用于治疗mps1的组合物和方法
【专利说明】用于治疗MPS1的组合物和方法
[000。 发明背景
[0002] 粘多糖胆积症是由缺乏糖胺聚糖（GAG)(也被成为粘多糖）降解中设及的特异 性溶酶体酶引起的一组遗传性障碍。部分降解的GAG的累积引起对细胞、组织、和器官功 能的干扰。随着时间，GAG在细胞、血液和结缔组织内累积，造成越来越多的细胞和器官 损伤。最严重的粘多糖胆积症（MP巧障碍MPSI是由酶aA-艾杜糖巧酸酶（IDUA)的 缺乏引起的。运导致S种临床综合征，按严重性的顺序为贺勒氏化urler)、贺勒-施艾氏 化urler-Scheie)和施艾氏（Scheie)综合征。每一种都是常染色体隐性遗传，酶缺陷的程 度与临床表型的严重性直接相关。
[0003] 已经报道IDUA基因为生产称为a 艾杜糖巧酸酶的酶提供指示，运种酶对于分 解称为糖胺聚糖（GAG)的大的糖分子是必要的。具体地，报道了a艾杜糖巧酸酶从被 称为硫酸化a 艾杜糖醒酸的分子中去除硫酸素（sul化te)，硫酸素存在于被称为硫酸 乙酷肝素和硫酸皮肤素两种GAG中。a 艾杜糖巧酸酶位于溶酶体中，溶酶体是细胞内消 化和再循环不同种类的分子的隔室。已经发现IDUA基因中的多于100种突变引起I型粘 多糖胆积症（MPSI)。改变一个DNA结构单元（核巧酸）的突变是最常见的。引起MPSI 的突变减少或完全消除a艾杜糖巧酸酶的功能。
[0004]关于临床综合征，目前对贺勒氏综合征的医疗标准是造血干细胞移植化SCT)，如 骨髓移植度MT)或厮带血移植扣CBT)。要尽早并且在两岁前进行运一手术，从而影响疾病 的躯体和CNS两个方面。然而，对于MPSI的HSCT仍然与大量发病和20%的死亡率相关。 如果移植不是选项，则可W开始酶替代疗法巧RT)，该疗法需要为了患者的生命而每周输注 酶。邸T不影响CNS疾病的进展，但部分改善躯体表现。器官巨大症得到显著改善，尽管疾 病在骨骼系统、眼和屯、脏方面仅得到部分改善。患者可能需要手术来稳固臀部和膝盖并且 来治疗腕管综合征和手指收缩。屯、脏疾病用药物治疗，尽管最终可能需要手术。
[0005] 对于MPSI的ERT提供外源性酶来摄取到溶酶体中并且增加GAG的分解代谢。尽 管溶酶体酶在内部起作用，细胞表面甘露糖-6-憐酸受体能够结合、内化、和递送运些酶到 溶酶体。重组IDUA(阿杜拉酶（Aldura巧me货），拜马林制药度ioMarin))被抑A批准用 于患有贺勒氏和贺勒-施艾氏形式的MPSI的患者和用于患有施艾氏形式的患者，运些患 者具有中等到严重的症状并且被示为改善了肺功能和行走能力。还观察到了ERT减少MPS I患者的肝脏肿大W及尿液中GAG的水平。然而，因为静脉内的酶不容易穿过进入脑部，所 W目前ERT没有解决某些MPSI患者经历的神经症状。
[0006]ERT的并发症围绕对重组酶的免疫应答，其范围可W从溫和到全面过敏反应W及 终生外周通路并发症如局部和全身感染。高达91%的接受阿杜拉酶的患者发展出了对酶 的抗体，尽管并不清楚它对疗效有多大影响。进一步地，ERT需要在医院环境下每周静脉内 (i.V.)输注，经3-8小时的时期给药，运严重影响了患者的生活质量，并且高昂的费用是卫 生保健报销系统的主要压力。
[0007] 鉴于运些限制，可W更有效地矫正与MPSI相关的发病的治疗仍然是未满足的医 疗需求。
[000引发明概述
[0009] 在一个方面，本发明提供了表达盒，该表达盒包括人a 艾杜糖巧酸酶化IDUA) 基因，该基因具有SEQIDNO: 1核巧酸序列或在人细胞中编码功能性人a艾杜糖巧酸 酶的、与SEQIDNO: 1具有至少约95%-致性的序列，其中所述表达盒进一步包括在人细胞 中指导人a 艾杜糖巧酸酶表达的调控序列，所述调控序列包括肝脏特异性启动子。
[0010] 在另一个方面，本发明提供了包含该表达盒的载体。在一个实施例中，该表达盒位 于cis质粒上。在另一个实施例中，该表达盒位于祀順.TBG.hIDUA.nRBG上。
[0011] 在还另一个方面，本发明提供了重组腺相关病毒（rAAV)颗粒，该颗粒具有AAV衣 壳并且具有包装在其中的左反向末端重复序列（口时、在控制其表达的调节序列的控制下 的人aA-艾杜糖巧酸酶化IDUA)基因、和AAV右口R，其中所述hIDUA基因具有在SEQID NO: 1 (图1)中示出的序列或编码功能性人aA-艾杜糖巧酸酶的、与SEQIDNO: 1示出的 序列具有至少约95%-致性的序列。在一个实施例中，该功能性hIDUA基因在肝脏特异性 启动子的控制下进行表达。运种启动子可W是甲状腺素结合球蛋白（TBG)启动子。
[0012] 在进一步的方面，本发明提供了重组腺相关病毒颗粒AAV2/8.TBG.hIDUA.CO。
[0013] 在还另一个方面，本发明提供了对于治疗I型粘多糖胆积症（MPSI)有用的组合 物，该组合物包括rAAV和药学上可接受的载体，该rAAV包括在此所述的表达盒。
[0014] 在仍另一个方面，本发明提供了用于治疗I型粘多糖胆积症的方法，该方法包括 递送有效量的组合物，该组合物包括药学上可接受的载体和如在此所述的rAAV。
[0015] 在还另一个方面，本发明提供了用于治疗或改善贺勒氏、贺勒-施艾氏和/或施艾 氏综合征的症状的方法。
[0016] 本发明的还有其他方面和优点将从本发明的详细描述中显而易见。
[0017] 附图简要说明
[001 引 图 1A至 1D提供了在此所述的祀NN.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB质粒[SEQIDNO: 3] 的序列，该序列包括功能性人IDUA基因的核酸序列。功能性IDUA的基因位于图1的位置 1251-3213处，并且还在SEQIDN0:1和2中提供了其编码的酶序列。进一步对序列进行注 释W标识W下序列：amic/b化增强子、内含子1、兔球蛋白polyA、口R、复制起点。
[001引 图2提供了祀順.AAV.TBG.PI.hIDUA.RGB的环状图。
[0020] 发明详细说明
[0021] 在此所述的组合物提供了携带人IDUA基因的表达盒，该表达盒在人类受试者中 表达治疗有效量的功能性人aA-艾杜糖巧酸酶。
[0022] 如在此所使用，"治疗有效量"指在祀细胞中递送和表达足W改善或治疗贺勒氏、 贺勒-施艾氏和/或施艾氏综合征、和或MPSI症状的酶的量的组合物的量。"治疗"可W 包括预防运些综合征（或MPSI)中的一种的症状的恶化并可能逆转其症状中的一种或多 种。
[0023] 如在此所使用的"功能性人a 艾杜糖巧酸酶"指人a 艾杜糖巧酸酶 的酶，该酶通常在未患有MPS1或相关综合征（如贺勒氏、贺勒-施艾氏和/或施艾氏 综合征）的人中起作用。相反地，引起MPS1或运些综合征中的一种的人aA-艾杜糖 巧酸酶的酶的变体被认为是非功能性的。在一个实施例中，功能性人a-^艾杜糖巧 酸酶具有布雷默度remer)等人在W下文献中所描述的野生型人a 艾杜糖巧酸酶 的氨基酸序列：分子遗传学与新陈代谢（Mol.Genet.Met油.）104 (3) : 289-294 (2011)，NCBI参考序列NP_000194. 2,重现在SEQIDN0:2化53个氨基酸）中。然而，此序列的 若干天然发生的功能多态性（变体）已被描述并可W涵盖在本发明的范围内。参考 SEQIDN0:2,运些变体包括在位置110处的N-键联糖基化[陈（化en)等人，蛋白质组 学研究杂志（JProteomeRes.)，8:651-661(2009)]，在氨基酸位置33处的从H到Q的 改变[SEQIDN0:7,VAR_003350 ;斯科特?服(Scott,服）等人，美国国家科学院院刊 (Proc化tlAcad.Sci) ,88:9695-9699(1991);斯科特?服(Scott,服）等人，基因组学 (Genomics) ,12:1311-1313 (1992);斯科特.服(Scott,服）等人，人类遗传学（HumGenet), 90:327-327(1992);贝尔托拉*F度ertolaF.)等人，人类突变，32:E2189-E2210(2011)]， 在氨基酸位置82处的H到Q的还原[SEQIDN0:8,VAR_020976 ;斯科特?服(Scott,服） 等，人类遗传学（HumGenet),上文引用]，在位置105处的从R到Q的改变[SEQIDN0:9， VAR_003356 ;斯科特?服(Scott,服）等人，人类遗传学（HumGenet),上文引用；贝尔托拉 @edola)等人，上文引用]，在位置116处的从G到R的改变[SEQIDNO: 12，VAR_003367]， 在位置279处的从V到A的改变[SEQIDNO: 11，VAR_003359]，在位置346处的从L到R 的改变[沈QIDNO: 12,VAR017436,腾，YNaeng.YN)等人，临床遗传学（Clin.Genet)， 57:131-136 (2000)]，在位置 361 处的从A到T的改变[SEQIDNO: 13,VAR_003364;斯科 特?服(Scott,服）等人，人分子遗传学（HumMolGenet) ,2:1471-1473 (1993);宇佳玲加 姆灯ogalingam)等人，人类突变（HumMutat)，24:l99-207(2004);贝尔托拉度edola)等 人，上文引用]，在位置449处的从H到N的改变[SEQIDNO: 14,VAR_066228,贝尔托拉 @edola)等人，上文引用]，在位置454处的从V到I的改变[SEQIDN0:15，VAR_003372， 宇佳玲加姆（Yogalingam)等人，上文引用；贝尔托拉度ertola)等人，上文引用]，在位置 591处的从A到T的改变[SEQIDN0:16,VAR_0066231，贝尔托拉度ertola)等人，上文引 用]，和在位置622处的从A到T的改变[SEQIDN0:17,斯科特（Scott)等人，基因组学 (Genomics)，上文引用]。参见例如UniProt邸/Swiss-Protuniprot.org/uniprot/ P35475。在另一个实施例中，功能性人aA-艾杜糖巧酸酶可W包括合成氨基酸序列，其 中SEQIDNO:2的前26个氨基酸的全部或一部分由异源前导肤所替代，运些氨基酸对应 于前导（信号）肤。运个负责将酶通过其分泌路径转运出细胞进入循环的前导肤可W由 另一种合适的前导肤所取代，例如，如来自白细胞介素-2 (比-2)或制瘤素的前导肤。优 选合适的前导肤，但并不必需来自人。可W从ht1:p://p;roline.bic.nus.edu.sg/spdb/ zhang270.htm(将其通过引用结合在此）选择合适的前导肤，或可W使用多种用于在选择 的蛋白中确定前导（信号）肤的计算程序来确定。尽管不受限制，运样的序列长度可W从 约15到约50个氨基酸，或长度可W从约20到约28个氨基酸，或可W根据需要更长或更 短。另外，至少一种体外测定已经被描述为对评估IDUA酶的酶活性是有用的[参见，例 如，见卡其斯化akkis)等人，分子遗传学与新陈代谢（Mol.Genet.Met油.），2001年3月； 72(3):199-208]〇
[0024] 合适地，在此所述的组合物和方法不需要长期、重复每周注射治疗剂量。不希望被 理论所限制，在此所述的方法被认为对于矫正除了与MPSI障碍相关的躯体症状之外的中 枢神经系统表型是有用的。
[00幼表达盒
[0026] 表达盒在最低限度上由基因及其调节序列构成。当该盒被设计成用于从重组腺相 关病毒进行表达时，该表达盒进一步包含5'和3'AAV反向末端重复序列（ITR)。运些ITR 可W是全长型，或运