sajOieas)干扰素-0序列的比对。
[0059] 图2:在T=在转染后24小时，使用聚（I:C)转染后的IFN-P表达。泳道2、3、7 和8显示了未转染的细胞，泳道4、5、9和10显示了在聚（I:C)诱导的情况下的效果，泳道 6和11是阴性对照。 W60] 图3:使用聚（1:0转染后持续的IFN-PmRNA表达。+和-指示了细胞处理，正 如对图2所使用的。
[0061]图4:IFN-PELISA。图4A显示了IFN-PELISA的标准曲线，并且图4B显示了 在数个时刻在培养基中测量的IFN-P蛋白质的实际水平。 阳06引图5:IFN-PmRNA的敲减。+和-指示了细胞处理，正如对图2所使用的。 阳06引 图6:IFN-e蛋白质表达的敲减。图6A显示了IFN-0ELISA的标准曲线，并且图 6B显示了在数个时刻在培养基中测量的IFN-P蛋白质的实际水平。
[0064]图 7:PRRSV滴定。 实施例 W65] 实施例1 IFN-目RT-PCR的开发巧siRNA的导出。
[0066]设计PCR引物，使其能够特异扩增MRC-145细胞的IFN-PmRNA的部分。产生NM_002176. 2 (人干扰素P1mRNA)和NM_001135795. 1 (雜猴干扰素P1mRNA)的比对。 将引物设计为与IFN-PmRNA序列的保守区域互补（图1，表1)。使用标准方法执行PCR。 作为RT-PCR程序的对照，在实验中总是包括对GAPDH的PCR。GAPDH引物序列显示在表1 中。用于两种引物的退火溫度均设定为55"C。 阳067] 将PCR样品在琼脂糖凝胶上进行电泳。将PCR产物从琼脂糖切出，使用QIAquick 凝胶回收试剂盒（Qiagen)纯化并且测序。通过将获得的MARC-145IFN-PmRNA核巧酸序 列引入到化OCK-iT?RNAi设计器（XifeTechnologies),导出QistomStealth?siRNAs (Invitrogen)(表2)。在全部siRNA实验中使用阴性对照siRNA(中等GC含量，Life Technologies)。
表 2:抗Marcl45IFN-BsiRNA混合物。
[0068] MARC-145细胸中IFN-目表武的诱导巧檢测 将MRC-145细胞在添加5%FCS的培养基6/B8修饰的培养基中，在37°C和5%C〇2下 增殖。
[0069] 为诱导干扰素应答，使用聚（I:C)转染MRC-145细胞。将细胞接种于6-孔培养 平板中并且根据生产商说明书，在90-95%汇合时使用1. 25-2. 5yg聚（I:C)和5. 0y1 Lipofectamine2000 (Invitrogen)牵专染。 阳070] 转染后，使用PBS洗涂细胞并且将其在补充1%P-琉基乙醇的360y1缓冲液化T (RNeasyMiniKit,Qiagen)中裂解。收集细胞裂解物并且使其5次通过21号针而均质 化。根据生产商的说明书，使用RNeasyMiniKit(Qiagen)分离RNA，其包括柱上DNA酶消 化。在将RNA洗脱到50y1 &0中。将洗脱的RNA在65°C解育10分钟，并且在冰上解育 至少2分钟。使用29RNA溶液，使用即用型化u-Prime第一链珠子（GEHealthcare) 和200ng随机引物（Invitrogen),在33iil的总体积中执行RT反应。将反应混合物在 室溫解育1分钟，随后在37°C解育1小时。最后，执行IFN-P和GAPDH的PCR(如上文描 述的）并且将PCR样品在琼脂糖凝胶上进行电泳。
[0071] 此外，在转染后收集细胞培养基并且根据生产商的说明书，使用Ver化ine-服人 IFN-P血清化ISA试剂盒（P化InterferonSource)确定IFN-P的量。 阳0。] 确iAsiRNA活忡 通过使用 5. 0ylLipofectamine2000,用 1.25yg聚（I:C)与 100pmol抗Ma;rcl45IFN-PsiRNA混合物（或100pmol中等GC含量阴性对照siRNA)组合，共转染30-50%汇 合的MRC-145细胞，随后进行RT-PCR和ELISA(如上文描述的），来确认抗IFN-PsiRNA 的活性。
[0073] 附断IFN-目表武巧PRRSV病毒滴定 使用siRNA转染前一天，将细胞W1X1〇3个细胞/cm2的密度接种于6-孔培养平板 上。在即将转染前，使用0. 01MPBS洗涂细胞一次。根据生产商的说明书，每孔使用2. 5W Lipofectamine2000 (Invitrogen)，将 100pmol阴性对照siRNAs(中等GC含量，Life Technologies)或100pmol抗Ma;rcl45IFN-PsiRNA混合物（表1)转染至细胞中。在每 孔1. 0ml培养基中，W0. 1的M0I感染PRRSV之前，将转染的细胞在37°C和5% %解育4 至5小时。在37°C和5%C〇2下解育1小时后，移除上清液。使用0. 01MPBS将细胞洗涂一 次，并且将新鲜的培养基放置在细胞上，随后在37°C和5%C〇2下解育至收获培养基（达到 感染后72小时）。根据生产商的说明书，使用Ver化ine-服人IFN-P血清化ISA试剂盒 (PI3LInterferonSource)确定培养基中IFN-P的量。
[0074] 通过在含有单层细胞的96孔微量滴定板中制备培养基样品的10倍系列稀释物执 行PRRSV滴定。在37°C和5%CA下解育7天后，筛选存在CPE的孔。根据Spearman-協rber 方法计算病毒滴度，并且表示为logi。TCIDw/ml。 阳0巧]结果 IFN-目在MARC-145细胸中的表武 为研究MRC-145细胞是否能够表达IFN-P，使用聚（1:0转染细胞。在转染后数个时 间点收获细胞和培养基。通过RT-PCR确定IFN-PmRNA表达（图2和3)并且基于标准曲 线，使用ELISA定量培养基样品中的IFN-P蛋白质的表达水平（图4a和b)。
[0076] 如图2中所示，使用聚（1:0的MRC-145转染造成了IFN-PmRNA表达的明显诱 导。图3显示IFN-PmRNA表达的诱导持续了至少30小时。
[0077] 转染细胞的培养基含有提升的IFN-P蛋白质水平。与IFN-PmRNA相似，增加的 IFN-P蛋白质表达可W检测至少30小时（图4b)。
[0078] 杭IFN-目siRNA在MARC-145细胸中的活忡 通过使用聚（I:C)和抗Marcl45IFN-PsiRNA混合物或中等GC含量阴性对照siRNA的组合转染MARC-145细胞，W确认抗IFN-PSiRNA的活性。分别通过RT-PCR和化ISA确 认IFN-PmRNA和蛋白质的表达。使用抗Marcl45IFN-PSiRNA混合物转染细胞明显地导 致了IFN-PmRNA(图5)和蛋白质表达（图6)的敲减。IFN-PELISA证明使用聚（1:0 和抗Marcl45IFN-PSiRNA混合物两者转染细胞事实上完全消除了IFN-P蛋白质表达的 诱导。由聚（I:C)转染导致的IFN-P蛋白质表达刺激，W及通过使用抗Marcl45IFN-0 SiRNA对运种效果的抑制，都维持了至少72小时（图6)。 阳0巧]在IFN-目敲减后MARC-145细胸中蜡加的PRRSV复制 通过使用抗Marcl45IFN-PSiRNA混合物或中等GC含量阴性对照SiRNA转染MRC-145细胞，随后使用PRRSV感染运些细胞，W研究IFN-P敲减对PRRSV复制的影响。 在转染后的数个时间点收获细胞培养基。通过滴定确定病毒复制的水平。如图7和表3中 所示，在使用siRNA抑制IFN-P表达的细胞中，PRRSV的复制是最有效率的。在将生长在 由抗IFN-PsiRNA转染的细胞中的病毒滴度与阴性对照siRNA相比时，滴度增加的差异达 到 0. 7Logic(表 3)。
表3 :PRRSV滴定
【主权项】
1. 能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞缺乏其IFN-P生产。2. 根据权利要求1的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞包括在合适的启动子控制下 编码siRNA的DNA片段，其能够沉默IFN- 途径的基因。3. 根据权利要求1的哺乳动物细胞，其特征在于所述细胞具有在IFN-P途径的基因中 的突变。4. 根据权利要求2或3中任一项的哺乳动物细胞，其特征在于所述基因选自以下基因 的组：编码IFN-P、IFN-a/0 受体、MyD88、IRAK-4、IRAK-UTRAF3 的基因、编码IKK-a亚 基和IRF7的基因。5. 根据权利要求1-4中任一项的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞能够增 殖PRRSV或EAV。6. 根据权利要求5的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞选自以下哺乳动物 细胞的组：BHK21、RK13、MA104 和Marcl45 细胞。7. 根据权利要求1-6中任一项的哺乳动物细胞，其特征在于所述哺乳动物细胞是由动 脉炎病毒感染的。8. 细胞培养物，其包含根据权利要求1-7中任一项的哺乳动物细胞。9. 根据权利要求8的包含哺乳动物细胞的细胞培养物，其特征在于所述哺乳动物细胞 是由动脉炎病毒感染的。10. 在细胞培养物中增殖动脉炎病毒的方法，其特征在于所述方法包括在根据权利要 求1-6中任一项的哺乳动物细胞中增殖所述病毒的步骤。
【专利摘要】本发明涉及能够增殖动脉炎病毒的哺乳动物细胞，涉及使用动脉炎病毒感染此类细胞，涉及包括此类细胞的细胞培养物，并且涉及在此类细胞中增殖动脉炎病毒的方法。
【IPC分类】C12N5/10, C12N7/02
【公开号】CN105026555
【申请号】CN201380067525
【发明人】L.古伊伦, C.C.施里尔
【申请人】英特维特国际股份有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】CA2893665A1, EP2935568A1, US20140178967, WO2014096314A1