检测ret基因m918t位点突变的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测RET基因M918T位点 突变的引物、试剂盒及其PCR方法，用于RET基因M918T位点突变的快速检测。
【背景技术】
[0002] 多发性内分泌腺瘤 2 型（multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2)是一种 以甲状腺、肾上腺髓质和甲状旁腺内神经内分泌细胞发生增生或肿瘤为主要特征的常染色 体显性遗传病，临床上分为MEN2A、MEN2B和家族性甲状腺髓样癌三个亚型，MEN2A主要累及 甲状腺C细胞、肾上腺髓质和甲状旁腺，分别表现为甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺 功能亢进；MEN2B主要表现为甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤和口唇舌和胃肠道神经瘤和马凡 综合征体型。
[0003] MEN2由原癌基因RET突变引起，该基因位于染色体lOqll. 2上，其编码蛋白RET是 与细胞膜结合的酪氨酸激酶受体，转导某些组织发育(包括由神经嵴发育而来的组织）的生 长和分化信号，RET基因的某些突变激活RET激酶活性，引起肿瘤发生或转化。
[0004] 临床证据表明，RET基因突变多发生于第10外显子上的609、611、618、620和第11 外显子的634编码子，其中后者突变最常见，约占MEN-2A的85%~87%，而且超过90%的多 发性内分泌腺瘤2型的发生与RET基因的M918T突变密切相关。通过RET基因突变筛查， 可早期发现患病基因型携带者，进行有效的干预治疗，从而改变临床病程，改善预后，RET基 因突变的筛查已成为遗传研宄的一个典型。
[0005] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0006] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0007] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3): 163-9，United States Patent 20120135406]。
[0008] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0009] 4) PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0010] 5)PCR-Taqman MGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;United States Patent 20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0011] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0012] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B.，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen, X.，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J., Anal Biochem 2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了 PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0013] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修饰的碱基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0014] 因此，如何对RET基因M918T位点突变进行简单准确的检测，成为人们亟待解决的 问题。
【发明内容】
[0015] 鉴于此，本发明提供了一种检测RET基因M918T位点突变的引物、试剂盒及其PCR 方法，以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度大，存在一 定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等一个或 多个问题。
[0016] 本发明提供的方案具体为：一种检测RET基因M918T位点突变的引物，其特征在 于，所述引物包括：野生型特异性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引 物与突变型特异性上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQ No. 18序列，所述突变型特异性上游引物具有 SEQ No. 15序列，所述共用的下游