上皮干细胞的液体培养的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉参考
[0002] 本申请要求2013年2月25日提交的美国专利申请号61/769, 076的优先权，该美 国专利申请W其整体引入作为参考。
技术领域
[0003] 本文提供在细胞培养基中培养上皮干细胞和含有上皮干细胞的组织碎片（tissue fragment)的方法。
【背景技术】
[0004] 小肠上皮每2至5天更新，使它成为再生性最强的哺乳动物组织之一。已基于 定位和循环动态描述了小肠中的两类干细胞。参见例如Barker等，^^re449,1003 -1007 (2007) ;Sangiorgi,E.&Capecchi,M.R.化tureGenet.40,915 - 920 (2008); Li,L. &Clevers,H.Science327, 542 - 545 (2010)。快循环干细胞表达包括Lg巧、 Cdl33 (也称为Proml)和Sox9的标记，且存在于整个肠中。参见Zhu,L.等，化化re 457, 603 - 607 (2009) ;Rmiyama，K.等，化UireGenet. 43, ：34 - 41 (2011)。运些细长细 胞（也称为隐窝基底柱状细胞（CBC))3天内在隐窝和绒毛内繁殖，并散布在支持它们的 帕内特细胞间。参见Sato,T.等，化Uire469,415 - 418(2011) ;Cheng，H.化eblond，C. P.，Am.J.Anat. 141,537 - 561(1974)。WBmil或小鼠Ted(mTert)的富集表达为标记 的慢循环干细胞代表更稀少的细胞群体。参见Sangiorgi,E. &Capecchi,M.R.化化re Genet. 40, 915 - 920 (2008)。运些细胞从肠的近端区域至远端区域形成递减梯度，使得它们 在十二指肠中比在结肠中更普遍存在。尽管它们稀少，但表达Bmil的干细胞对隐窝维持至 关重要。
[0005] 已描述了用于培养包括肠上皮干细胞的原代上皮干细胞的多种培养系 统（Bjerknes和化eng,MethodsEnz;ymol419, 337-83(2006);及Sato等，Nature 459, 262-265(2009))。迄今为止，培养系统倚赖于用固体胞外基质来培养原代上皮干细胞。 之前的研究已表明，固体胞外基质对维持上皮干细胞的多能性和保持已从结肠或肠分离的 隐窝的基本隐窝-绒毛生理学是必要的（参见例如W02010/090513)。已显示用ECM培养 干细胞增强了干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。之前，在缺乏ECM的情况下， 干细胞培养基不能较长时期培养，且未观察到未分化干细胞的持续存在。此外，ECM的存 在允许培养在缺乏ECM的情况下不能培养的S维组织类器官（organoid)。但是，由于该培 养系统的固体性质，对可用该培养系统研究的测试和诊断化合物的类型存在大小限制（例 如，大分子不能扩散入固体基质）。此外，由于细胞和高级结构包埋在固体基质中，分析细胞 和高级结构的容易程度降低（例如，必须从固体基质剖出高级结构（例如类器官）进行分 析）。需要更好的上皮干细胞（尤其是肠上皮干细胞）培养系统，该培养系统保持上皮干细 胞的生理学结构，维持上皮干细胞的多能性，并保持类器官的基本生理学，同时增加测试和 诊断化合物的类型及分析的容易程度。
[0006] 发明概述
[0007] 本文提供用于液体培养干细胞的方法。具体而言，本文提供用于液体培养（a)上 皮干细胞和/或化）分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，该方法包括在液体细 胞培养基（liquidcellculture)中解育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞 培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入（i)骨形态发生蛋 白度MP)抑制剂、扣）促细胞分裂生长因子、（iii)Wnt激动剂和（iv)至少约4%w/v的胞 外基质巧CM)。此外，本文提供用于获得和/或培养隐窝的方法，该方法包括在液体细胞培 养基中解育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人 细胞的基础培养基，向该基础培养基加入（i)骨形态发生蛋白度M巧抑制剂、（ii)促细胞 分裂生长因子、（iU)Wnt激动剂和（iv)至少约4%w/v的胞外基质巧CM)。
[0008] 在任意方法的一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白、DAN和/或DAN样蛋白， 包括Cerberus和Gremlin。在一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白。在一些实施方案 中，该BMP抑制剂在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间（例如约50至 约lOOng/mL)。
[0009] 在任意方法的一些实施方案中，该Wnt激动剂是Wnt、R-spondin(RSPO)、Norrin 和/或GSK抑制剂。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂是RSP01。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSP02。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂是RSP03。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSP04。在一些实施方案中，该Wnt 激动剂在该液体细胞培养基中的浓度在约50化g/mL和约5yg/ml之间（例如约500至约 1500ng/mL)〇
[0010] 在任意方法的一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是上皮生长因子巧GF)、转 化生长因子-a(TGF-a)、碱性成纤维细胞生长因子化FGF)、脑衍生神经营养因子度DNF) 和角质形成细胞生长因子（KGF)。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是EGF。在一 些实施方案中，该促细胞分裂生长因子在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约50化g/ml 之间（例如约5至约50ng/mL)。
[0011] 在任意方法的一些实施方案中，该ECM是低生长因子ECM(g;rowthfactorrecced ECM)。在一些实施方案中，该ECM是基质胶。在一些实施方案中，该ECM在该液体细胞培养 基中的浓度在约4%至约10%w/v之间。在任意方法的一些实施方案中，该方法包括悬滴 培养。
[0012] 在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Rock巧ho激酶）抑制剂。
[0013] 在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Notch激动剂。
[0014] 在任意方法的一些实施方案中，该上皮干细胞和/或上皮组织碎片是胃肠干细胞 和/或胃肠组织碎片。在一些实施方案中，该胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片是小肠干细 胞和/或小肠组织碎片。
[0015] 本文还提供可通过本文所述的方法获得的隐窝及该隐窝在药物发现筛选、毒性测 定中或在再生医学中的用途。
[0016] 附图简述
[0017]图1A-B. (A)源自小鼠的类器官在隐窝样结构中显示膜GFP化胖5阳性 干细胞）和溶菌酶染色（帕内特细胞，箭头）。度）光学横截面。 阳01引图2A-D.在存在度、B-1、D)或缺乏（A、A-1、C)白喉毒素值T)的情况下培养源自Lgr5°?wp小鼠的类器官10天。隐窝样结构和溶菌酶阳性细胞保持在DT处理的类器官中 度、B-1)。类器官在DT的存在下持续增殖值）。
[0019] 图3A-D.在多种浓度的基质胶中培养源自Lgr5°?wp小鼠的类器官。
[0020] 发明详述 阳〇2U I.定义
[0022] 术语"多肤"在本文中指天然序列多肤、多肤变体及天然序列多肤和多肤变体（其 在本文中进一步定义）的片段。本文所述的多肤可W是分离自多种来源（如分离自人组织 类型或分离自另一来源）或通过重组方法或合成方法制备的多肤。
[0023] "天然序列多肤"包含与源自自然界的相应多肤具有相同的氨基酸序列的多肤。
[0024] "多肤变体"或其变形意指本文定义的多肤，通常为活性多肤，其与本文公开的任 意天然序列多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性。运类多肤变体包括，例如，其中 在天然氨基酸序列的N-或C-端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基的多肤。通常，多肤 变体将与本文公开的天然序列多肤序列具有至少约80%氨基酸序列同一性，备选地，至少 约 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性。通常，变体多肤长度为至少约10个氨基酸，备 选地，长度为至少约 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、 570、580、590、600个氨基酸，或更长。可选地，与天然多肤序列相比，变体多肤将具有不超过 一个保守氨基酸取代，备选地，与天然多肤序列相比不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守 氨基酸取代。
[00巧]"分离的"指已从其天然环境的成分分开的多肤、抗体、核酸等。在抗体的一些实施 方案中，将抗体纯化至通过例如电泳（例如SDS-PAGE、等电聚焦（IEF)、毛细管电泳）或层 析（例如离子交换或反向册LC)测定的纯度大于95%或99%。用于评估抗体纯度的方法 的综述参见例如Flatman等，J.C虹omatogr.B848:79-87 (2007)。
[00%] 术语"抗体"在本文中W最广泛的含义使用，涵盖多种抗体结构，包括但不限于单 克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们显示希 望的抗原结合活性。
[0027] 就参考多肤序列而言的"百分比（％ )氨基酸序列同一性"定义为在比对序列并在 必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部 分之后，候选序列中与参考多肤序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可 本领域技术之内的多种方式来达到W测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对，例如， 使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megali即值NASTAR)软件。本领域 技术人员可W确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达到最大比对 所需的任意算法。但是，为了本文的目的，用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸 序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，源代码已随用户文 件提交美国版权办公室，WashingtonD.C.，20559,它在美国版权办公室注册在美国版权注 册号TX呪 10087 之下。ALIGN-2 程序从Genentech,Inc. ,SouthSanRrancisco,化lifornia 公开可得，或者可W从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上，包括数字UNIXV4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。
[0028] 在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下，按W下计算给定氨基酸序列A 与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性（其可W备选地叙述为，具有或包含与给定氨 基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A):
[0029] 100 乘W分数X/Y
[0030] 其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相