扩增工序中产生的基因间的扩增偏好进行校正，因此能够高精度地对试样中初始存在的mRNA量进行定量。然而，在单细胞中的同一基因的表达量比分子识别标签序列的变异更多的情况下，扩增偏好校正的准确性降低。位于最靠近3’侧的寡聚(dT)序列与添加在mRNA32的3’侧的多聚A末尾杂交，用于捕捉mRNA32 (图3 (b))。
[0088]本实施例中，为了对mRNA进行分析，在互补用DNA探针31的一部分使用了多聚T序列，毋庸置疑，为了进行microRNA、基因组分析，随机序列也可以使用与欲分析的序列互补的序列的一部分，以代替多聚T序列。
[0089]接下来，以由珠子上的DNA探针31捕捉的mRNA32为模板合成第一 cDNA链33。本工序中，使含有逆转录酶和合成基质的溶液充满填装的珠子的空隙部分，缓慢升温至50°C，进行约50分钟的互补链合成反应，图3(c)。反应结束后，使RNase通过填装有珠子的区域来流动从而将mRNA32分解除去。接下来，使含有碱性改性剂的液体和洗涤液通过珠子的空隙部分来流动，将残留物和分解物除去。通过至此的工艺，在填装于核酸捕获部的珠子上，构建反映了捕捉于细胞捕获部的各个细胞的位置的如图5(c)所示的cDNA文库阵列。
[0090]接下来，为了将残留于细胞捕获部的细胞的破片去除，使Lysis buffer从下部反应区域8向上部反应区域7流动。接着，使添加有PCR扩增用共有序列(Reverse)的多个(?100种)靶基因特异性序列引物41与第一 cDNA链退火(图4(d))，通过互补链延伸反应合成第二 cDNA链42(图4(e))。即以多重条件进行第二 cDNA链合成。由此，对于多个革巴基因，合成两端具有扩增用共有序列(Forward/Reverse)、该序列中包含细胞识别标签、分子识别标签和基因特异性序列的双链cDNA链。此外，本实施例中，作为一个例子，20种(ATP5B、GAPDH、⑶SB、HMBS、HPRTl、RPL4、RPLPl、RPS18、RPL13A、RPS20、ALDOA、B2M、EEF1G、SDHA、TBP、V頂、RPLP0、RPLP2、RPLP27和0AZ1)基因特异性序列使用了从靶基因的多聚A末尾开始109 ±8碱基上游部分的20 ±5个碱基，这是因为在后续的PCR扩增工序中将PCR产物大小统一为约200碱基。通过使PCR产物大小统一，能够省去复杂的大小分级纯化工序(电泳一切胶一PCR产物的提取、纯化)，具有能够直接用于从I分子进行平行扩增(乳液PCR等)的效果。然后，使用扩增用共有序列(Forward/Reverse)进行PCR扩增，制备来自多种基因的PCR产物43 (图4(f))。在该工序中，即使基因间或分子间产生扩增偏好，在取得第二代测序数据后，也可以利用分子识别标签进行扩增偏好的校正，因此能够获得高精度的定量数据。
[0091]每一个细胞的mRNA的数量为约16个，用于捕捉该mRNA的核酸捕获部分填装有
1.1 X 15个磁珠12。磁珠表面固定有链霉亲和素，DNA探针31的5’末端经生物素修饰，从而通过链霉亲和素而被固定于磁珠表面。
[0092]至此，在生成于珠子表面的cDNA (第一 cDNA)上，使用添加有PCR扩增用的共有序列的数十种基因特异性序列引物，合成第二 cDNA，这里，公开了 PCR扩增的例子。当然，也可以使用滚环扩增(RCA)、NASBA, LAMP法等其他扩增法。
[0093]接下来，对核酸提取器件的制作方法进行详细描述。关于填装有磁珠的核酸捕获部、细胞捕获部以及连接它们的流路，使用半导体工艺制作PDMS (聚二甲基硅氧烷)制的基板6。细胞捕获部使直径10 μ m的贯通孔以125 μ m间隔阵列状配置。基板的大小是边长为13mm的正方形，其中配置有14个细胞捕获部。在细胞捕获部的正下方，贯通孔的直径扩大至50 μ m，将磁珠填装于该部分。该贯通孔，在配置成阵列状的基板6之下，配置细孔阵列片(多孔质膜)35。该细孔阵列片的细孔的直径比磁珠的直径即Iym小。
[0094]然后，分别填充至喷墨打印头，将固定有不同的序列的珠子分别填充至核酸捕获部4，每个2nL。
[0095]细孔的内壁被加工为亲水表面，能够吸收水并将珠子保持于核酸捕获部。作为细孔阵列片，也可以使用由多孔质玻璃形成的整体片、将毛细管捆扎并切片而成的毛细管板、尼龙膜或凝胶薄膜等各种材料，这里，使用了对氧化铝进行阳极氧化而得的细孔阵列片。这样的片还可以通过阳极氧化来自行制作，孔径20nm?200nm、直径25mm的片也可以作为市售品获得。由其切出边长13_的正方形来使用。片中形成的细孔是连通核酸捕获部与下部反应区域的流路5。
[0096]上述PDMS制基板和细孔阵列片通过等离子体粘接而粘接。
[0097]这里，也可以使用通过纳米压印技术、注射成型制作的树脂(聚碳酸酯、环状聚烯烃、聚丙烯)制的基板、市售的尼龙筛网、径迹蚀刻膜来代替PDMS制基板。与细孔阵列片的粘接也可以使用热粘接。
[0098]此外，毋庸置疑，该反应层也可以使用半导体工艺进行一体加工。
[0099]接下来，利用与喷墨打印机同样的技术，将固定有5’经生物素基团修饰的DNA探针的直径I μ m的磁珠溶液(7 X 19个/mL)注入核酸捕获部4，每个区域2nL。此时，排出根据区域的不同而不同的具有细胞识别标签序列(1024种)的DNA探针。磁珠的溶液通过流路5被排出，仅留下珠子。这里，固定具有不同的细胞识别用标签序列的mRNA捕捉用DNA探针的方法是，在各反应管中将磁珠与DNA探针溶液混合，在含有1.5M NaCl的Tris缓冲液(pH 7.4)中混合，一边旋转10分钟，一边进行结合反应。
[0100]以下，制成如上所述记载的核酸提取器件并使用图5对用于利用第二代(大规模)测序仪获得基因表达谱的装置系统进行说明。以不对细胞造成损伤的方式用500 yL的IXPBS对1000个左右以下的细胞进行洗涤后，将溶液除去，尽量使PBS无残留，加入50 μ L冷却至4°C的I XPBS缓冲液。细胞从细胞入口 308导入，将缓冲液从下部出口 307排出，从而使细胞在细胞捕获部排列成阵列状。过量的细胞从上部出口 306排出。接下来，从上部入口 305导入Lysis缓冲液，使PBS缓冲液从流路306和307排出，将上部反应区域7中置换为Lysis缓冲液。核酸提取器件的上下被透明的上基板301和下基板302夹持。在这些基板内侧通过溅射形成透明(ITO)电极，施加电场，通过电泳使核酸向细胞正下方的核酸捕获部移动。使电极透明的理由是为了能够利用光学显微镜对细胞进行观察，本次使用的ITO透明电极在400-900nm的波长范围具有40%以上的透过特性。
[0101]将Lysis Solut1n 495uL(TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit !AppliedB1systems Inc.)和DNase I 5uL从入口 305注入。确认溶液已发生了凝胶化，使温度上升至20°C，反应8分钟，然后，在凝胶上添加50uL Stopping Solut1n (使DNase失活的溶液)，反应5分钟，冷却至4°C。接下来，加入含有分子量60万、0.03%的PEO (聚氧化乙烯)、分子量100万、0.03%的PVP (聚乙烯基吡咯烷酮)以及0.1%的Tween 20的1mMTris Buffer (pH 8.0)0.5mL。此时，上部电极301与下部电极302间的距离设为2mm，上部反应区域7和下部反应区域8被所述Tris buffer完全充满。在使溶液温度维持在4°C的状态下，将上部电极301设为阴极(GND)、将下部电极302设为阳极，使用电源311施加2分钟+5V的电压，使带负电荷的mRNA从细胞内部向下部反应区域8的方向电泳。代替DC电压施加，电泳条件也可以使用开启水平10V、关闭水平0V、频率10kHz、占空比50%的脉冲电泳。该过程中，mRNA几乎全被固定于珠子的DNA探针的寡聚(dT)部分捕获。然而，一部分mRNA会由于二级结构而不被捕获，移动至珠子下部的下部反应区域8。为了利用DNA探针完全将mRNA捕获，使溶液的温度上升至70°C并保持5分钟后，一边每隔I分钟使施加于下部电极302的电压的极性反转，一边以-0.10C /sec冷却至4°C (最初，施加I分钟-5V的电压，然后，以+5V —-5V的方式，每隔I分钟重复施加10次)。接下来，从入口 305导入上述tris buffer，从出口 306排出，从而一边对上部反应区域7中的溶液进行交换，一边使溶液的温度上升至35°C使琼脂糖凝胶溶解，对不需要的细胞组织和琼脂糖进行洗涤、除去。进而，将含有 0.1% Tween20 的 1mM Tris Buffer (pH = 8.0)585 μ L、1mM dNTP 40yL、5xRT Buffer (SuperScript III，Invitrogen 公司)225 μ L、0.1M DTT40 μ L、RNaseOUT (Invitrogen 公司)40 μ L 以及 Superscript 111(逆转录酶，Invitrogen公司)40 μ L混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口 306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口 305注入。然后，使溶液的温度上升至50°C，保持50分钟，从而终止逆转录反应，合成具有与mRNA互补的序列的第一 cDNA。
[0102]以文库的形式获得按细胞固定于大量珠子表面的cDNA。这应该被称为单个细胞cDNA文库阵列，与迄今为止的由大量细胞获得的平均化的cDNA文库在根本上是不同的。
[0103]由如此获得的cDNA文库阵列，对于各种基因，对各基因的表达量定量地进行测定。每个细胞有I万个细孔，因而平均每个细孔的cDNA的个数为100个。对于I种cDNA，当每一个细胞的cDNA拷贝数为I万个以下时，每个珠子平均为I个以下。
[0104]合成第一 cDNA链后，在85°C保温1.5分钟使逆转录酶失活，冷却至4°C后，将1mL含有 RNase 和 0.1 % Tween20 的 1mM Tris Buffer (pH = 8.0)从入口 305 注入并从出口306,307排出，从而使RNA分解，使等量的碱性改性剂同样地流动，对残留物和分解物进行除去、洗涤。然后，将灭菌水 690 μ L、1x Ex Taq Buffer (TaKaRa B1 公司)100yL、2.5mMdNTP Mix 100 yL、添加有各10 μΜ的20种PCR扩增用共有序列(Reverse)的基因特异性序列引物 MixlOO μ L 以及 Ex Taq Hot start vers1n (TaKaRa B1 公司)10 μ L 混合，将充满器件的溶液从出口 306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口 305注入。然后，进行95°C 3分钟一44°C 2分钟一72°C 6分钟的反应，以