专利名称：一种用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用稀土元素促进高产紫草素及其衍生物的新疆紫草细胞生长的方法。
背景技术：
紫草是传统中药材，其根药用，含多种萘醌类化合物——紫草素及其衍生物，具有显著的抗生育、抗炎、抗肿瘤、杀菌抗病毒、保肝和免疫调节等作用。其色素也是名贵的染料，可添加到化妆品中使用。
1985年的《中华人民共和国药典》中收录了新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)和硬紫草两种植物作为中药紫草，而在1990年以后的药典中收录了三种紫草科(Boraginaceae)植物，即软紫草属(Arnebia Forsk.)的新疆紫草(软紫草)、蒙紫草(黄花软紫草)(A.guttata Bunge)、紫草属(Lithospermum Gromwell)的硬紫草(紫草、辽宁紫草)。除了这三种植物，滇紫草(Onosma paniculatum Bur.etFranch)在云南也常做紫草入药。这几种紫草的品质非常不同，它们所含紫草素及其衍生物的总量分别为新疆紫草2.019％，硬紫草0.384％，滇紫草0.105％与蒙紫草0.215％(罗淑荣，李彤。紫草中萘醌的测定[J]。中国中药杂志，1992，17(9)552-554.)。显然以新疆紫草的品质最佳，所以目前新疆紫草已经成为主要的商品紫草。新疆紫草野生资源破坏严重，人工种植尚未成功。
新疆紫草为多年生植物，主要产于新疆天山，海拔2100-3300米的山地向阳坡，生长区域年降水量120-200mm之间，冬季有积雪，寒冷而干燥，多为砾石类残积物上的荒漠土壤和高山草原，紫草覆盖度仅1％-3％。上个世纪50年代初发现新疆紫草药效好，资源丰富，很快在全国紫草生产中占据统治地位，行销全国，并部分出口。但大量的无序采挖，只挖不种，不注意资源的保护，无法持续发展。采挖多为农牧民个人行为，经常连幼苗都挖去，不留种，挖后不填土，使紫草很难自然再生，使产地的土壤和植被遭到严重破坏。因为人工种植尚未成功，目前野生的新疆紫草资源已远不能满足市场的需要，为了缓解市场的供需矛盾，我们拟通过植物细胞工程的手段，从愈伤组织出发，直接生产有效次生代谢物，这种方法是中药现代化发展的重要方向，具有很高的理论研究和应用价值。
要从细胞水平上获得有效次生代谢物，必须具有能够快速增殖的产紫草素的紫草愈伤组织。真菌诱导子对新疆紫草愈伤组织的生长有一定的促进作用(刘长军，侯嵩生.真菌诱导子对新疆紫草悬浮培养细胞的生长和紫草素合成的影响.植物生理学报.1998，24(1)6-10)，愈伤组织干重达到15.1g/L，我们使用稀土元素影响细胞生长，培养一个周期，愈伤组织干重可达24.77g/L。稀土元素在植物生长中的生理作用已逐渐引起了植物细胞工程研究人员的重视。例如，在长春花细胞悬浮培养的指数期前期加入硝酸镧，对细胞的生长和次生代谢物的积累均有促进作用(元英进，胡宗定.稀土元素对长春花植物细胞培养的影响.稀土.1993，14(3)38-40)。在发菜细胞培养中加入镧不但能促进其生长，而且还能改变氨基酸含量(刘世名，梁世中.镧对发菜细胞培养及氨基酸成分的影响.中国稀土学报.1999，17(1)60-64)。在东北红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的研究中，镧、铈的加入均能明显改变细胞生长模式，使细胞生长的延迟期和对数期缩短、稳定期消失，并有利于紫杉醇的合成和释放(元英进，胡国武，王传贵等.镧、铈对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成与释放的影响.中国稀土学报.1998，16(1)56-60)。稀土元素对细胞生长的促进作用，可能是因为它们与细胞中的金属离子发生作用，从而影响特定酶的活性，以及细胞膜的功能(郭伯生.稀土在生物领域中应用研究进展.稀土.1999，20(1)64-68)。
发明内容
本发明的目的是提供一种用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，通过将新疆紫草愈伤组织转接到含不同种类和不同浓度稀土的固体培养基上，获得能够快速增殖且高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织，为实现通过新疆紫草细胞大规模培养获得有效次生代谢物的工业化生产打下基础；解决了天然紫草资源匮乏的难题。
本发明的技术方案如下本发明提供的使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，其特征在于，步骤如下1)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，10-30天后长出新疆紫草愈伤组织；所述的新疆紫草的外植体包括新疆紫草的茎、叶、根或种子；所述的改良N6固体培养基I的组分和含量为每升N6固体培养基中含有0.1-0.7mg的萘乙酸(NAA)、0.1-0.7mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5-4.0mg的激动素(KT)；其pH值为5.7-5.8，并且在120-122℃，一般为灭菌15分钟；所述的N6固体培养基的组分及含量为KNO3(2830mg/L)；(NH4)SO4(463mg/L)；KH2PO4(400mg/L)；MgSO4·7H2O(185mg/L)；CaCl2·2H2O(166mg/L)；H3BO3(6.2mg/L)；MnSO4·4H2O(22.3mg/L)；CoCl2·6H2O(0.025mg/L)；CuSO4·5H2O(0.025mg/L)；ZnSO4·7H2O(8.6mg/L)；NaMoO4·2H2O(0.25mg/L)；KI(0.83mg/L)；FeSO4·7H2O(27.8mg/L)；NaEDTA·2H2O(37.3mg/L)；维生素B1(0.4mg/L)；肌醇(100mg/L)；蔗糖(30g/L)；琼脂(6g/L)；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行2-3个周期的继代生长，每个周期的培养时间为10-30天；所述的改良N6固体培养基II的组分和含量为每1升的N6固体培养基中含有0.5-5mg/L激动素(KT)；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中经2-3个周期继代生长的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在24-26℃温度和无光条件下培养16-25天后，测定并选出其紫草素及其衍生物产量比天然新疆紫草药材含量高出0.5倍的新疆紫草愈伤组织细胞系；所述的合成培养基III的配方为KNO3(680mg/L)；NaH2PO4·2H2O(19mg/L)；NaSO4(1917mg/L)；CuCl2·2H2O(0.1364mg/L)；H3BO3(1.6mg/I)；FeSO4·7H2O(1.1mg/L)；NaEDTA·2H2O(1.5mg/L)；激动素(0.5mg/L)；肌醇(100mg/L)；蔗糖(50g/L)；琼脂(6g/L)；所述的合成培养基III的pH值为5.7-5.8，并且在120-122℃灭菌，一般为灭菌15分钟；紫草素及其衍生物含量的测定方法将天然新疆紫草根在60℃下干燥24小时，准确称取3克，碾碎到60目大小，用石油醚经索式提取法反复提取至无色，提取液蒸干，得到色素结晶0.081克，准确称取30毫克，溶于石油醚，并且稀释成不同的浓度，在752型分光光度计上，波长520纳米条件下测定各浓度石油醚溶液的吸光度值，绘制出回归方程Y[紫草素及其衍生物的含量(毫克/升)]＝192.95X-4.459X——石油醚溶液的吸光度；4)将步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行10-25天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系转入含有稀土元素La、Nd、Ce、和/或混合稀土的改良N6固体培养基IV中，培养10-30天；所述改良N6固体培养基IV中La、Nd、Ce、和/或混合稀土含量为每1升N6固体培养基中La、Nd、Ce、和/或混合稀土含量为0.01-0.5mmol；所述的混合稀土的成分及含量为71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.4％Pr6O11+0.2％Sm2O3，w/w。
本发明提供的用稀土元素促进高产紫草素及其衍生物的新疆紫草细胞生长的方法，使用三种稀土元素或/和一种混合稀土，均能不同程度地促进新疆紫草愈伤组织的生长，而且培养周期比普通的继代时间有所缩短，获得能够快速增殖且高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织，为实现通过新疆紫草细胞大规模培养获得有效次生代谢物的工业化生产打下基础；解决了天然紫草资源匮乏的难题。
具体实施例方式
实施例1用本发明的方法培育新疆紫草愈伤组织1)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体(根)接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，25天后长出新疆紫草愈伤组织；所述的改良N6固体培养基I的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.1mg的萘乙酸(NAA)、0.7mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和4.0mg的激动素(KT)；其pH值为5.8，并且在121℃灭菌15分钟；所述的N6固体培养基的组分及含量为KNO3(2830mg/L)；(NH4)SO4(463mg/L)；KH2PO4(400mg/L)；MgSO4·7H2O(185mg/L)；CaCl2·2H2O(166mg/L)；H3BO3(6.2mg/L)；MnSO4·4H2O(22.3mg/L)；CoCl2·6H2O(0.025mg/L)；CuSO4·5H2O(0.025mg/L)；ZnSO4·7H2O(8.6mg/L)；NaMoO4·2H2O(0.25mg/L)；KI(0.83mg/L)；FeSO4·7H2O(27.8mg/L)；NaEDTA·2H2O(37.3mg/L)；维生素B1(0.4mg/L)；肌醇(100mg/L)；蔗糖(30g/L)；琼脂(6g/L)；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行2个周期的继代生长，每个周期的培养时间为10天；所述的改良N6固体培养基II的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有5mg/L激动素(KT)；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中经2个周期继代生长的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在25℃温度和无光条件下培养20天后，测定并选出其紫草素及其衍生物产量比天然新疆紫草药材含量高出1倍的新疆紫草愈伤组织细胞系；所述的合成培养基III的配方为KNO3(680mg/L)；NaH2PO4·2H2O(19mg/L)；NaSO4(1917mg/L)；CuCl2·2H2O(0.1364mg/L)；H3BO3(1.6mg/L)；FeSO4·7H2O(1.1mg/L)；NaEDTA·2H2O(1.5mg/L)；激动素(0.5mg/L)；肌醇(100mg/L)；蔗糖(50g/L)；琼脂(6g/L)；所述的合成培养基III的pH值为5.8，并且在121℃灭菌15分钟；紫草素及其衍生物含量的测定方法将天然新疆紫草根在60℃下干燥24小时，准确称取3克，碾碎到60目大小，用石油醚经索式提取法反复提取至无色，提取液蒸干，得到色素结晶0.081克，准确称取30毫克，溶于石油醚，并且稀释成不同的浓度，在752型分光光度计上，波长520纳米条件下测定各浓度石油醚溶液的吸光度值，绘制出回归方程Y[紫草素及其衍生物的含量(毫克/升)]＝192.95X-4.459X——石油醚溶液的吸光度；4)将步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行10天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系接种到添加了不同浓度Nd3+元素的改良N6培养基IV中(每1L的N6固体培养基中La3+含量分别为0.02mmol、0.1mmol、0.5mmol)，培养21天后，实验表明Nd3+元素浓度较低时，对愈伤组织的生长有促进作用，最适浓度为0.1mmol/L，此时新疆紫草愈伤组织的鲜重为192.42g/L，干重为14.70g/L，分别是对照组不添加稀土元素的115.3％和117.5％。
实施例2用本发明提供的方法培育新疆紫草愈伤组织1)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体(种子)接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，30天后长出新疆紫草愈伤组织；所述的改良N6固体培养基I的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.7mg的萘乙酸(NAA)、0.1mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5mg的激动素(KT)；其pH值为5.7，并且在120℃灭菌15分钟；所述的N6固体培养基的组分及含量同实施例1；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行3个周期的继代生长，每个周期的培养时间为20天；所述的改良N6固体培养基II的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有3.0mg/L激动素(KT)；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中经3个周期继代生长的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在24℃温度和无光条件下培养18天后，测定并选出其紫草素及其衍生物产量比天然新疆紫草药材含量高出1倍的新疆紫草愈伤组织细胞系；所述的合成培养基III的配方同实施例1所述的合成培养基III的pH值为5.7，并且在120℃灭菌15分钟；4)步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行25天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系接种到添加了不同浓度Nd元素的改良N6培养基IV中(每1L的N6固体培养基中Nd含量分别为0.02mmol、0.3mmol、0.4mmol)，培养30天后，实验表明Nd元素浓度较低时，对愈伤组织的生长有促进作用，最适浓度为0.1mmol/L，此时新疆紫草愈伤组织的鲜重为295.34g/L，干重为22.15g/L，分别是对照组不添加稀土元素的177.0％和177.0％。Ce3+元素浓度大于0.1mmol/L，则表现出对生长的抑制作用。
实施例31)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体(茎)接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，10天后长出新疆紫草愈伤组织；所述改良N6固体培养基I的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.4mg的萘乙酸(NAA)、0.1mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和3.0mg的激动素(KT)；所述N6固体培养基的组分及含量同实施例1；其pH值为5.75，并且在122℃灭菌15分钟；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行2个周期的继代生长，每个周期的培养时间为30天；所述改良N6固体培养基II的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.5mg/L激动素(KT)；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中经2个周期继代生长的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在25℃温度和无光条件下培养16天后，测定并选出其紫草素及其衍生物产量比天然新疆紫草药材含量高出1倍的新疆紫草愈伤组织细胞系；所述合成培养基III的配方同实施例1所述合成培养基III的pH值调为5.75，并且在122℃灭菌15分钟；4)步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行20天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系接种到添加了不同浓度的混合稀土的固体继代培养基中，培养10天后，实验表明混合稀土浓度较低时，对愈伤组织的生长有促进作用，最适浓度为0.05mmol/L，此时新疆紫草愈伤组织的鲜重达到313.86g/L，干重达24.77g/L，分别是对照组不添加稀土元素的188.1％和198.0％。当MRE在培养基中的初始浓度超过0.05mmol/L后，新疆紫草愈伤组织的生物量出现下降趋势，但仍高于对照组。
实施例41)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体(叶)接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，25天后长出新疆紫草愈伤组织；所述改良N6固体培养基I的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.1mg的萘乙酸(NAA)、0.7mg的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和4.0mg的激动素(KT)；其pH值为5.8，并且在121℃灭菌15分钟；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行2个周期的继代生长，每个周期的培养时间为20天；所述改良N6固体培养基II的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有5mg/L激动素(KT)；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中经2个周期继代生长的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在25℃温度和无光条件下培养20天后，测定并选出其紫草素及其衍生物产量比天然新疆紫草药材含量高出1倍的新疆紫草愈伤组织细胞系，该新疆紫草愈伤组织细胞系中的紫草素及其衍生物含量超过细胞干重的5.8％；所述合成培养基III的配方同实施例1所述合成培养基III的pH值调为5.8，并且在121℃下灭菌15分钟；4)步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行10天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系接种到添加了不同浓度的混合稀土的固体继代培养基IV中(每1L的N6固体培养基中混合稀土的含量分别为0.02mmol、0.02mmol、0.02mmol)，培养30天后，所述混合稀土的成分和含量为71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.4％Pr6O11+0.2％Sm2O3，w/w；实验表明Ce元素浓度较低时，对愈伤组织的生长有促进作用，最适浓度为0.1mmol/L，此时新疆紫草愈伤组织的鲜重为192.42g/L，干重为14.70g/L，分别是对照组不添加稀土元素的115.3％和117.5％。
权利要求
1.一种使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，其特征在于，步骤如下1)诱导新疆紫草愈伤组织将新疆紫草的外植体接种于含有植物激素的改良N6固体培养基I中进行诱导培育，10-30天后长出新疆紫草愈伤组织；所述的改良N6固体培养基I的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有0.1-0.7mg的萘乙酸、0.1-0.7mg的2，4-二氯苯氧乙酸和0.5-4.0mg的激动素；2)将步骤1)诱导培育获得的新疆紫草愈伤组织置于改良N6固体培养基II中进行继代生长2-3个周期，每个周期的培养时间为10-30天；所述的改良N6固体培养基II的组分和含量为每1L的N6固体培养基中含有含有0.5-5mg/L激动素；3)筛选高产紫草素及其衍生物的新疆紫草愈伤组织将步骤2)中继代生长2-3个周期的新疆紫草愈伤组织转接到合成培养基III上，在24-26℃温度和无光条件下培养16-25天后，测定并选出其紫草素及其衍生物含量比天然新疆紫草药材含量高出0.5倍的新疆紫草愈伤组织细胞系；所述的合成培养基III的配方为KNO3(680mg/L)；NaH2PO4·2H2O(19mg/L)；NaSO4(1917mg/L)；CuCl2·2H2O(0.1364mg/L)；H3BO3(1.6mg/L)；FeSO4·7H2O(1.1mg/L)；NaEDTA·2H2O(1.5mg/L)；激动素(0.5mg/L)；肌醇(100mg/L)；蔗糖(50g/L)；琼脂(6g/L)；4)将步骤3)得到的新疆紫草愈伤组织细胞系置于步骤2)中所述的改良N6固体培养基II中进行10-25天的预培养；5)将步骤4)中经预培养的新疆紫草愈伤组织细胞系转入含有稀土元素La、Nd、Ce、和/或混合稀土的改良N6固体培养基IV中，培养10-30天；所述的改良N6固体培养基IV中La、Nd、Ce、和/或混合稀土含量为每1L的N6固体培养基中La、Nd、Ce、和/或混合稀土含量为0.01-0.5mmol；所述混合稀土的成分和含量为71.5％La2O3+25.9％CeO2+2.4％Pr6O11+0.2％Sm2O3，w/w。
2.按权利要求1所述的使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，其特征在于，所述的新疆紫草的外植体为新疆紫草的茎、叶、根或种子。
3.按权利要求1所述的使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，其特征在于，所述步骤1)中的改良N6固体培养基I的pH值为5.7-5.8，并且在120-122℃下灭菌。
4.按权利要求1所述的使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法，其特征在于，所述步骤3)的改良N6固体培养基III的pH值为5.7-5.8，并且在120-122℃下灭菌。
全文摘要
本发明涉及使用稀土元素促进新疆紫草愈伤组织生长的方法首先从新疆紫草外植体诱导出愈伤组织，愈伤组织继代若干次后，选出紫草素及其衍生物高产细胞系，通过将不同种类和不同浓度的稀土元素添加到固体培养基上，使新疆紫草的愈伤组织快速增殖，从而建立了从外植体出发，快速获得大量优质新疆紫草愈伤组织的培养体系，为实现工业规模生产紫草素及其衍生物奠定了基础。
文档编号A01H4/00GK1633841SQ200310113089
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月26日 优先权日2003年12月26日
发明者王玉春, 葛锋, 王晓东 申请人:中国科学院过程工程研究所