脂类的产生和胞外分泌方法
【技术领域】
[0001] 本公开内容设及由微生物产生和胞外分泌脂类的方法。
【背景技术】
[0002] 从替代可再生资源获得的生物柴油化iodiesel)由于应对世界能源供应恶化状 况而受到相当大的关注。已很好的建立了通过例如细菌、酵母和藻类等微生物的脂类的生 物合成。在食品工业、药物和化妆品领域中脂类有众多商业应用。脂类例如甘油=醋用作生 物柴油的前体。一旦提取，甘油=醋可通过醋交换反应转化为生物柴油。已报道含油微生 物（oleaginous microorganism)的很多物种积累相当大量的脂类（Meng等人，Renew油le Elnergy, 2009,；34, 1 - f5)。
[0003] 微藻（microalgae)是一组高度特化的适应各种生态生境的含油微生物。在应激 (stress)和不利的环境条件下，微藻的许多物种改变其脂类生物合成通路，从而利于甘油 =醋的形成和积累（干细胞重的20 - 50%)。合成之后，甘油=醋沉积至致密堆积的胞质 脂质体中化U等人，ThePlantJournal，2008,54,621 - 639)。甘油S醋通常充当微藻中的 能量储存分子。
[0004] 已进行了大量研究，从而通过调节例如营养可获得性、渗透压、福射暴露、抑、 溫度、暴露于重金属和其它化学物质等各种环境因素来鉴别和开发有效的脂类诱导技术 (化arma等人，Energies, 2012, 5, 1532-1553)。 阳0化]W01989000606描述了限定培养基中氮和憐的量在微藻细胞中产生《-3(n-3)脂 类。
[0006] W02001054510描述了在非醇碳源和有限营养源中生长的真核微生物中增强微生 物脂类的产生。
[0007] US8475543描述了从藻类生产生物燃料的方法，包括通过促进连续的光能自养和 异养生长来培养产油藻类。异养生长阶段是用应激诱导机制来起始的，该机制包括光剥夺、 营养剥夺、活性氧源的注入、脂类引发和化学添加剂的至少一种。此外，该方法描述了通过 裂解细胞来从产油藻类中提取油。
[0008] 从微藻生产生物柴油是新兴的领域，且看来是潜在的替代生物资源。然而，现有技 术设及微藻中甘油=醋或脂类的胞内产生，由此产生下游处理的障碍，即，为了提取脂类， 不得不收集、干燥并通过机械或生物化学方法破裂微藻细胞，因而增加时间和成本因素。
[0009] 鉴于现有技术和科学进展，存在对于开发无需为了提取胞内的脂类而收集和破裂 微生物细胞的成本有效且高效的方法的需求。
【发明内容】
W10]发巧要解决的间颗
[0011] 本公开的一方面设及脂类的产生和胞外分泌方法。
[0012] 本公开的一方面设及增强脂类产生和胞外分泌的方法，其包括：(a)获得含油微 生物的生物质化iomass);和（b)在缺乏氮和铁的改良生长培养基中培养含油微生物的生 物质，导致脂类产生和胞外分泌的增强。
[0013] 本概述用来介绍与通过使用缺乏氮和铁的改良生长培养基的脂类合成和胞外分 泌方法相关的概念。本概述既不意图等同请求保护的主题的必要技术特征，也不意图用于 确定或限制请求保护的主题的范围。
【附图说明】
[0014] 下列附图构成本说明书的一部分，将其包括进来从而进一步说明本公开的各方 面。可通过参照附图并与本文提供的【具体实施方式】的详细描述相结合而更好地了解公开内 容。
[0015] 图1示出根据本公开的实施方案，在不同培养基中按克/升（g/L)测定的生物质 生长的图示。
[0016] 图2示出根据本公开的实施方案，在不同的生长培养基中培养的微生物质的图 /J、- 〇
[0017] 图3示出根据本公开的实施方案，在不同的营养条件中生长的微生物培养物中胞 内和胞外TAGS浓度和总量的定量图示。
【具体实施方式】
[0018] 本领域技术人员将意识到，本文描述的公开内容除了具体描述的内容，还可进行 变形和改进。应理解，本文描述的公开内容包括所有此类变形和改进。本公开也包括本说 明书单独或概括地述及或指出的所有此类步骤、特征、组成和复合，W及所述步骤或特征的 任意或多种的全部组合。
[0019] 定女
[0020] 为了方便，在进一步描述本公开之前，此处汇集了说明书和实施例中使用的某些 术语。运些定义应根据本公开的提示和本领域技术人员的理解来解读。除非另有定义，否 则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员通常的理解相同。
[0021] 冠词"一个（a)"、"一种（an)"和"所述（the)"用来指代本文的一个或多个（即至 少一个）语法对象。
[0022] 术语"多个"意指多于一个。
[0023] 术语"至少两个"、"多于一个"和"多个"可互换使用。
[0024] 在整个说明书中，除非上下文有要求，否则词语"包括（comprise)"及变体"包括 (comprises)"和"包括（comprising)"将理解为意味着包含所述元素或步骤、或者元素或 步骤的组，但也不排除任何其它元素或步骤、或者元素或步骤的组。
[0025] 术语"包含（including)"用来表示"包含但不限于"。"包含"和"包含但不限于" 可互换使用。
[0026] 术语"微生物（microorganism)"和"微小生物（microbe)"可互换用于表示微观 单细胞生物。
[0027] 术语"微生物质（microbialbiomass)"意指由微生物细胞的生长和繁殖产生的材 料。微生物质可含有细胞和/或胞内内容物和由细胞分泌的胞外化合物。
[0028] 术语"微生物培养物"或"培养物"意指在受控的实验室条件下于预定的生长培养 基中增殖和生殖的微生物。
[0029] 术语"生长培养基"或"培养基"意指含有特定微生物生长所需的所有营养物质的 固体或液体制备物。
[0030] 术语"传代培养"意指将微生物细胞从原微生物培养物转移至新鲜的生长培养基 来获得传代培养物。其延长培养物中微生物细胞的生命并增加微生物细胞的数量。
[0031] 术语"传代培养物"意指通过将微生物细胞从原培养物转移至新鲜的生长培养基 而获得的新的微生物培养物。
[0032] 术语"含油微生物"意指脂类含量至少为20-25 %的微小生物。
[0033] 术语"藻类"意指具有叶绿素且光能自养的真核微生物。
[0034] 术语"微藻"意指产生大分子例如脂类的真核光能自养微生物。
[0035] 术语"脂类"意指在非极性溶剂中可溶而在水中相对不可溶的一类控类。脂类分 子由性质上疏水的长的控尾构成。脂类的实例包括脂肪酸、甘油单醋、甘油二醋、甘油=醋 等。
[0036] 术语酷基甘油（tria巧Iglyceride)"、"甘油S醋"和"TAG"可交换用来表示从 甘油和=分子脂肪酸衍生的醋。
[0037] 在本公开的实施方案中，提供脂类的产生和胞外分泌方法。
[0038] 在本公开的实施方案中，所述脂类为TAGS。
[0039] 在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏氮的改良生长培养基而在含油微生物 中产生TAGS的方法。
[0040] 在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏铁的改良生长培养基而在含油微生物 中产生TAGS的方法。
[0041] 在本公开优选实施方案中，提供通过使用缺乏铁和氮的改良生长培养基而在含油 微生物中产生TAGS的方法。
[0042] 在本公开的实施方案中，提供通过使用缺乏铁的改良生长培养基，从含油微生物 胞外分泌TAGS的方法。
[0043] 在本公开优选的实施方案中，提供通过使用缺乏氮和铁的改良生长培养基，从含 油微生物产生和胞外分泌TAGs的方法。
[0044] 在本公开的实施方案中，提供TAGS的产生和胞外分泌方法，所述方法包括：(a)使 含油微生物的培养物在未改良的生长培养基中生长5-7天；化）通过离屯、分离微生物质；且 (C)在缺乏氮和铁的改良生长培养基中使来自化）的微生物质生长。
[0045] 在本公开的实施方案中，提供TAGS的产生和胞外分泌方法，所述方法包括：(a)获 得含油微生物的生物质；且化）在缺乏氮和铁的改良生长培养基中培养所述含油微生物的 生物质，导致脂类产生和胞外分泌的增强。
[0046] 在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为桑格-格兰尼克（Sangerand Granick)培养基。
[0047] 在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为TAP培养基。
[0048] 在本公开的实施方案中，所述未改良的生长培养基为末刚高盐培养基（Sueoka'S highsaltmedium)。
[0049] 在本公开优选的实施方案中，所述未改良的生长培养基为营养肉汤生长培养基。
[0050] 在本公开的实施方案中，所述营养肉汤生长培养基的pH为7. 0。
[0051] 在本公开的实施方案中，在桑格-格兰尼克培养基中生长5天时的微生物质浓度 为 10. 9mg/L。
[0052] 在