用于增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞的制作方法
【专利说明】用于増殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞 阳001] 本发明设及能够增殖动脉炎病毒（Art&rtivirus)的哺乳动物细胞，设及使用动 脉炎病毒感染的此类细胞，设及包括此类细胞的细胞培养物，并且设及用于在此类细胞中 增殖动脉炎病毒的方法。
[0002] 动脉炎病毒家族包括马动脉炎病毒（EAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)、乳 酸脱氨酶增高病毒（LDV)和猴出血热病毒（SHFV)。在运四个病毒物种中，LDV和SHFV只有 较小的经济影响，因为它们分别感染小鼠和猴。与之相比，EAV，且特别是PRRSV，对社会造 成了相当大的经济负担。
[0003] 马动脉炎病毒导致马的感染，并且因此在马养殖产业中造成复发性问题。因此 其对马养殖者造成了显著的经济负担。马动脉炎病毒在所谓的"携带者公马（carrier stallion)"中产生持续的感染，其随后将病毒传播至母马，潜在地导致胎儿的流产。
[0004] 马养殖者小屯、地监控EAV的出现（特别是在公马中），并且已经基于活减毒病毒或 基于EAV结构亚单位的表达，开发出若干针对所述病毒的疫苗。然而，近期在美国新墨西哥 州（2006)和法国（2007)的爆发进一步增加了兽医和驻人对EAV和EAV疫苗的兴趣。 阳0化]PRRSV是目前为止经济上最重要的动脉炎病毒，其影响全世界的猪养殖业。感染该 病毒导致断奶猪仔至育肥猪的缓慢生长、降低的喂养效率、厌食和发热，妊娠母猪的流产和 幼猪的呼吸问题。单在美国，每年与PRRSV感染有关的损失估计在约$5. 60亿（2005年） 和$6. 64亿（2011年）。PRRSV被列为对猪产业的首位健康挑战，与其他疾病，例如，艰难梭 菌（C/o別ri扣歴扣、猪流感、链球菌（沉rejOfococc化sp.)、轮状病毒或猪圆环病 毒导致的损失时相比，其导致了最大的生产力损失。考虑到2006年PRRSV的高强毒株在东 南亚的出现W及亚洲的猪产业是世界最大的事实，可W稳妥地假设世界上在该地区的损失 要远远高于在美国报告的那些。
[0006] 尽管针对PRRSV的活减毒疫苗和灭活疫苗均可W获得，因为已证实相关疾病难W 控制，PRRSV仍是猪产业的主要威胁。
[0007] 动脉炎病毒家族由具有大小在约13至16化范围的基因组的正义（+)单链RNA病 毒组成。感染时，RNA被翻译为两种复制酶前体多蛋白：ppla和pplab。动脉炎病毒的功能 非结构蛋白（nsps)来源于运些多蛋白通过其内在蛋白酶活性的切割。从多蛋白释放后，运 些非结构蛋白一同形成复制和转录复合体，其负责病毒基因组的复制和编码结构蛋白的次 基因组信使RNA的合成。将原型动脉炎病毒EAV的ppla和ppl油多蛋白通过存在于非结 构蛋白1 (nspl)、nsp2和nsp4中的3个内在蛋白酶切割为至少13个非结构蛋白。
[0008] 动脉炎病毒nsp2在其N-端区域含有木瓜样蛋白酶（PL巧结构域。该蛋白酶通常 被称为PLP2,其负责切割nsp2和nsp3之间的连接，并且其催化活性（可能因为该原因）对 病毒复制是关键的。
[0009] 对于大多数病毒物种，情况如下：当感染时，病毒核酸的存在引发先天免疫信号 级联的激活，导致转录因子诸如NF-KP和IrC/IrfT的激活，最终导致编码P干扰素 (IFN-0)和其它促炎性细胞因子的基因转录。
[0010] 运个所谓的先天免疫提供了宿主针对病毒非常有用的天然防御。然而，同样的先 天免疫对疫苗生产者造成了问题。全病毒疫苗的生产一般通过在体外（例如，在细胞培养 物中）增殖（野生型或减毒的）病毒，随后收获子代病毒。作为先天免疫的结果，在体外生 产的病毒的量通常相当低：INF-P的诱导导致了其他细胞针对病毒入侵（和随后的复制） 的保护。
[0011] 对于数种病毒物种，该问题理论上可W通过减少生产的INF-P的量解决。
[0012] 然而，在动脉炎病毒的情况中，由于W下原因该方法被认为没有效果：已知动脉炎 病毒非常有效地逃避了宿主的先天免疫应答。动脉炎病毒的运些强大的免疫调节能力防止 了针对野生型PRRSV和针对活减毒PRRSV的有效免疫应答的诱导。因此，可W诱导的免疫 水平对针对野外感染的保护是次优的。
[0013] 动脉炎病毒的运种免疫逃避特征的原因是已知的。其由动脉炎病毒的nsp2蛋白 质导致，除了在多蛋白加工中的作用外，其还在逃避宿主先天免疫应答中具有非常强的作 用。
[0014] 比较序列分析显示该蛋白质的PLP2域展现出与属于去泛素化酶值UB)的含卵巢 肿瘤域（OUT)类型的蛋白质的相似性（Makarova(2000))。自此已经确认动脉炎病毒PLP2 确实具有真正的DUB活性并且该活性很可能被用于从先天免疫信号因子移除泛素（也进 一步称为Ub)，W抑制抗病毒状态的诱导（化ias-St址eli,N. (2007)，Sun,Z. (2010)， vanKasteren，P.B. (2012))。除了其DUB活性，还显示动脉炎病毒PLP2将泛素样抗 病毒蛋白干扰素刺激基因15 (ISG15)从细胞祀蛋白移除（化ias-St址eli，N. (2007)、 Sun,Z. (2012)，Arguello,M.D. (2007))。该活性被称为去ISG化活性（deISG}dating activity)。由于泛素和ISG15的密切关系，一般将PLP2域的该作用称为DUB/去ISG化活 性。
[0015] 正是该DUB/去ISG化活性，通过抑制抗病毒状态的诱导，允许病毒绕开了宿主的 第一防御。
[0016] 可W理解地，动脉炎病毒通过阻断INF-P诱导逃避细胞的先天免疫系统的运种 特征具有在体外的结果：预期在易感染细胞（诸如通常用于增殖PRRSV的可商购获得的 M104细胞和Marcl45细胞）中的体外增殖不受先天免疫系统的影响：病毒本身已经阻断 了INF-P的诱导。
[0017] 因此，在动脉炎病毒的情况中，预期W在体外生产更多病毒为目标，减少此类细胞 生产的IFN-P的量的措施，对病毒滴度没有任何影响。如上文所述，动脉炎病毒在本质上 阻断宿主细胞中的体外INF-P生产，与在宿主体内生长的情况类似。
[0018] 然而，现在令人惊讶地发现，除了动脉炎病毒本身的阻断效果外，故意阻断细胞 中的IFN-P生产，导致在运些细胞中增殖的子代动脉炎病毒量的非常显著增加。甚至常 常获得高达6-7倍的病毒滴度的增加。对于上文解释的原因，考虑到已知动脉炎病毒阻断 IFN-P生产，运确实是预想不到的。
[0019] 因此，本发明的第一个实施方案设及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，其特 征在于所述细胞缺乏其IFN-P生产。
[0020] 在细胞中的病毒增殖是包括病毒在细胞中复制的过程，其结果是子代病毒出现。 因此能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞是能够生产所述动脉炎病毒的子代病毒的细胞。
[0021] 出于本发明的目的，根据本发明缺乏其INF-P生产的哺乳动物细胞是在刺激 INF-P通路后，显示出INF-P增加至由该哺乳动物细胞的野生型形式在相同刺激条件下 生产的INF-P的量的一半或小于一半水平的哺乳动物细胞。优选地，根据本发明的哺乳 动物细胞显示出增加的INF-P低于相同刺激状况下的由哺乳动物细胞的野生型形式显示 的INF-P的量的40%，更优选地低于30%、低于20%、低于10%或甚至低于5% (W该优选顺 序）。IFN-P的水平可W通过化ISA的方式确定。
[0022] 在实施例部分，给出了ELISA反应的描述，其可W用于确定在刺激INF-P途径后 INF-P蛋白质增加的水平。在实施例中，提供了确定和比较野生型细胞和根据本发明的细 胞中INF-P水平的方法。
[0023] 按照描述，所述测试使用可商购获得的抗体用于确定通过细胞生产的IFN-P的 量。不言而喻，同样可W使用与IFN-P反应的其他抗体。
[0024] 在根据本发明优选的哺乳动物细胞中，通过将抗INF-PsiRNA导入至宿主细胞 中，阻断INF- 0mRNA至INF- 0蛋白质的翻译，达到了预想不到的效果。
[0025] 该方法是基于双链siRNA(W任何形式，例如W短发夹形式的短干扰/抑制RNA) 对基因表达的基因沉默效应。运种所谓的RNA干扰（也简称为RNAi)，和siRNA背后的原 理和机制是过去十年中很多出版物的主题。RNAi的主要用途仍是，并且已经是在研究中 特异性地沉默宿主或宿主细胞的基因，W确定其在宿主中的作用。关于该主题的综述已 由Hannon,G.J.在化Uire418: 244-251 (2002)和由Deni,A.M.和Hannon,G.J.在 TRENDSinBiochemicalSciences28: 196-201 (2003)撰写。描述siRNA在基因沉默中的 用途的其他文献是Bedrand,J.R.等人，B.B.R.C. 296: 1000-1004 (2002)和Sorensen, D.R.等人，J.Mol.Biol. 327: 761-766(2003)。对siRNA的广泛的综述由Dorsett,Y.和 1\13油1,T.发布在化 1:ureReviews,DrugDiscovery3: 318-329 (2004)。
[0026] 为了在SiRNA和来自祀细胞的IFN-PmRNA之间获得最优的碱基配对，在Marcl45 细胞的情况中，本发明人首先将目前在基因库中可W获得的两种灵长类IFN-P基因的 序列进行了比对。作为下一步，基于运些灵长类IFN-P基因中的高度保守区域，开发 (RT)-PCR引物。将运些PCR引物用于生产来自Marcl45细胞IFN-PmRNA的IFN-PDNA。 对由此获得的Marcl45-特异的IFN-PDNA测序并且使用序列信息发展用于基因沉默的 SiRNA。通过运种方法，可議定SiRNA展示了对祀WN- 0mRNA最优的结合（详见实施例 部分）。
[0027] 对于基因沉默实验，培养能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞（在该情况中为 Marcl