专利名称：一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针。
背景技术：
圆环病毒为无囊膜、二十面体对称的动物病毒，其结构简单，复制需要依赖于旺盛 的宿主细胞活力，增殖速度快的淋巴细胞是圆环病毒侵染的主要宿主。因此，圆环病毒感染 往往导致机体免疫混乱、免疫力下降，进而引起多种条件性病原的二次感染。它主要侵害免 疫系统，会引起病毒诱导性淋巴组织损伤类似，使动物机体易遭受其它病原并发和继发感
^fe ο鹅圆环病毒(GoCV)最早于1999年由德国学者Soike等从患病鹅病理组织中观察 到。病鹅主要表现发育不良、体重下降、羽毛凌乱等，病理组织学检查发现法氏囊、脾脏和胸 腺的淋巴细胞减少，其中法氏囊病变最明显，甚至出现整个囊结构的破坏，并可观察到嗜碱 性的包涵体。到目前为止，圆环病毒属除PCV (PCV1和PCV2)可以在PK-15细胞中繁殖外，其余 成员均尚未能在细胞中培养成功，大大限制了对其进行深入研究，因而病原诊断方法相对 较少。已建立的诊断方法有电镜法、核酸探针技术、聚合酶链式反应法等。荧光PCR是在普 通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光 探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度 高、定量准确、适用性广等优点。目前，国内外还没有针对鹅圆环病毒检测的荧光定量PCR 方法，但该属其他类型病毒如猪圆环病毒和鸽圆环病毒均已经有相应的荧光定量PCR检测 方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测鹅圆环病毒的弓丨物和探针。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案 用于检测鹅圆环病毒的引物和探针包括
1、一种用于检测鹅圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下 PCR 上游引物5，-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG -3，， PCR 下游引物5，-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG -3，。2、一种用于检测鹅圆环病毒的探针，其特征在于，所述探针序列为 5' -ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3，。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷 酸。利用本发明的引物和探针可用于对鹅圆环病毒的相应基因进行检测，尤其适用于 基于荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立一套可用于 检测鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法。
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具体操作方法如下
1、引物和探针设计参考GenBank中的鹅圆环病毒的全基因核苷酸序列，利用 Lasergene ν 7.1 DNAStar软件进行同源性分析比较，利用01igo6. 0软件，设计引物和探 针，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧 光淬灭基团为Eclipse，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。2、反应体系的优化优化出的20 μ L最佳反应体系为SYBR Premix Ex Taq 10 μ L、上、下游引物(10 ymol/L)各 0.2 μ L、荧光探针(10 μ mol/L)0. 4 μ L、模板 2 μ L、水 补足至20 UL0最佳反应条件为95 °C, 2 min预变性；95 °C，15 s，65 V, 20 s，共40个 循环。3、阳性标准品的制备以提取的鹅圆环病毒DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩 增，将扩增的产物回收、纯化，连接到PMD18-T载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品。4、标准曲线的建立以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值 为纵坐标建立标准曲线，判定阳性的标准。该方法可用于鹅圆环病毒的流行病学检测，为疾病的早期预防控制奠定技术基 础。同时，该方法的建立为研究该病原的复制动力学提供检测平台。本发明的有益效果
本发明根据GenBank登录的所有鹅圆环病毒全基因序列，设计引物和探针，于国内外 首先建立鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测453copies，特异 性强，重复性好。
图1鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的扩增曲线； 图2为鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的标准曲线。
具体实施例方式实施例1鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法的建立 一、材料
鹅圆环病毒(GenBank登录号GU320569)
GPV, APMV-UGRV病毒保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。二、步骤
1、仪器与试剂Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪，购自印pendorf■公 司；PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)购自宝生物工程(大连)有限公司、 PrimeScript RT reagent Kit、pMD18_T 载体、DL2000 Marker 均购自宝生物工程(大连) 有限公司；胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自Omega Bio-Tek ；GoTaq Master Green Mix购自Promega ；荧光定量PCR管购自Axygen。2.引物和探针的特异性
引物和探针的特异性是本实验所建立方法的最重要因素。根据GenBank登录所有鹅圆 环病毒全基因序列，通过比对分析，设计引物和探针。3、阳性标准品的制备以常规方法提取鹅圆环病毒基因组DNA。用所设计的特异性引物(上游 5，-GGCAGGATGTGGTTGTGATGG-3，；下游5，-TCAGGAATCCCTGCA GGTGA-3，，扩增片段大小约 1400 nt，进行 PCR扩增后，扩增体系为 50μ L，其中 2XGoTaq Master Green Mix 25yL、上 下游引物(20yM/mL)各lyL、cDNAlyL、灭菌去离子水22 μ L。反应条件为94°C预变性 5min，随后进行94°C 50s、54°C 35s、72°C 2min循环30个循环后，72°C延伸lOmin。反应 结束后，取PCR产物5 μ L，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后 与pMDIS-T载体连接，转化DH5 α感受态细胞，用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒。阳性重 组质粒进行序列测定。测序结果表明，阳性重组质粒符合预期，即做为阳性标准品。4.反应条件的优化
采用 20 μL反应体系[PremixExTaq2X) 10 μ L，PCR上游引物(10 μ mol/L)0. 2 μ L， PCR下游引物(10 μ mol/L) 0. 2 μ L,荧光探针(10 μ mol/L) 0. 4 μ L，倍比稀释后的阳性标准 品2 μ L，补水至终体积20 μ L，以出现最高的荧光值(Δ Rn)、最小的Ct值以及在熔解曲线 分析中不出现非特异性峰为指标，分别对退火温度(55 68°C)和引物浓度(0. 2 1. 0 μ mol/L)进行优化。5、建立的标准曲线
用紫外分光光度计测定阳性标准品260 nm处光吸收值(A260)，计算DNA拷贝数，随后 将阳性标准品进行连续10倍系列稀释(KT1 10_7)，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为 横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，荧光定量PCR方法对鹅圆环病毒的最 低检测限为453拷贝数/反应，并且CT与拷贝数在4. 53X IO2 4. 53X IO7拷贝/反应范 围内有很好的线性关系，相关系数为0. 993，扩增效率为106%。扩增曲线见图1，标准曲线见 图2。6特异性检测
6. 1特异性检测
用优化的条件分别检测GPV、APMV-I、GRV病毒核酸样品，进行检测，对其特异性进行评 价。结果检测均为阴性，荧光定量PCR产物也未见条带。6. 2可重复性及再现性评估
对同一阳性标准品设4个重复管，用实时荧光定量RT-PCR进行检测，评价其重复性， 计算组内变异系数；将阳性标准品置于一 20°C冰箱保存，分别于第7、14、21d重检，评价其 再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.56% 1.68%，组间变异系数为 0. 91% 2. 53%，可重复性好。
权利要求
一种用于检测鹅圆环病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下上游引物5’ AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG 3’，下游引物5’ GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG 3’。
2.一种用于检测鹅圆环病毒的探针，其特征在于，所述探针序列为 5' -ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3，。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针，所述引物序列为上游引物5’-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG-3’，下游引物5’-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG-3’，所述探针序列为5’-ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3’。本发明根据GenBank登录的所有鹅圆环病毒全基因序列，设计引物和探针，于国内外首先建立鹅圆环病毒的荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测453copies，特异性强，重复性好。
文档编号C12N15/11GK101942528SQ20101051289
公开日2011年1月12日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者万春和, 傅光华, 施少华, 林建生, 林芳, 程龙飞, 陈红梅, 黄瑜 申请人:福建省农业科学院畜牧兽医研究所