和有气味的和有害的氮化合物的净化能力逐渐丢失了。但是乳酸杆菌属直至今天仍保留着利用有气味的碳化合物的能力。
虽然各种熟知的方法诸如冻干、超冷保存、或者液态、湿态、半干、和干态方法或类似的方法都可以用于保存乳酸杆菌Lactobacillusclearans，但是最重要的是在保存中防止丢失乳酸杆菌Lactobacillusclearans能够降低有气味的和有害的物质的特性，而另一个重要的方面是在保存其能力的同时保证较长的成活率。基此特别的考虑，本发明人的研究明确地给出了要求。就是说，在细菌的传代培养中，不论使用何种保存方法，如果存在导致细菌滴度快速下降的物质，不仅滴度会逐渐下降，而且存活率也受到威胁。
冻干法是如今保存细菌的主流方法，乳酸杆菌也不例外。虽然冻干法已经用于各种需要长时间保存的产品诸如抗胃肠气胀或乳酪的菌株，但是基本上乳酸杆菌的可保存性并不认为是很好。实际上，不考虑失效期，采集并复苏国内外商业可购的乳酸杆菌的冻干细胞，均无法获得实际所有产品标称的活细胞数，其中的一些产品甚至未发现活细胞。不论专业技术鉴定和生产商的研究结果如何，事实如此。本发明人关于乳酸杆菌Lactobacillus clearans的研究表明，在一般保存剂中的早期阶段，不仅活细胞数下降，而且会导致滴度的下降。
乳酸杆菌Lactobacillus clearans可被认为是衰变的或者称为返祖突变的菌株，一直存活至今天，将其祖先不惜代价保持的对有气味的硫化合物、氮化合物和碳化合物的净化行为连续遗传下来。不可能预计脆弱的乳酸杆菌Lactobacillus clearans面临的命运，他如今在人类的照顾下处在一种古代和现代乳酸杆菌之间的流动状态下。用于培养此类细菌的培养基以及保存它们的保存剂都要求多方面考虑。事实上，在对这些细菌的测验中，滴度在培养基中传代培养和储存中下降。因此，最重要的方面是何种传代培养的条件能够使得有效滴度不受影响，以及何种保存的条件能够使得有效滴度不受影响。
作为为了解决这些问题所作的广泛研究的结果，本发明人开发了一种能够维持乳酸杆菌Lactobacillus clearans降低硫化钠和氨水的滴度的培养基，及其制备方法。即，本发明是一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，在乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养过程中，其添加了至少一种或多种硫化钠和氨水，因而，在乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养过程中，经24小时培养，乳酸杆菌Lactobacillus clearans降低了至少一种或多种硫化钠和氨水，并且，优选地是一种添加了500ppm浓度的硫化钠的培养基，其中经24小时的乳酸杆菌Lactobacillus clearans培养，硫化钠被降低了10％或更多，并且，优选地是一种添加了500ppm浓度的氨水的培养基，其中经24小时的乳酸杆菌Lactobacillus clearans培养，氨水被降低了10％或更多。该培养基优选地添加了至少一种或多种有气味的硫化合物、有气味的氮化合物、和有气味的碳化合物，其中有气味的硫化合物优选地是一种或多种的硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、及其衍生物，有气味的氮化合物优选地是一种或多种的氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、及其衍生物，有气味的碳化合物优选地是一种或多种的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物。培养基还优选地添加了至少一种或多种的含硫氨基酸，谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸，以作为氨基酸，优选地添加了至少一种或多种的维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、和尼克酰胺，以作为维生素，优选地添加了至少一种或多种的锰、锌、镁、和钼，以作为矿物质，并且优选地添加了至少一种或多种的小球藻CGF、大豆奶和胆汁粉。
本发明的第二点是一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，包括提供了至少一种或多种的含硫氨基酸、卵清蛋白、胆汁粉、海藻糖、棉子糖、死的酵母细胞、小球藻、米糠、糠、大豆奶、和胡萝卜汁，以作为保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans期间乳酸杆菌Lactobacillus clearans周围的保存剂，并且优选地除上述的保存剂中在乳酸杆菌Lactobacillus clearans周围添加了至少一种或多种的谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、锰、锌、镁、钼、硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物，而进一步优选地，包括提供了至少一种或多种的来自动物的脱脂奶粉、卵清蛋白、肝脏抽提粉、和血清，以及至少一种或多种的来自植物的豆浆、海藻糖、棉子糖、淀粉、小球藻、小球藻CGF、米糠、糠、苜蓿汁、三叶草汁、麦精抽提物、大豆奶、番茄汁、胡萝卜汁、葡萄汁、芦荟粉、绿茶粉、和死的酵母细胞，作为保存剂，除了上述的保存剂外，还在乳酸杆菌Lactobacillus clearans周围添加了至少一种或多种的谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、锰、锌、镁、钼、硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物。此外，此种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法还可以包括任何的冻干、超冷保存、或者液态、湿态、半干、或干态方法。
图1是以用于乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基进行培养及其滴度试验的示意图。
本发明所指的乳酸杆菌Lactobacillus clearans是新的乳酸杆菌菌株，其具有下列(1)、(2)、(3)和(4)的生物化学特征。即，它们是乳酸杆菌菌株(1)当在5g肉抽提物，5g蛋白胨，1g葡萄糖，1gCaCO3，和1L水(中性pH)中加入0.5g Na2S·9H2O和/或0.5mLNH4OH时，能够降低Na2S·9H2O和NH4OH；(2)在含有1g酪蛋白氨基酸和维生素(A900U；B11mg；B21mg；B61mg；B125γ；尼克酰胺16mg；泛酸钙8mg；C64mg；D2120IU)的Stephanson-Whetham培养基(简称S-W；1g KH2PO4，0.7g MgSO4·7H2O；1g NaCl；4g(NH4)2HPO4；0.03g FeSO4·H2O；5g葡萄糖)中培养该细菌时，即使在对数生长期，加入0.5g Na2S·9H2O和/或0.5mL NH4OH，也不表现出生长促进作用；(3)天然分离的菌株对Na2S·9H2O表现出比通常所知的乳酸杆菌更强的抗性，而比乳酸杆菌Lactobacillus clearans更弱的抗性；和(4)是格兰氏阳性、杆状、非移动性的、过氧化氢酶阴性、无硝酸盐还原作用、无白明胶分解作用、无吲哚或硫化氢形成、并具有从葡萄糖和乳糖产生乳酸的高能力，以及添加乙酸可加速生长(日本已审查的专利申请(Kokoku)4-632)。
表2、3、4、5和6中所给出的各种培养基，诸如各种分为低营养培养基、中营养培养基和高营养培养基的各种类型，可以用于乳酸杆菌Lactobacillus clearans的传代培养。
表2传代培养培养基成分(1)(1L中的成分)Stephanson-Wetham培养基
表3传代培养培养基成分(2)(1L中的成分)MRS培养基
表4传代培养培养基成分(3)(1L中的成分)低营养培养基
1)1g中包括维生素A900U；维生素B11mg；维生素B21mg；维生素B125μg；尼克酰胺16mg；泛酸钙8mg；维生素C64mg；维生素D2120IU表5传代培养培养基成分(4)(1L中的成分)中营养培养基
1)1g中包括维生素A900U；维生素B11mg；维生素B21mg；维生素B12
5μg；尼克酰胺16mg；泛酸钙8mg；维生素C64mg；维生素D2120IU表6传代培养培养基成分(5)(1L中的成分)高营养培养基
测验乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度的方法如下所述；下面例举了这些细菌所具有的功能(1)能够降低有气味的有害物质诸如有硫化物硫化钠和氮化合物氨水；(2)能够改善肠道菌群，即，能够增加有益细菌诸如双岐杆菌和乳酸杆菌，并显著降低有害细菌诸如Veillonella和梭菌，包括乳酸杆菌Lactobacillus clearans；和(3)能够抑制肠道感染的病原菌的生长和毒性。虽然对这三种能力可以单独试验并进行完全的评估，但广泛的研究结果表明上述的乳酸杆菌Lactobacillus clearans的几种能力是密切相互关联的。同样，滴度的试验局限于(1)降低肠道中有气味的有害物质的能力，这是很易于测验并提供快速结果的。
用以试验降低肠道中有气味的有害物质的能力的滴度试验培养基的组成包括，在含有5g肉抽提物、5g蛋白胨、5g葡萄糖、3g丁酸钠、和3g碳酸钙的培养基中加入0.5g硫化钠或0.5mL氨水。此培养基在37℃温育用于测验的细菌的厌氧培养，测定在一定时间内加入的硫化钠或氨水的降低量。此时可以通过乙酸铅法或者碘滴定法(JISK0102-1985)测量硫化钠，而通过Nestler法或吲哚酚兰吸收法(JISK0102-1985)测量氨水。经试验的乳酸杆菌Lactobacillus clearans是形形色色的；表7给出了测定的硫化钠和氨水的降低百分比，三种典型的菌株，命名为BHPH-L-1(FERM P-17149，FERM BP-6971)，BHPH-L-2(FERM P17148，FERM BP-6972)，和BHPH-L-3(FERM P-17150，FERM BP-6973)，其滴度较高。
表7高滴度乳酸杆菌Lactobacillus clearans对硫化钠和氨水的降低百分比<
>理想的基本培养基可以获得最良好的生长和最低的滴度下降。从大规模培养(放大)的实际出发这对于细菌产量是最重要的，在寻找一种理想的培养基上，我们成功地发现了问题的关键。即，如表8所示，显然，当培养物通过在基本培养基中添加硫化钠或氨水来处理时，基本上两种添加的物质24小时内降低到一定的程度，在培养基中传代培养而没有这种降低则导致其最终失效。就是说，如表8所示，当在1升的培养基中加入0.5g硫化钠和0.5mL氨水的情况下，作为原有的营养成分的有气味的物质，诸如有气味的硫、氮、和碳物质，在过高的营养培养基中不再被用作营养源，而只有那些容易利用的营养源才被利用，导致了大量的细菌逐渐丢失并最终失去了原细菌特征。此处的氨水是指氨水试剂，诸如含有25.0至27.9w/v％氨的水溶液。
表8乳酸杆菌Lactobacillus clearans降低加入到培养基中的硫化钠和氨水的百分比
>按照其对于乳酸杆菌Lactobacillus clearans效用的类型，研究了构成细菌细胞或酶的最重要的氨基酸。结果表明特殊的氨基酸的加入，即，含硫的氨基酸诸如胱氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、和牛磺酸，以及谷氨酸、赖氨酸、和天冬氨酸，当在传代培养时加入具有极强的效果，而脯氨酸、酪氨酸等会导致滴度的快速下降。就是说，它们大致可分为三种类型某些氨基酸可以帮助保持乳酸杆菌Lactobacillus clearans的滴度，另一些只有较低的效果，而其他的则导致滴度显著的降低。这点成功地解决了常规实验中的矛盾，特别是，如果一种营养具有促进细菌的生长的增强效果，那么该营养物对该细菌则是非常好的，但是其降低有害物质的显著特性却丢失了。因此，不需要指出的是，上述的有效氨基酸可与上述的有气味的硫、氮、和碳化合物一起混合，以防止滴度的进一步降低。
我们为寻找这种具有增强和增效作用的物质而进行了广泛的研究。结果，我们发现了维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、尼克酰胺等有效维生素。很显然这些维生素与能降低有气味物质诸如有气味的硫、氮、和碳化合物的酶的产生密切相关。
我们还发现锰、锌、镁、钼等等是有效的矿物质。很显然这些矿物质与能降低有气味物质诸如有气味的硫、氮、和碳化合物的酶的活性密切相关。
这些方面的确认是通过，在含有上述的有效维生素和矿物质的培养基中培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans，随后除去细菌，然后在含有有气味物质诸如有气味的硫、氮、和碳化合物的液体中，单加入一部分的所获得的培养物，结果该有气味的物质降低了。
我们还发现小球藻CGF、大豆奶、胆汁粉等是保持乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度的有效物质。
除了培养成分的研究，优选地对于在后续培养基中传代培养对数生长期的细菌，以有效地防止传代培养中的滴度下降。还优选地在培养基生产和灭菌中防止培养基成分的热变性。
然后我们研究了保存方法，获得的结论是，最重要的一条是首先要生产一种最佳的保存剂。如今通常使用的乳酸杆菌的保存剂，诸如乳糖、各种类型的淀粉、和脱脂奶，(1)易于操作；(2)便宜；(3)可直接对活体给药，且用时不产生不适。出于这些和其他的因素，很趋向于使用它们，主要是对人方便，尽管它们对于乳酸杆菌来讲是不适合的或不是最佳的。如今，它们可以肠道胶囊的形式使用，但我们决定从乳酸杆菌的角度，而非优先从人的角度来考虑情况，把注意力集中于乳酸杆菌上。因此，我们对于各种细菌菌株，包括三种典型的乳酸杆菌Lactobacillus clearans菌株，即，BHPH-L-1(FERM P-17149，FERM BP-6971)，BHPH-L-2(FERM P17148，FERMBP-6972)，和BHPH-L-3(FERM P-17150，FERM BP-6973)，测试了用作保存剂的广泛的各种物质，从细菌培养中通常使用的基于蛋白的物质，到各种动物和植物物质的复合物和糖类。保存剂的加入量，根据不同保存剂类型的适用性变化范围而变化很大，因而不能以一种绝对的标准来确定，但是通常的范围，按照保存剂的重量比率计，为离心下的细菌细胞的1至500倍。
本发明所指的淀粉不限于任何特定的淀粉材料，但其实例包括可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、和甘薯淀粉。
本发明中的死酵母细胞是指非存活状态的酵母。一个实例是Baker酵母，它可以通过100℃热水处理10分钟而杀死，然后干燥。当然，杀死后的Baker酵母可以是干燥的也可以是湿润的状态。酵母抽提粉是指被干燥制成粉末的酵母抽提物。干燥方法没有特别的限定。
实施例将乳酸杆菌Lactobacillus clearans在表2，3，4，5和6中所给出的培养基中传代培养，测验传代培养中各个时期的滴度，滴度的测验从第1代直到第9代。步骤如
图1所示，滴度试验的结果在表9，中给出，表10总结了所有的菌株。用同心圆代表的滴度表示滴度没有下降，用圆圈代表的滴度表示滴度略微下降但足以保持，三角形表示滴度的逐渐下降而不适于实际目的，而×表示滴度极大地丧失。基本上，在所有培养基中都发现滴度下降，按照从低到中到高营养培养基的顺序则加剧。其差异在进一步的传代培养中快速加大。
表9各种培养基中传代培养数与乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度的相互关系<
1)有气味的硫化合物2)有气味的氮化合物表10乳酸杆菌Lactobacillus clearans培养物以及传代培养与滴度的总体关
表11含有F成分的培养基中乳酸杆菌Lactobacillus clearans传代培养数与滴度的相互关系
3)有气味的硫化合物4)有气味的氮化合物表11表明在基本培养基中加入F成分作为传代培养和生长的培养基，对于防止乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度下降是重要的，尤其如此的是当基本培养基是高营养培养基时。很显然的还有，当加入了F成分，传代培养的第3代的滴度下降相对要小。但其后滴度下降很快。
对于保存剂，表12表示出当加入基于蛋白-氨基酸的保存剂时，乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变。表13表示当加入糖类和基于动物的蛋白-维生素-矿物质复合物的保存剂时，乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变。表14表示出当加入基于植物的蛋白-维生素-矿物质复合物的保存剂时，乳酸杆菌Lactobacillusclearans存活率的改变。在此，苜蓿汁和三叶草汁是指，对苜蓿草和三叶草加入10倍的水分别制成苜蓿汁和三叶草汁的液体。保存剂的加入量是以保存剂相对于活细胞重量比表示。例如，数量10表示加入的保存剂是10倍于活细胞的重量。乳酸杆菌Lactobacillus clearans的存活率以百分比表示，100％是指刚刚冻干后的活细胞的数量。冻干中的存活率当大于90％时用两个同心圆表示，当存活率为60-80％时用一个圆圈表示，当存活率为40-60％时用一个方形表示，当存活率为20-40％时用一个三角形表示，存活率小于20％时用×表示。储存中乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度的改变当滴度仍保持在较高水平时用“++”表示，当滴度略微下降时用“+”表示，当滴度明显下降时用“±”表示，当滴度快速下降时用“-”表示。表12使用基于蛋白-氨基酸的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变
以保存剂相对于活细胞重量比表示表13使用糖类和基于动物的蛋白-维生素-矿物质复合物的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变
>*以保存剂相对于活细胞重量比表示表14使用基于植物的蛋白-维生素-矿物质复合物及其它物质时乳酸杆
的保存剂，也可在储存中获得较好的存活率，并同时取得较低的滴度下降量。就是说，只要确定冻干中的存活率，就可以在后续的关于条件的快速研究中取得极大的进展，从保存剂的选择到冷冻冻干的温度、干燥时间等，而无须花费很多的时间。结果，很显然，通常对于常规已知的乳酸杆菌所使用的方法，适合于操作乳酸杆菌Lactobacillus clearans时的条件诸如预冻和冻干温度和干燥时间，但是保存剂的效能是保持其存活率和滴度的最重要的因素。
将单独使用时不具备保存剂效力的保存剂排除，对剩下的保存剂进行各种组合的研究。一些结果在表15，16和17中给出。在此，保存剂的加入量以保存剂相对于活细胞重量比表示。例如，数量10表示加入的保存剂是10倍于活细胞的重量。冻干中乳酸杆菌Lactobacillus clearans的存活率当大于90％时用两个同心圆表示，当存活率为60-80％时用一个圆圈表示，当存活率为40-60％时用一个方形表示，当存活率为20-40％时用一个三角形表示，存活率小于20％时用×表示。对表13和14的比较表明，保存剂当联合使用时比单独使用能够提供更好的存活率。联合使用来自动物的保存剂和来自植物的保存剂，在冻干中可获得更好的存活率，当然，同样在以后的储存中也有更好的效果。结果在表18中给出，其中储存中乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度的改变当滴度仍保持在较高水平时用“++”表示，当滴度略微下降时用“+”表示，当滴度明显下降时用“±”表示，当滴度快速下降时用“-”表示。表15联合使用两种类型的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变
*以保存剂相对于活细胞重量比表示表16联合使用三种类型的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率的改变
*以保存剂相对于活细胞重量比表示表17联合使用四种或五种类型的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillusclearans存活率的改变
*以保存剂相对于活细胞重量比表示表18使用能够在冻干中提供90％以上的存活率的保存剂时乳酸杆菌Lactobacillus clearans存活率和滴度的改变
显然，将表12，13和14中标为一个圆圈或方形的物质诸如大豆奶，联合使用乳酸杆菌在自然界中附着并以共生关系一起生存的物质，能够获得良好的保存剂效果，这些物质包括米糠、糠、酵母、小球藻、草诸如三叶草、和水果诸如葡萄。
另外确定的是，在乳酸杆菌Lactobacillus clearans传代培养中，在高效保存剂中，单独地或者联合地加入有效地保持滴度的物质，诸如有气味的硫、氮、和碳化合物，氨基酸诸如含硫的氨基酸和谷氨酸，维生素诸如维生素C和泛酸钙，矿物质诸如锌和镁，以及胆汁粉，能够进一步增强其保存性能。
除了保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法中的冻干法，还考虑了其他各种保存形式，诸如液体或细胞团的湿润保存、带有约15％湿度的半干燥保存、带有约8％湿度的干燥保存、和-40至-196℃的超冷保存，但当利用上述的在冻干法中所表现出良好效果的保存剂时，基本上能够获得较好的结果。
下面将本发明以实施例为参考详细描述，但本发明的范围不仅仅限于这些实施例。
实施例1在10L培养基中接种乳酸杆菌Lactobacillus clearans(FERMP17150，BP-6973)，每升培养基含有5g肉抽提物(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)，5g蛋白胨(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，3g丁酸钠(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，1mL氨水(Wako PureChemical Industries，LTD.)，10g葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，0.5g胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，和2g酵母抽提物(Nihon Seiyaku)，37℃厌氧培养72小时。将培养物离心，得到10g细胞沉淀。用500mL生理盐水(用Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.的氯化钠制备)洗涤并离心两次。将得到的纯化的细胞沉淀加到含有500mL大豆奶(Tsujimoto Shokuhin Kogyo)，50g脱脂奶粉(Snow Brand Milk Prodcts，Co.)，30g海藻糖(HayashibaraKK)，和0.5g胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)的溶液中，并彻底搅拌。以通常的方法将混合物在真空中冻干，得到133g细菌细胞制品。细胞数为3.0×109细胞/g。将该细胞制品与硅胶干燥剂(Manabe Kaseihin)和氧气吸收剂(Mitsubishi Gas Chemical Co.)一起储存在室温下，在18个月内检测其活细胞数以计算存活率，并试验其滴度，所得结果在表19中给出。表19显示保持了高乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度，而存活率没有下降。
表19乳酸杆菌Lactobacillus clearans活细胞数、存活率和滴度的改变的实例<
>实施例2在10L培养基(pH7.0)中接种乳酸杆菌Lactobacillus clearans(FERM P17149，BP-6971)，每升培养基含有30g大豆乳清(FujiOil.)，1g蛋白胨(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，1g胱氨酸(WakoPure Chemical Industries，LTD.)，3g乙酸钠(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)，0.2g硫化钠(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，0.01g泛酸钙(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，和2g Baker酵母(东方酵母)，37℃厌氧培养72小时。将培养物离心，得到28g细胞沉淀。用500mL生理盐水(用Wako Pure Chemical Industries，LTD.的氯化钠制备)洗涤并离心两次。将得到的纯化的细胞沉淀加到含有10g干的小球藻(Yamaki)，25g海藻糖(Hayashibara KK)，和5g可溶性淀粉(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)的500mL水中，并彻底搅拌。以通常的方法将混合物在真空中冻干，得到43g细菌细胞制品。细胞数为10.0×109细胞/g。将该细胞制品与硅胶干燥剂(Manabe Kaseihin)和氧气吸收剂(Mitsubishi Gas Chemical Co.)一起于玻璃瓶中避光储存在室温下，在18个月内检测其活细胞数以计算存活率，并试验其滴度，所得结果在表20中给出。表20表明保持了高乳酸杆菌Lactobacillus clearans滴度，而存活率没有下降。
表20乳酸杆菌Lactobacillus clearans活细胞数、存活率和滴度的改变的实例
比较实施例1在10L培养基(pH7.0)中接种乳酸杆菌Lactobacillus clearans(FERM P17150，BP-6973)，每升培养基含有10g肉抽提物(Wako PureChemical Industries，LTD.)，10g蛋白胨(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，3g酵母抽提物(Niho Seiyaku)，10g葡萄糖(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)，2g K2HPO4，1g MgSO4·7H2O，1g NaCl，和1gCaCl2·2H2O，37℃厌氧培养72小时。将培养物离心，得到18g细胞沉淀。用500mL生理盐水(用Wako Pure Chemical Industries，LTD.的氯化钠制备)洗涤并离心两次。将得到的纯化的细胞沉淀加到1000mL 20％的可溶性淀粉(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)的溶液中，并彻底搅拌。以通常的方法将混合物在真空中冻干，得到204g细菌细胞制品。细胞数为4.5×109细胞/g。将该细胞制品与硅胶干燥剂(Manabe Kaseihin)和氧气吸收剂(Mitsubishi Gas Chemical Co.)一起储存在室温下，在18个月内检测其活细胞数以计算存活率，并试验其滴度，所得结果在表21中给出。表21显示，当乳酸杆菌Lactobacillus clearans在通常的培养基中培养以及用通常的方法保存时，不仅存活率快速下降而且滴度也显著降低了。
表21在通常的培养基和保存中，乳酸杆菌Lactobacillus clearans活细胞数、存活率和滴度的改变的实例
>比较实施例2在10L培养基(pH7.0)中接种乳酸杆菌Lactobacillus clearans(FERM P17150，BP-6973)，每升培养基含有10g肉抽提物(Wako PureChemical Industries，LTD.)，10g蛋白胨(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，3g酵母抽提物(Niho Seiyaku)，10g葡萄糖(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)，2g K2HPO4，1g MgSO4·7H2O，1g NaCl，和1gCaCl2·2H2O，37℃厌氧培养72小时。将培养物离心，得到18g细胞沉淀。用500mL生理盐水(用Wako Pure Chemical Industries，LTD.的氯化钠制备)洗涤并离心两次。将得到的纯化的细胞沉淀加到含有900mL大豆奶(Tsujimoto Shokuhin Kogyo)，90g脱脂奶粉(SnowBrand Milk Products，Co.)，54g海藻糖(Hayashibara KK)，和0.9g胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)的溶液中，并彻底搅拌。以通常的方法将混合物在真空中冻干，得到239g细菌细胞制品。细胞数为5.0×109细胞/g。将该细胞制品与硅胶干燥剂(ManabeKaseihin)和氧气吸收剂(Mitsubishi Gas Chemical Co.)一起储存在室温下，在18个月内检测其活细胞数以计算存活率，并试验其滴度，所得结果在表22中给出。表22显示，当乳酸杆菌Lactobacillus clearans以通常的方法培养和用本发明的方法保存时，获得了很好的存活率，虽然不像实施例1中的那么好。但滴度在培养中有所下降，尽管是逐渐地。
表22在通常的培养基而用本发明的保存方法时，乳酸杆菌Lactobacillus clearans活细胞数、存活率和滴度的改变的实例<
比较实施例3在10L培养基(pH7.0)中接种乳酸杆菌Lactobacillus clearans(FERM P17150，BP-6973)，每升培养基含有5g肉抽提物(Wako PureChemical Industries，LTD.)，5g蛋白胨(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，3g丁酸钠(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，1g氨水(WakoPure Chemical Industries，LTD.)，10g葡萄糖(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)，0.5g胱氨酸(Wako Pure Chemical Industries，LTD.)，和2g酵母抽提物(Nihon Seiyaku)，37℃厌氧培养72小时。将培养物离心，得到10g细胞沉淀。用500mL生理盐水(用Wako PureChemical Industries，LTD.的氯化钠制备)洗涤并离心两次。将得到的纯化的细胞沉淀加到550mL 20％的可溶性淀粉(Wako Pure ChemicalIndustries，LTD.)的溶液中，并彻底搅拌。以通常的方法将混合物在真空中冻干，得到112g细菌细胞制品。细胞数为2.5×109细胞/g。将该细胞制品与硅胶干燥剂(Manabe Kaseihin)和氧气吸收剂(Mitsubishi Gas Chemical Co.)一起储存在室温下，在18个月内检测其活细胞数以计算存活率，并试验其滴度，所得结果在表23中给出。表23显示，存活率趋势与比较实施例1中当乳酸杆菌Lactobacillusclearans在本发明的培养基中培养并用通常的方法保存时的一样。滴度不像比较实施例1中下降的那么快，但趋于逐渐降低。
表23在用本发明的培养基而用通常的保存方法时，乳酸杆菌Lactobacillus clearans活细胞数、存活率和滴度的改变的实例
乳酸杆菌Lactobacillus clearans是新的乳酸杆菌菌株，它能够利用并降解有气味的硫、氮、和碳化合物，由于上述的这些功能，它被视为具有有效的净化能力的高效菌株。但是，还没有如此的已知方法可以获得具有显示其这些功能的高滴度乳酸杆菌，或者长时间之内保持以获得的高滴度的方法。
本发明的培养基的应用，可使得具有高滴度的乳酸杆菌Lactobacillus clearans在一个稳定的状态下培养，从而方便地将有气味的硫、氮、和碳化合物降解消除。因此，不仅肠道中有气味的硫、氮、和碳化合物能够被降解，而且肠道内被认为是有益的细菌也可以被显著增加，而有害细菌的生长也可以受到强烈的抑制。
本发明的保存方法的应用，可使得具有高滴度的乳酸杆菌Lactobacillus clearans在长时间之内保存，从而在一旦需要时将有气味的硫、氮、和碳化合物降解消除。
权利要求
1.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括添加硫化钠和氨水中至少一种或两者均添加，从而在乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养过程中，经24小时培养，硫化钠和氨水中的至少一种或两者都被乳酸杆菌Lactobacillus clearans降低。
2.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1中所述的培养基中添加了至少一种或多种有气味的硫化合物、有气味的氮化合物、和有气味的碳化合物。
3.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其中权利要求2中所述的有气味的硫化合物为硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、及其衍生物中的至少一种或多种。
4.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其中权利要求2中所述的有气味的氮化合物为氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、及其衍生物中的至少一种或多种。
5.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其中权利要求2中所述的有气味的碳化合物为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物中的至少一种或多种。
6.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至5任何一项所述的培养基中作为氨基酸添加了含硫的氨基酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸中的至少一种或多种。
7.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至6任何一项所述的培养基中作为维生素添加了维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、和尼克酰胺中的至少一种或多种。
8.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至7任何一项所述的培养基中作为矿物质添加了锰、锌、镁、和钼中的至少一种或多种。
9.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至8任何一项所述的培养基中添加了小球藻CGF、大豆奶和胆汁粉中的至少一种或多种。
10.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至9任何一项所述的培养基中添加了浓度为500ppm的硫化钠，其中在乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养中经过24小时培养，硫化钠被降低了10％或更多。
11.一种用于培养乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养基，其包括在权利要求1至9任何一项所述的培养基中添加了浓度为500ppm的氨水，其中在乳酸杆菌Lactobacillus clearans的培养中经过24小时培养，氨水被降低了10％或更多。
12.一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，包括提供了含硫氨基酸、卵清蛋白、胆汁粉、海藻糖、棉子糖、死的酵母细胞、小球藻、米糠、糠、大豆奶、和胡萝卜汁中的至少一种或多种，以作为保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans期间在乳酸杆菌Lactobacillus clearans周围的保存剂。
13.一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，其中包括除了权利要求12中所述的保存剂之外，在乳酸杆菌Lactobacillusclearans周围还添加了谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、锰、锌、镁、钼、硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物中的至少一种或多种。
14.一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，其中包括提供了至少一种或多种的来自动物的脱脂奶粉、卵清蛋白、乳糖、肝脏抽提粉、和血清，以及至少一种或多种的来自植物的豆浆、海藻糖、棉子糖、淀粉、小球藻、小球藻CGF、米糠、糠、苜蓿汁、三叶草汁、麦精抽提物、大豆奶、番茄汁、胡萝卜汁、葡萄汁、芦荟粉、绿茶粉、和死的酵母细胞，以作为在乳酸杆菌Lactobacillusclearans周围的保存剂。
15.一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，其中包括除了权利要求14中所述的保存剂之外，在乳酸杆菌Lactobacillusclearans周围还添加了谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素E、维生素B12、泛酸钙、叶酸、尼克酰胺、锰、锌、镁、钼、硫化钠、硫化氢、硫化铵、甲硫醇、乙硫醇、二甲基硫醇、二甲基硫化物、二甲基二硫化物、二乙基硫化物、二丁基硫化物、氨水、甲基吲哚、吲哚、乙酰苯胺、甲胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、酚、丁醇、戊醇、及其衍生物中的至少一种或多种。
16.一种如权利要求12至15任一项所述的保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法，其中的保存方法包括任何的冻干、超冷保存、或者液态、湿态、半干、和干态方法。
全文摘要
培养和保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans需要有特别的考虑,因为其滴度极易下降。因此急切需要在传代培养和保存中能够防止滴度下降的培养基和保存剂。本发明涉及一种培养基,其中通过添加至少一种或多种硫化钠和氨水从而该至少一种或多种硫化钠和氨水在培养过程中被乳酸杆菌Lactobacillus clearans降低,本发明还涉及一种保存乳酸杆菌Lactobacillus clearans的方法,其中作为保存剂在细菌周围提供了含硫氨基酸、卵清蛋白、胆汁粉、海藻糖、棉子糖、死的酵母细胞、小球藻、米糖、糠、大豆奶、和胡萝卜汁中的至少一种或多种。
文档编号C12R1/225GK1265423SQ0010032
公开日2000年9月6日 申请日期2000年1月25日 优先权日1999年1月25日
发明者秦忠世, 丸冈俊之 申请人:Bhph有限公司