柑桔黄脉病毒的rt-lamp引物组、检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒,属于分子生物学【技术领域】。本发明提供了柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP，以待测样品总RNA为模板，应用上述的内外引物对在60～63℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应70～100min，扩增完成后80℃再反应5～10min，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对RNA的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
【专利说明】柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种环介导等温扩增分子检测方法，尤其涉及一种柑桔黄脉病毒的 RT-LAMP引物组、检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 柑桔黄脉病由柑桔黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV)引 起。CYVCV属于柑桔病毒属（Mandarivirus)，直径为13_14nm，长约685nm。该病造成朽 1檬、 酸橙等柑桔品种叶片的叶脉黄化至透明，并有叶片反卷、皱缩等症状，严重时可至叶脉坏 死、嫩叶脱落，影响树势和产量。
[0003] 我国柠檬栽培面积达2. 67万hm2,年产值达几十亿元，是产地农户收入主要来源之 一。近年在我国云南等地相继发现了柑桔黄脉病，且目前无有效的防治药剂，因此柑桔黄脉 病的防控对我国柠檬产业健康、稳定发展具有十分重要的意义。
[0004] 柑桔黄脉病的检测，目前的方法有：指示植物鉴定、电镜检测、RT-PCR等。指示植 物鉴定采用柠檬作为指示植物，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。电镜 检测前期处理复杂，且对仪器要求高，检出率较低。RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点， 作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种病害的检验与诊断。虽然目前常规RT-PCR 已开始运用于CYVCV检测，但其对田间早期病树的检测效果不够理想，灵敏度还有待提高， 并且需要专业的PCR仪和电泳仪等特殊仪器，使其在田间的应用受到很大的限制。
[0005] 2000年由Notomi等发明的环形介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP)是一种新的 恒温核酸扩增方法，较传统的核酸扩增方法具有灵敏度高、特异性强、操作方法简单、快速 等优点，现已越来越多的应用于各种病毒的检测。其主要原理是通过采用特异地识别靶序 列上6个区域的4条引物（2条内引物-FIP/BIP，2条外引物-F3/B3)及具有链置换活性的 Bst DNA聚合酶，在等温条件（63°C左右）DNA开始合成。利用可以产生环状结构的引物和 Bst DNA聚合酶的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。 当一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链，引物在 恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增，最终的扩增产物是一系列反 向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳显现出不同 大小条带组成的阶梯式图谱。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物 组。
[0007] -种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组，由外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP组 成：
[0008] 夕卜引物对：
[0009] F3 :5, -TCCGGGGTAGACGAGAAC-3,；
[0010] B3 :5, -AGGTCCGTGCCATTTCCT-3,；
[0011] 内引物对：
[0012] FIP :5' -CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3' ；
[0013] BIP :5' -AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3'。
[0014] 本发明的另一个目的是提供不需要专门的核酸扩增仪器、操作简单方便、特异性 好、灵敏度高、检测快速的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测方法。
[0015] 本发明的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测方法，是以待测样品总RNA为模板，应用上述 的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在60?63°C恒温反应条件下，进行环介导恒温扩 增反应70?lOOmin，扩增完成后80°C再反应5?lOmin，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧光 染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。
[0016] 扩增反应中，总体积25 μ L的反应体系含有18 μ L反应液Α、5 μ L引物液B、浓度为 20 ?lOOng/μ L 的总 RNA 2μ L ;其中 18μ L 反应液 A 含有：2· 5μ L IOXBst buffer、3y L 25mM 的 MgCl2、2 μ L 4mM 的 Betaine、2 μ L IOmM 的 dNTPs、0. 5 μ L 40U/ μ L 的 RNA 酶抑制 剂、IyL 8U/yL的Bst聚合酶、IyL 10U/yL的AMV逆转录酶、6yL水；5yL引物液B包 括 2 μ L 20 μ M 的 FIP、2 μ L 20 μ M 的 ΒΙΡ、0· 5 μ L 10 μ M 的 F3、0. 5 μ L 10 μ M 的 B3。
[0017] 本发明的再一个目的是提供一种特异性好、灵敏度高、操作简单的柑桔黄脉病毒 RT-LAMP检测试剂盒。
[0018] 本发明的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，含有上述RT-LAMP引物组：外引物对 F3、B3和内引物对FIP、BIP。
[0019] 除了上述特异引物对外，该试剂盒还含有进行RT-LAMP扩增所需要的Bst buffer、MgCl 2、Betaine、dNTPs、RNA 酶抑制剂、Bst 聚合酶和 AMV 逆转录酶。
[0020] 本发明的有益效果是：以提取样本总RNA为模板，建立了快速检测柑桔黄脉病毒 的RT-LAMP技术，不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测的一些环 节，降低了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比RT-PCR高10倍，使该方法对柑桔黄脉 病毒的早期诊断更准确。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分 钟就可完成对RNA的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高，适合田间样品的大规模测定和 茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测结果示意图；1、3为感染柑桔黄脉病毒的样品， 2、4为健康叶片对照。
[0022] 图2为柑桔黄脉病毒RT-LAMP弓丨物组的特异性检测图；其中1为感染柑桔黄脉病 毒的样品，2-7分别为感染柑桔哀退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩病 毒、柑桔碎叶病毒和柑桔黄龙病的样品。
[0023] 图3为柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物酶切鉴定图；M为50bp Ladder DNA Marker ;1为RT-LAMP扩增产物；2-4为RT-LAMP扩增产物经Sau3AI酶切后电泳。
[0024] 图4为柑桔黄脉病毒常规RT-PCR检测灵敏度检测图；M为50bp Ladder DNA Marker ; 1-5依次为柑桔黄脉病毒样品稀释10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO 5倍常规RT-PCR 检测结果。
[0025] 图5为柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测灵敏度检测图；1-5依次为柑桔黄脉病毒样品 稀释10倍、IO2倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍RT-LAMP检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 本发明的实验材料：
[0028] 本实验所用分别感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩 病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病以及柑桔黄脉病毒的植株样品来源于西南大学柑桔研究 所保存毒源。
[0029] 主要试剂及生产者：
[0030] Betaine (Promega公司，美国），RNA酶抑制剂（鼎国公司，中国），Bst聚合酶（New England Biolabs，美国），AMV逆转录酶（BioFlux公司，日本），SYBR GREEN I (鼎国公司，中 国），Sau3AI 内切酶（TaKaRa 公司，日本），10 X H Buf f er (TaKaRa 公司，日本），50bp Ladder DNA Marker(Biomed 公司，俄罗斯），IOXBst bufTer(New England Biolabs，美国）。
[0031] 实施例1柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测特异性验证
[0032] 1、用于检测柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组
[0033] 根据柑桔黄脉病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，设计4条特异性引物，外引物 对F3、B3,内引物对FIP、BIP，引物序列如下：
[0034] F3 序列：5, -TCCGGGGTAGACGAGAAC-3,；
[0035] B3 序列：5, -AGGTCCGTGCCATTTCCT-3,；
[0036] FIP 序列：5, -CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3,；
[0037] BIP 序列：5, -AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3,。
[0038] 2、提取待测样品总RNA
[0039] 待测样品：选取表现CYVCV典型症状的叶片和健康植株的叶片分别作为正对照和 负对照。提取正对照和负对照样品的总RNA :取0. 05g叶片于I. 5mL无菌eppendorf管内， 液氮研磨后加入ImL Trizol,混勻，室温静置5min ;再加入0. 2mL氯仿，震荡15s，室温静置 3min ;4°C，12000rpm，离心15min ;取上清于干净的I. 5mL无菌eppendorf管内，加入0· 5ml 异丙醇，室温静置l〇min，4°C，12000g，离心IOmin ;倒掉上清，在eppendorf管内加入ImL 75%的乙醇洗涤；倒掉乙醇，室温干燥5-10分钟，加入30 μ L水溶解，-20°C保存。
[0040] 3、RT-LAMP 扩增
[0041] 在反应管中加入18μ L反应液A和5μ L引物液B,再加入2μ L前述提取的待测 样品总RNA，建立体积为25 μ L的扩增反应体系。62°C进行反应（水浴或者烘箱），反应 时间为 80min;然后 80°C 反应 5min。18yL 反应液 A 包括：2.5yL IOXBst buffer、3yL MgC12(25mM)、2yL Betaine(4mM)、2yL dNTPs(10mM)、0.5yL RNA 酶抑制剂（40U/yL)、 IyL Bst聚合酶（8U/yL)、lyL AMV逆转录酶（10U/yL)、6yL水；5yL引物液B包括2yL FIP(20yM)、2yL ΒΙΡ(20μΜ)、0·5μ? F3(10yM)、0.5yL Β3(10μΜ)。
[0042] 4、结果观察与验证
[0043] 对前述扩增产物进行结果分析，在扩增产物中加入1 μ L 100倍稀释的显色液荧 光染料SYBR GREEN I，可见表现CYVCV典型症状的正对照样品扩增产物颜色由无色变为黄 绿色，表明检测到了柑桔黄脉病毒；健康叶片的负对照样品扩增产物中加入SYBR GREEN I 后，离心管中的颜色为SYBR GREEN I的红棕色，未发生颜色变化，表明未检测到柑桔黄脉病 毒。
[0044] 用1. 5%的琼脂糖对前述扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示：泳道1、3为感 染柑桔黄脉病毒的样品，出现特异性阶梯式条带；泳道2、4为健康叶片对照，没有条带。
[0045] 5、特异性鉴定
[0046] 按照前述"2提取待测样品总RNA"的方法分别提取感染了柑桔衰退病毒、柑桔鳞 皮病毒、柑桔裂皮病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病以及柑桔黄脉病毒 的柑桔叶片的总RNA，使用前述建立的RT-LAMP体系对获得的总RNA进行检测，电泳结果如 图2所示，只有柑桔黄脉病毒样品出现特异性阶梯式条带，说明检测到了柑桔黄脉病毒；其 余病毒的泳道没有条带；说明该检测方法对柑桔黄脉病检测具有特异性。
[0047] 6、酶切鉴定
[0048] 用BioEdit软件对柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物片段进行分析，筛选出Sau3AI 限制性内切酶（'GATC_)对产物进行酶切分析，酶切产物理论值为62、147、183和219bp。 建立 20yL 的酶切体系，酶切体系为：lyL Sau3AI(10U/yL)、2yL IOXH Buffer、2yL RT-LAMP扩增产物、15 μ L水。37 °C反应3h，用8 %的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，经EB染色后 用凝胶成像系统观察。结果如图3所示，柑桔黄脉病毒RT-LAMP扩增产物经Sau3AI酶切后 出现了与理论值相同大小的62、147、183和219bp的条带，证明柑桔黄脉病毒样品RT-LAMP 体系扩增出的确实为柑桔黄脉病毒目的条带。
[0049] 实施例2柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测灵敏度检测
[0050] 对图1中感染柑桔黄脉病的样品1的总RNA模板进行10倍梯度稀释至IO5倍，分 别采用常规RT-PCR和实施例1中的RT-LAMP进行扩增检测，常规RT-PCR得到469bp的特 异性扩增片段，电泳结果如图4所示，总RNA稀释到IO 3倍时常规RT-PCR无法进行检测。 RT-LAMP检测结果如图5所示，当总RNA稀释到IO3倍时RT-LAMP仍可检测出CYVCV，由此 可见RT-LAMP检测的灵敏度是常规RT-PCR的10倍。柑桔黄脉病毒的常规RT-PCR所用引 物为：上游引物：5' -AAACCTAATCGGTCCTGTG-3' ；下游引物：5' -GAGACACCCTACTTCAGCG-3'。
【权利要求】
1. 一种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP引物组，其特征在于：由外引物对F3、B3和内引物对 FIP、BIP 组成： 外引物对： F3 ：5, -TCCGGGGTAGACGAGAAC-3,； B3 :5' -AGGTCCGTGCCATTTCCT-3' ； 内引物对： FIP :5' -CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG-3' ； BIP :5' -AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG-3'。
2. -种柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：是以待测样品总RNA为模板， 应用权利要求1所述的外引物对和内引物对在60?63°C恒温反应条件下，进行环介导恒温 扩增反应70?lOOmin，扩增完成后80°C再反应5?lOmin，然后利用琼脂糖凝胶电泳或荧 光染料染色，鉴定植株样品是否感染柑桔黄脉病毒。
3. 根据权利要求2所述的柑桔黄脉病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于：扩增反应 体系为：总体积25iiL的反应体系含有18iiL反应液A、5iiL引物液B、浓度为20?100ng/ U L 的总 RNA2ii L ;其中 18ii L 反应液 A 含有：2. LlOXBst buffer、3ii L25mM 的 MgCl2、 2 ii L4mM 的 Betaine、2 ii LlOmM 的 dNTPs、0. 5 ii L40U/ ii L 的 RNA 酶抑制剂、1 ii L8U/ ii L 的 Bst聚合酶、1 ii L10U/ ii L的AMV逆转录酶、6 ii L水；所述5 ii L引物液B包括2 ii L20 ii M的 FIP、2 ii L20 ii M 的 BIP、0. 5 ii L10 ii M 的 F3、0. 5 ii L10 ii M 的 B3。
4. 含有权利要求1所述引物组的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒。
5. 根据权利要求4所述的柑桔黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有进 行RT-LAMP扩增所需要的Bst buffer、MgCl2、Betaine、dNTPs、RNA酶抑制剂、Bst聚合酶和 AMV逆转录酶。
【文档编号】C12Q1/68GK104328220SQ201410620927
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】刘科宏, 周常勇, 李中安, 陈洪明, 周彦 申请人:西南大学柑桔研究所