生物液体中的稀有细胞的检测、分离和分析的制作方法

生物液体中的稀有细胞的检测、分离和分析的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用与稀有细胞的细胞表面抗原结合的抗体从哺乳动物的生物液体中分离或富集稀有细胞的方法。将固定化抗体与包含稀有细胞以及多种其他细胞的生物液体一起温育，以便形成抗体-稀有细胞复合体。可通过各种物理、化学和基因技术的任意一种对该复合体进行检测或分离并随后进行分析。DSMACC 26662004.07.13
【专利说明】生物液体中的稀有细胞的检测、分离和分析

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于从生物液体中检测、捕获和分离稀有细胞以对其抗原性、表型和 遗传特性进行分析的免疫学方法和试剂盒。具体而言，本发明提供了用于对母体血液中的 胎儿单核红细胞（NRBC)进行检测、捕获、分离和分析的方法。

【背景技术】
[0002] 进行产前诊断以检测胎儿的可能存在的染色体和基因异常使得父母和看护者能 够开始监控疾病或病症的倾向早期治疗。已经建立了产前诊断的实践，以检测胎儿可能存 在的染色体和基因异常，因而使父母和照顾者能够作出知情决定。在多种与生命相容的染 色体异常中（非整倍体21、18、13、X、Y) (1)，由于存在全部或部分的21号染色体多余拷贝 所导致的唐氏综合症（DS)，是最常见的引起智力迟缓的遗传原因以及妇女寻求产前诊断的 主要原因（1，2)。尽管通过对由绒毛膜绒毛取样（3)、羊水穿刺（3,4)或脐带取样（5)获得 的胎儿组织进行核型分析从而确切检测到染色体异常和单基因病是可能的，但是这些方法 是高度侵入性的，需要有技术的专业人员，并且有高风险的流产（高至1% )和/或孕妇并 发症（3-5)的倾向。约1%的活胎出生、2%的35周岁以上孕妇以及约50%的自发性妊娠 早期流产中会出现细胞基因紊乱￠)。在一百万个活胎出生的人群中，单基因缺陷的发生率 约为 0· 36% (7)。
[0003] 为了最小化例如DS等疾病中的风险，将这些侵入性但是确切的的检测提供给通 过一系列筛查标准而被鉴定为具有胎儿染色体异常最高风险的妇女。该组通常包括生产年 龄在35岁以上并且在妊娠一期和二期所进行的胎儿超声检查和母体血清标记物筛查测试 中出现异常应答的孕妇（8)。优选的妊娠一期的筛查，包括对血清中的PAPP-A (妊娠相关血 浆蛋白A)、游离β-hCG(游离β -人绒毛膜促性腺激素）进行定量，以及颈项透明层的超 声检查，具有约90%的DS检出率，但是代价是具有显著意义的5%假阳性率（8)。对一期 筛查研究进行的最近汇总分析得出结论，在实践中所能达到的灵敏度可能会显著低于（约 80-84%)所报道的灵敏度。这种表现不佳的问题，特别是考虑到5%的筛查阳性率，总是 会导致高比率的不必要且昂贵的侵入性验证测试，并因此增加妊娠发展的风险。
[0004] 明显的局限性是用于寻找替代策略的主要的社会、科学和经济动机。后者由 于DS发生率的上升而被强化，主要是由于怀孕时母体年龄增加的趋势，而出生率并没有 相对等的增加（10)。美国妇产科医师学会（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)近期提出了指导原则，建议其成员对所有预期中的母亲进行基因异 常的检测（11)，这进一步暗示了对于可安全地对胎儿基因状况进行特异性诊断的非侵入性 技术的需求未得到满足。因此，非侵入性产前诊断的开发已经成为现代医学中最具进取性 争议的领域之一（12)。预期候选策略会包含现有侵入性方法的所有优点，以使得能将它们 能够作为单独运行的非侵入性诊断测试或被用作高精度的验证测试以对当前筛查实践中 的大量假阳性进行分析（13)。此外，这种新的测试策略应当另外解决了分析、制造和操作中 的复杂性，使得该新的方法提供了可靠、简便和经济有效的替代性方案。
[0005] 几十年来，对于非侵入性替代方案的探索集中在对正常情况下可穿过胎盘屏障进 入母体循环系统中的胎儿基因材料的分离、鉴定以及随后的分析之上。自从1893年关于 胎儿细胞检测的首创性报道（14)以及稍晚一些的关于母体血液中胎儿无细胞DNA(15)和 RNA(16)检测的报道以来，有两种基于对胎儿细胞或无细胞胎儿基因材料进行分析的有前 途的方法受到了极大的关注。与无细胞的胎儿DNA或RNA相比，完整的胎儿细胞可以提供 获取对于检测染色体异常来说重要的完整胎儿基因材料以及对胎儿基因状况进行更全面 评估（17)。由于在伴随有染色体异常的母体中或在诸如先兆子痫等的疾病中胎儿细胞数目 相对增加（18)，可靠的分离方法可能会基于胎儿细胞计数和/或细胞检测信号定量而使其 适合于新型非侵入性诊断方法的开发。
[0006] 很多显著的挑战会阻碍开发可靠的胎儿细胞分离方法。据报道的每毫升母体血液 大概一至两个细胞的罕见事件发生率对于可再现分离具有足够纯度和产量的胎儿细胞而 言，已经被认为是难以逾越的障碍（18)。因此，一种成功的细胞分离策略会需要优异的效 率、灵敏度和特异性。由于迄今为止已经通过易于导致低产率和细胞损失的低效多步骤技 术获得了所报道的数目，进入母体血液循环的胎儿细胞的数量可能要显著高于原先人们所 相信的那样。在各种候选胎儿细胞（19)(滋养层细胞、淋巴细胞、有核红细胞以及造血干 细胞）中，有核红细胞（NRBC)，也被称为成红细胞（erythroblasts)，具有大部分所需要的 特征。胎儿NRBC具有有限的寿命和增殖能力，是单核的，携带胎儿染色体的代表性补充物 (complement),并始终存在于母体血液之中（17-20)。然而,对于胎儿成红细胞生成的研究 已经鉴定出了两个不同的过程，开始发生于卵黄囊中（原始成红细胞生成，产生原始成红 细胞）以及随后发生于胎儿肝脏和骨髓中（产生定型成红细胞）（17)。原始和定型成红细 胞两者在母体循环系统中都已经被检测到，但是它们出现的确切时间、其相对数目以及在 整个孕期的分布情况还没有被清楚地定义。然而，虽然原始成红细胞是妊娠一期占据优势 地位的细胞类型，但它们会逐渐被能够持续至整个期间的定型类所代替（17,20)。
[0007] 原始成红细胞具有不同的形态学特征，即胞质与细胞核的比例高，尺寸相对较大， 并且含有被称为ε-球蛋白的胚胎型血球蛋白（17,20)。综合以上，上述的特征和各种细 胞表面标记物（如分化簇标记物（⑶34、⑶35、⑶36、⑶45、⑶47、⑶71)，血型糖蛋白-A和 i_抗原）差异表达的知识（17, 20, 21)已经将原始成红细胞确定为理想的妊娠一期靶标。
[0008] 胎儿血液中的ε -阳性成红细胞从第7周开始线性地降低，在妊娠约14周时 数量可忽略不计（22)。另一方面，近期的报道表明定型成红细胞在进入血液循环之前去 核（17)，如果该报道被证实，则妊娠一期原始成红细胞将依然是唯一有用的靶标。据报道 ε -球蛋白是高度特异性的原始胎儿成红细胞鉴定标识（20, 22)。
[0009] 当前对于非侵入性产前诊断的方法是基于利用靶细胞的物理、结构、形态和抗原 性属性，到目前为止已利用了三个独立步骤的步骤（22,23)。这些步骤是（1)，为了从母体 血液中富集胎儿细胞而设计的技术的开发；（2)，从所富集细胞的异源混合物中鉴定出胎儿 细胞；以及（3)，在对靶标进行显微操作之前和/或之后通过染色体荧光原位杂交（FISH)、 各种PCR技术和/或基因测序来对所鉴定的细胞进行基因分析（17,21-23)。为了使目前这 种复杂性、低效性和不一致性最小化，也已经考虑到了将胎儿细胞的鉴定步骤与基于分子 遗传学的诊断组合的方法（22)。
[0010] 近期的综述认为，目前胎儿细胞分离策略的不足之处是限制可靠的非侵入性产前 诊断方法开发的主要因素（18)。目前，研究最多的胎儿细胞富集方法包括选择性红细胞裂 解、密度梯度离心、电流分离、荧光激活细胞分选（FACS)以及磁激活细胞分选（MACS)的多 步骤组合（18, 23)。更加新型的替代性方法包括更加复杂的方法，其基于将微电子机械系 统（MEMS)和/或目前一些细胞富集方法的自动化操作与所鉴定细胞的形态差异、免疫表型 分型和/或显微操作的组合（18, 24-28)。
[0011] 现在明显，简单、灵敏和特异的能够实现高效性和一致性的胎儿分离技术是用于 实际用途的非侵入性产前测试成功开发的首要事件。尽管用于精确地检测基因和染色体异 常的下游技术（FISH、PCR和基因测序）是可用的，但后者仍然没有得到实现这一事实反映 了目前可利用的细胞分离方法还有显著不足（17，18,21，23)。
[0012] 仍然存在对于一种新型的、简单、快速和可靠的胎儿NRBC分离技术的迫切需求， 以克服这种广为人知的难以逾越的障碍（17,18, 20-28)。理想地，解决对检测、分离和分析 胎儿NRBC的这些需求的试剂盒应该低成本地制造很，同时保持高的分离灵敏度、特异性和 一致性。
[0013] 本发明提供了这样一种新型的、简单、快速和可靠的胎儿NRBC分离试剂盒，其基 于一种克服了这些障碍的技术。该试剂盒可以经济有效地制造，同时保持高的分离灵敏度、 特异性和一致性。


【发明内容】

[0014] 本发明满足了未被满足的对于提供用于检测、富集和分离生物液体中稀有细胞的 方法的可靠技术及相关方法的迫切需求。本发明进一步了提供了一种作为独立试剂盒的组 成部分而行使功能的系统及相关的方法，所述试剂盒用于胎儿NRBC的分离、鉴定及随后对 特异性的胎儿基因异常进行分析或测试任意一组胎儿基因异常或诊断目标的其他基因型 的存在。本发明还解决了在目前面临类似的检测和分析局限性问题的其他领域（例如循环 干细胞和肿瘤细胞）中对于可靠的稀有细胞分离方法未被满足的需求。
[0015] 本发明提供了从哺乳动物生物液体中富集和/或分离稀有细胞的方法；该方法包 括：（i)提供固定在基质上的抗体，所述基质例如大平板（large plate)、陪替氏培养皿、 孔、微孔、载玻片、条、杆、珠或微阵列板或载玻片，其中所述抗体结合稀有细胞的细胞表面 抗原；（ii)使固定化的抗体与生物液体样品接触，其中所述液体中含有稀有细胞和多种其 他细胞；（iii)将固定化的抗体与体液样品在适合于抗体与稀有细胞的细胞表面抗原结合 的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体；以及（iv)洗涤抗体-稀有细胞复合体以除 去未结合的细胞并提供固定化的抗体-稀有细胞复合体。
[0016] 本发明还提供了对生物液体中的稀有细胞进行检测的方法；该方法包括：（i)提 供固定在基质上的第一抗体，其中所述第一抗体结合稀有细胞的第一细胞表面抗原；（ii) 使固定化的第一抗体与生物液体样品接触，其中体液含有稀有细胞和多种其他细胞；（iii) 将固定化的第一抗体与体液样品在适合于第一抗体与稀有细胞的第一细胞表面抗原结合 的条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞复合体；（iv)洗涤第一抗体-稀有细胞复合体， 以除去未结合的细胞并提供分离的第一抗体-稀有细胞复合体；(V)将第一抗体-稀有细 胞复合体与结合稀有细胞的第二细胞表面抗原的第二抗体在适合于第二抗体与第二细胞 表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞-第二抗体复合体；以及（Vi)检 测第一抗体-稀有细胞-第二抗体复合体中的第二抗体，从而检测体液样品中稀有细胞的 存在。
[0017] 本发明进一步提供了对生物液体中的稀有细胞进行检测的方法；该方法包括： (i) 提供固定在基质上的第一抗体，其中第一抗体结合稀有细胞的第一细胞表面抗体； (ii) 使固定化的第一抗体与生物液体样品接触，其中体液含有稀有细胞和多种其他细胞； (iii) 将固定化的第一抗体与体液样品在适合于抗体与稀有细胞的细胞表面抗原结合的 条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞复合体以及多种未结合的细胞；（iv)洗涤第一抗 体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞；(V)裂解第一抗体-稀有细胞复合体的稀有细 胞，以形成含有稀有细胞特异性核酸序列的裂解物，并将裂解的细胞和与稀有细胞特异性 核酸序列互补的核酸探针在适合于核酸探针与稀有细胞特异性核酸序列杂交的条件下温 育，以形成双链复合体；以及（Vi)检测该双链复合体，从而检测体液样品中稀有细胞的存 在。
[0018] 本发明还提供了用于检测和分离生物液体中的稀有细胞（例如母体血液中的胎 儿细胞）的试剂盒；所述试剂盒包括固定在基质上的抗体，其中所述抗体对于稀有细胞的 细胞表面抗原是特异性的；以及适合于抗原抗体结合的缓冲溶液。
[0019] 本发明提供了估算每单位哺乳动物生物液体中稀有细胞数量的方法；该方法包 括：（i)提供固定在基质上的抗体，其中所述抗体结合稀有细胞的细胞表面抗原相；（ii)使 固定化的抗体与已知单位的生物液体样品接触，其中体液含有多种稀有细胞和多种其他细 胞；（iii)将固定化的抗体与所述单位的体液样品在适合于抗体与稀有细胞的细胞表面抗 原结合的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体；（iv)洗涤该抗体-稀有细胞复合体， 以除去未结合的细胞并提供固定化的抗体-稀有细胞复合体；以及（V)确定样品中固定化 的抗体-稀有细胞复合体的数量，从而估算每单位液体样品中稀有细胞的数量。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1 :显示了生物素化的4B9抗体的对比性结合动力学。将浓度增加的生物素化 4B9抗体与链亲和素包被的磁性颗粒（来自于Invitrogen生物素结合剂，CELLECTIN和 FlowComp试剂盒）、右旋糖苷包被的纳米颗粒（由StemCell technologies EasySep人生 物素阳性细胞筛选试剂盒提供）以及链亲和素包被的微孔（Microwell-SA)在相同条件下 温育30分钟。洗涤之后，利用HRPO标记的山羊抗-小鼠 IgM抗体检测已结合的4B9并通 过比色法定量。
[0021] 图2:显示了从母体血液中分离的ε-阳性胎儿细胞的图像。经分离的细胞被固 定、透化并使用AMCA-标记的小鼠抗-人ε-球蛋白抗体进行探测。通过在亮视野（BF) 下显微观察、检测ε -球蛋白阳性响应的荧光视野以及合成的合并图像来获得代表性的图 像。
[0022] 图3:显示了从母体血液中分离的ε-阳性胎儿细胞的图像。经分离的细胞被固 定、透化并使用AMCA-标记的小鼠抗-人ε-球蛋白抗体进行探测。通过在亮视野（BF)下 显微观察、检测ε -球蛋白阳性响应的荧光视野，以及合成的合并图像来获得代表性的图 像。
[0023] 图4:显示了从母体血液中分离的ε-阳性胎儿细胞的图像。经分离的细胞被固 定、透化并使用AMCA-标记的小鼠抗-人ε -球蛋白抗体进行探测。随后利用TO-PRO对细 胞进行复染色。通过在亮视野（BF)下显微观察、显示细胞核和ε-球蛋白阳性响应的荧光 视野以及合成的合并图像来获得代表性的图像。
[0024] 图5:显示了从男性妊娠中分离的胎儿NRBC的FISH图像。使用4Β9(0)_涂覆的 载玻片从确认怀孕30周男性妊娠的母体血液（5mL)中分离胎儿NRBC。探测经分离细胞的 Y染色体（红色）（在左栏中微弱地显示）和X染色体（绿色），也显示了合成的合并图像。
[0025] 图6 :为图5中所显示FISH图像的放大合成图像。Y染色体（红色）点的微弱的 位于左下中心，X-染色体（绿色）点位于右上中心。
[0026] 图7 :显示了利用各种抗体对捕获的细胞进行夹心式检测的图：通过与不同的检 测抗体一起温育来检测4B9-捕获的细胞。随后针对ε-球蛋白对分离的细胞进行染色并 在显微镜下进行分析。
[0027] 图8 :显示了从母体血液中分离的胎儿细胞的Y染色体扩增。将从6名不同患者 的IOmL母体血液中分离的胎儿细胞放置于涂覆有4Β9抗体的两个6cm平板或一个IOcm平 板上。收获细胞，并利用两个Y染色体特异性探针通过实时PCR分析DNA。男性对照DNA用 作阳性对照。数值表示循环阈值的平均值土标准差（η = 3/样品）。女性阴性对照DNA没 有扩增（数据未显示）。
[0028] 循环胎儿细胞是胎儿基因材料的全部来源。然而，仍然存在从母体血液中可靠和 连续地分离并具备高度灵敏度和特异性的迫切需求。

【具体实施方式】
[0029] 本发明提供了双位点"夹心式"稀有细胞分离技术、方法和平台，包括一种或多种 细胞捕获抗体与一种或多种用于细胞检测/鉴定的抗体的成对组合。在某些实施方式中， 本发明的夹心式细胞分离和分析技术利用了特异性捕获与非特异性检测的组合、非特异性 捕获与特异性检测的组合，或本领域技术人员可直接意识到的其它任意合适的组合。这种 新型、高效和可靠的技术能够容易地被配置成独立的手动稀有细胞分离和分析试剂盒或改 装成与常规实验室应用相兼容的自动化设备。因此，在一个实施方式中，本发明为捕获、分 离和检测（及鉴定）母体血液中胎儿有核红细胞（NRBC)的无缝单步骤方法提供了一种 简单、快速、可靠以及经济有效的技术，并提供了非侵入性产前诊断在胎儿基因异常中的应 用。
[0030] 在一个实施方式中，本发明提供了从哺乳动物的生物液体（例如血液、血浆、羊 水、尿液或来自绒毛膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液）中分离或富集稀有细胞 的方法；该方法包括：（i)提供固定在基质上的抗体，所述基质可以是任意合适的基质，例 如玻璃或塑料表面，其可以是颗粒、珠（所述颗粒和珠可以是含有金属的颗粒或珠子；或磁 性颗粒或磁珠）、平板、陪替氏培养皿、孔、微孔、载玻片、条或杆的表面；其中抗体结合稀有 细胞的细胞表面抗原，抗体对于细胞表面抗原是选择性或特异性的；稀有细胞可以是任意 的稀有细胞，例如母体血液样品中的胎儿细胞，稀有细胞抗原可以是任意稀有细胞抗原，例 如胎儿细胞上的人胎儿有核RBC抗原的特异性4B9抗体；（ii)使固定化的抗体与生物液体 样品接触，其中体液包含稀有细胞和多种其他细胞；（iii)将固定化抗体与体液样品在适 合于抗体和稀有细胞的细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体； 以及（iv)洗涤抗体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞并提供固定化的抗体-稀有细 胞复合体。
[0031] 在另一个的实施方式中，本发明提供了对生物液体（例如血液、血浆、羊水、尿液 或来自绒毛膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液）中的稀有细胞进行检测方法； 其中该方法包括：（i)提供固定在基质上的第一抗体，其中第一抗体特异性地或选择性地 结合稀有细胞的第一细胞表面抗原；（ii)使固定化的第一抗体与生物液体样品接触，其中 体液含有稀有细胞和多种其他细胞；（iii)将固定化的第一抗体与体液样品在适合于第一 抗体与稀有细胞的第一细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞复 合体；（iv)洗涤第一抗体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞并提供分离出的第一抗 体-稀有细胞复合体；(V)将第一抗体-稀有细胞复合体与结合稀有细胞中第二细胞表面 抗原的第二抗体在适合于第二抗体与第二细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗 体-稀有细胞-第二抗体复合体，并可选地洗涤第一抗体-稀有细胞-第二抗体复合体，以 除去未结合的第二抗体；其中第一抗体和第二抗体可以是不同的抗体，或者作为选择，第一 抗体和第二抗体可以是针对相同抗原的抗体或可以是相同的抗体；(vi)检测第一抗体-稀 有细胞-第二抗体复合体中的第二抗体（可利用任意合适的可检测标记，例如荧光标记、酶 标记、放射性同位素标记、化学反应交联剂或生物素标记对其进行可检测地标记），从而检 测体液样品中稀有细胞的存在。
[0032] 在一个实施方式中，第一抗体是抗体4B9。在另外的实施方式中，第二抗体是胎儿 细胞表面抗原特异性的；作为选择，第二抗体可以是对胎儿细胞表面抗原具有选择性的抗 体。在另外的实施方式中，第二抗体是胎儿ε-球蛋白、⑶36、⑶71或⑶47特异性的。在 另一个实施方式中，第二抗体是血型糖蛋白A或i-抗原特异性的。
[0033] 在另外的实施方式中，本发明提供了一种方法，其中通过将第一抗体-稀有细 胞-第二抗体复合体与特异性结合第二抗体的带有可检测标记的第三抗体（例如酶标记抗 体，如用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的抗体）在适合于抗体结合的条件下温育，以形 成第一抗体-稀有细胞-第二抗体-第三抗体复合体；洗涤抗体-稀有细胞-第二抗体-第 三抗体复合体；检测带有可检测标记的第三抗体；从而检测样品中的稀有细胞。
[0034] 在另一个实施方式中，本发明提供了对生物液体中的稀有细胞（例如胎儿细胞） 进行检测的方法，其可以是生物液体，例如人类或动物的血液、血浆、羊水、尿液、或来自绒 毛膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液，其中所述方法包括：（i)提供固定在基质上 的第一抗体，其中第一抗体与稀有细胞的第一细胞表面抗原结合；（ii)使固定化的第一抗 体与生物液体样品接触，其中体液含有稀有细胞和多种其他细胞；（iii)将固定化的第一 抗体与体液样品在适合于抗体与稀有细胞的细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成第一 抗体-稀有细胞复合体以及多种未结合的细胞；（iv)洗涤第一抗体-稀有细胞复合体，以 除去未结合的细胞；(V)裂解第一抗体-稀有细胞复合体中的稀有细胞，以形成含有稀有细 胞特异性核酸序列的裂解物，并将裂解的细胞和与稀有细胞特异性核酸序列互补的核酸探 针在适合于核酸探针与稀有细胞特异性核酸序列杂交的条件下温育，以形成双链复合体； 以及（vi)通过任意合适的方法检测该双链复合体，例如利用核酸探针的核酸杂交或者通 过荧光原位杂交（FISH)，从而检测体液样品中稀有细胞的存在。稀有细胞特异性核酸序列 可以是任意的稀有细胞特异性核酸序列，例如染色体异常特有的核酸序列。染色体异常可 以是任意的基因异常，例如单基因异常，如单核苷酸多态性（SNP)。在一个实施方式中，稀有 细胞特异性核酸序列是患癌倾向的特征。
[0035] 在另一个实施方式中，本发明提供了用于对生物液体中的稀有细胞（例如母体血 液样品中的胎儿细胞的细胞表面抗原）进行捕获、检测或分离的试剂盒，其中所述试剂盒 包括：（i)固定在基质（例如玻璃或塑料表面）上的第一抗体，其中所述抗体对稀有细胞的 细胞表面抗原具有特异性或选择性；以及（ii)适合于抗原抗体结合的缓冲溶液。在一个实 施方式中，试剂盒包括适合于与生物液体中的稀有细胞结合的抗体，其中所述生物液体是 血液、血浆、羊水、尿液或来自绒毛膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液。
[0036] 在一个实施方式中，稀有细胞是母体血液样品中的胎儿细胞，且所述胎儿细胞是 胎儿有核红细胞（NRBC)。在另一个实施方式中，第一抗体是4B9。在另一个实施方式中，试 剂盒进一步包括对稀有细胞的第二细胞表面抗原具有特异性或选择性的第二抗体，其中所 述第二抗体没有被固定。在一个实施方式中，第二抗体是抗体4B9。在另一个实施方式中， 第二抗体是⑶36或⑶71特异性抗体；或⑶36和⑶71特异性抗体的混合物。试剂盒也可 包括用于对细胞核进行染色的核酸特异性荧光染料。
[0037] 在另一个实施方式中，稀有细胞的细胞表面抗原是肿瘤细胞的细胞表面抗原，并 且第一抗体对肿瘤细胞特异性细胞表面抗原具有特异性，其中第一抗体可以是带有可检测 标记的抗体。在一个实施方式中，第二抗体是对CD36或CD71具有特异性的抗体；或对CD36 和CD71具有特异性的抗体的混合物；作为选择，第二抗体可以是对血型糖蛋白A或i-抗原 具有特异性的抗体；在另一个替代性方案中，第二抗体对CD36、CD71、CD47、血型糖蛋白A、 i_抗原或胎儿ε-球蛋白是特异性的。在一个实施方式中，试剂盒可以包括与稀有细胞的 基因互补的核酸探针，并且基质是适合于进行直接杂交分析（例如适合于对稀有细胞进行 荧光原位杂交（FISH)分析的核酸探针）使用的基质。
[0038] 在另一个实施方式中，本发明提供了估算每单位哺乳动物生物液体中稀有细胞数 量的方法，例如母体生物液体（例如血液）中的胎儿细胞，如胎儿有核红细胞（NRBC)，其中 所述方法包括：（i)提供固定在基质上的抗体，其中所述抗体结合稀有细胞的细胞表面抗 原；（ii)使固定化的抗体与已知单位的生物液体样品接触，其中体液含有多种稀有细胞和 多种其他细胞；（iii)将固定化的抗体与所述单位的体液样品在适合于抗体与稀有细胞的 细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体；（iv)洗涤该抗体-稀有 细胞复合体，以除去未结合的细胞，并提供固定化的抗体-稀有细胞复合体；以及（V)检测 样品中固定化的抗体-稀有细胞复合体的数量，从而估算每单位生物液体样品中稀有细胞 的数量。在一个实施方式中，利用细胞核特异性染色来检测固定化的抗体-稀有细胞复合 体。
[0039] 在一个实施方式中，生物液体是血液、血浆、羊水、尿液或来自绒毛膜绒毛取样 (CVS)活组织检查的细胞悬浮液。在另一个实施方式中，当每单位样品液体中的稀有细胞数 量超出正常范围时，该方法可用作疾病或病症的诊断或预兆，或者指示疾病或病症的临床 状况，例如胎儿遗传疾病或病状或孕妇的妊娠并发症，如先兆子痫。在另一个实施方式中， 疾病或病症是癌症。
[0040] 在本发明方法的一个实施方式中，将对在胎儿NRBC质膜上表达的表位具有特异 性的小鼠单克隆抗体（抗体4B9)涂布在大表面固体支持物上。在本发明的某些实施方式 中，固体支持物可以是胶体金属颗粒（例如胶体金颗粒）、磁性颗粒（例如含铁金属颗粒）、 磁板、磁套、磁棒、聚合物珠、医疗和机械微装置表面、医疗和机械微电子装置表面以及医疗 和机械微电子传感器表面。可使用用报告分子标记的4B9抗体来完成对被特异性捕获的胎 儿NRBC的检测和/或鉴定。作为选择，4B9或者一种或多种具有相似特异性的抗体可以与 针对已知或尚待发现的细胞表面和/或内部胎儿NRBC鉴定生物标记物的一种或多种抗体 进行任意可能的夹心式组合使用。例如，4B9或其它抗-胎儿NRBC抗体可以作为捕获或检 测抗体与一种或多种特异性或非特异性胎儿NRBC检测抗体组合使用。这种组合包括通过 带有适当标记的针对特异性（例如，胎儿ε -球蛋白）和/或非特异性（例如细胞表面糖血 型蛋白Α，和/或i-抗原）胎儿NRBC生物标记物的抗体来对4Β9-捕获的胎儿NRBC进行检 测。可能的胎儿NRBC捕获/检测抗体组合包括4B9/抗CD36、4B9/抗CD7U4B9/抗CD47、 抗 CD36/4B9、抗 CD71/4B9、抗 CD47/4B9、;抗 CD36/ 抗 CD47、抗 CD36/ 抗 CD71、抗 CD36/ 抗糖 血型蛋白A、抗CD36/抗i-抗原。胎儿NRBC的检测/区分还可包括细胞核染色并可扩大到 包括针对其它可容易获得的胎儿NRBC分化生物标记物的抗体的其它合适的夹心式组合。
[0041] 本发明提供了一种对生物来源中的目标循环稀有细胞（例如来自母体血液的循 环胎儿有核RBC)进行检测、分离和分析的单步骤、连续的和无缝的可靠方法。能够通过 本发明的方法从生物液体中分离的稀有细胞的其它示例包括能够从获自绒毛膜绒毛取样 (CVS)的活组织检查样品的细胞悬浮液中分离得到的细胞滋养层细胞、由羊水穿刺获得的 羊水中的羊水细胞以及尿液样品中的白细胞，例如来自于患有疾病或病症如尿道感染的患 者。
[0042] 如本文所使用的，稀有细胞是具有在其所处细胞群体的大多数细胞中都不存在的 至少一种特征性细胞抗原的细胞。作为选择，稀有细胞可具有与其所处细胞群体中的大多 数细胞的同源抗原不同的特征性的抗原。例如，稀有细胞的特征性细胞抗原可以是细胞表 面抗原、细胞质抗原或细胞核抗原。稀有细胞的特征性抗原可以是在细胞群体的大多数细 胞中没有发现的细胞成分的抗原，或者其可以是在细胞群体的大多数细胞中没有发现的细 胞成分的抗原性变体。例如，被抗体4B9结合的NRBC抗原在未怀孕成人的成熟红细胞中不 存在。
[0043] 稀有细胞可以是癌症细胞，例如肿瘤细胞、腺瘤细胞、癌细胞或其它任意的癌症细 胞。稀有癌症细胞可以是血液样品中的循环肿瘤细胞，或生物液体正常细胞群体中的稀有 癌症细胞；生物液体可以是任意的生物液体，包括但不限于源自组织活组织检查的细胞悬 浮液。
[0044] 稀有细胞可表现为生物液体中细胞群体的约IO2至约IO4个、约IO 3至约IO5个、 约IO4至约IO6个、约IO 5至约IO7个、约IO6至约IO8个、约IO7至约IO 9个、约IO8至约101° 个细胞中的一个细胞。生物液体可以是任意的生物液体，例如但不限于血液、血浆或尿液； 或者生物液体可以是获自组织样品例如活组织检查样品的细胞悬浮液。
[0045] 如本文所使用的，哺乳动物可以是任意的哺乳动物，例如但不限于人类或动物；动 物可以是任意的动物，例如非人灵长类动物，例如黑猩猩、大猩猩或猩猩；动物可以是伴侣 动物，例如狗或猫；或者动物可以是家畜，例如奶牛、绵羊、猪或山羊；动物也可以是动物园 里的动物，例如熊、老虎或狮子。
[0046] 在本发明方法的一个实施方式中，胎儿NRBC的分离特别地涉及将母体血液 (5-10mL)与涂覆有4B9抗体的细胞分离基质一起进行短时间（例如30-60分钟）温育。在 洗涤以除去未结合的细胞之后，将固定化的胎儿NRBC与用合适的检测基团标记的4B9抗体 温育30-60分钟。由于4B9抗体对于胎儿NRBC的高特异性，通过使用经标记的4B9或针对 上述其他特异性或非特异性NRBC标志物的经过合适标记的抗体能够容易地实现该策略的 高分离效率、已实施的洗涤步骤以及对经分离细胞的组合检测/鉴别。除了允许组合胎儿 NRBC的捕获、检测和鉴定之外，通过使用本领域技术人员已知的合适且易于利用的染色体、 基因和分子试验，该技术还与直接对结合到分离基质的细胞进行的指定分析程序相兼容。
[0047] 作为选择，分离细胞的高纯度和大数量使得可容易获得单个胎儿NRBC以进行显 微操作或从固相基质上去除全部被捕获的胎儿NRBC群以进行下游的基因和分子测试。这 种新型的夹心式细胞捕获、分离、鉴定技术可容易地用于从人或动物的生物液体（例如血 液、羊水和尿液）中分离稀有细胞群体的常规应用；还可用于从来自于活组织检查的人或 动物细胞悬浮液中分离任意的稀有细胞。特异性分离的细胞可用于研究、评估细胞对于药 物制剂的响应，或用于指示疾病，例如染色体和基因异常、孕妇妊娠并发症以及多种癌症 等。仅有的要求是选择性或特异性结合指定靶细胞的抗体的获得和/或开发。本发明另外 的适应性修改是其作为诊断方法的应用，所述方法是基于监控稀有细胞（例如与胎儿和/ 或孕妇并发症的发生相关的胎儿NRBC)循环数量的改变。据报道，在诸如唐氏综合症（DS) 和先兆子痫等病症中，有更多的胎儿细胞进入到母体血液中。先兆子痫是一种在妊娠第20 周（二期后期或三期）之后将会发展高血压和蛋白尿的妊娠病症。在这种病症中，对获自 疑似以及怀孕匹配的正常妊娠中的每单位母体血液中分离的胎儿NRBC数量的相对变化进 行的对比性分析可用于诊断，并且在预测这些病症的发生方面也是具有价值的。
[0048] 在双位点"夹心式"方法中，与特异性和/或非特异性胎儿NRBC表面抗原反应的 抗体的配对组合是本发明重要的设计组成部分。到目前为止，本领域对于胎儿细胞分离的 状况通常集中在相对复杂的多步骤细胞富集方法上，这些方法不具备足够的灵敏度，易于 导致产率不良和/或显著的细胞损失，并给出不一致的结果。此外，所报道的方法通常靶向 非特异性和/或在靶细胞在成熟过程中表达量改变的胎儿细胞标记物（17,18, 20-28)。
[0049] 在一个实施方式中，本发明将新型单克隆抗体（美国专利7858757B2中描述的抗 体4B9)的特异性胎儿NRBC识别性质与双位点"夹心式"设计组合使用，提供了一种从母体 血液中分离胎儿NRBC的高效且方便的方法。在这种新颖的设计中，识别特异性细胞表面表 位的4B9抗体被涂覆在合适的反应表面上，并利用与能够易于定量/检测的标记共价或非 共价偶联的4B9抗体检测特异性捕获的胎儿NRBC细胞。由于夹心式细胞分离方法固有的 灵活性，允许依次进行细胞捕获、细胞洗涤以除去未结合的细胞以及细胞检测，特异性捕获 抗体例如4B9可备选地与针对特异性（例如抗ε-球蛋白）或非特异性（例如糖血型蛋白 A、i-蛋白、⑶47)胎儿NRBC标记物的一种或多种检测抗体配对使用。
[0050] 结合相同或不同胎儿NRBC表面抗原的捕获或检测抗体的组合（例如4B9/4B9或 4B9/抗糖血型蛋白-A抗体）为本发明的技术增加了新的另一个方面的特异性和精确性。 所提供的细胞捕获/检测策略不限于配对的抗体组合，并可以容易地配置为包括一种或多 种捕获抗体与针对内部和/或外部胎儿NRBC标识物的一种或多种检测Abs的组合。
[0051] 使用抗体-涂覆的大表面平板或含有抗体的固体支持物（例如易于利用的显微载 玻片和陪替氏培养皿）具有几个优点。除了促进更紧密的接触以及提供增加的细胞捕获容 量和亲和力非依赖性反应动力学（30)之外，它们还允许将多个所需的步骤统一到一个用 于使误差最小化和提高一致性的简单和连续的过程中。由于本发明的方法将细胞捕获、洗 涤以除去未结合的细胞、细胞检测（鉴定）以及分析的步骤组合到适合于手动和自动化应 用的无缝平台系统中，这个单一形式的系统是极为有利的。
[0052] 由于需要进行不同形式的细胞富集、鉴定和/或分离的多步骤方法容易造成累积 误差和细胞损失，从而使得如果不是不可能，但很难开发出高效的连续性细胞分离方法 (18)，而这种统一的过程具有公认的操作上的好处。本发明可以提供为单独的基于抗体的 胎儿NRBC分离试剂盒以用于通常的下游用途，或者提供为完整的胎儿NRBC分离和分析试 剂盒。设计的灵活性允许将利用不同特异性的抗体的细胞分离平台整合在夹心式细胞捕获 /检测方法中，这提供了本发明对研究和/或临床所关注的任意循环稀有细胞进行分离和 分析的广泛适用性。
[0053] 患者群体和样品
[0054] 从妊娠8至12周的一期妊娠者（22-45周岁）以及经超声确认二期男性妊娠者中 收集外周血。还从未怀孕妇女中收集血液样品。怀孕和未怀孕妇女的样品获自Dr. Jonathan Herman，Long Island Jewish Medical Centre，NY.。男性受试对象的试样获自 KellBenx， Great River，NY的自愿人员。在获得供血者的知情同意书之后，将所有的试样收集在含有 EDTA的血液采集管中。所有的血液样品在收集后的24小时之内使用。
[0055] 材料
[0056] 辣根过氧化物酶（HRP)和链亲和素获自ScrippsLaboratories，San Diego, CA。硫 代-NHS-LC-LC生物素、硫代-NHS-SS-生物素、NHS-PG12-生物素和NHS-SS-PG12-生物素； 二硫键断裂物、二硫苏糖醇（DTT)和TCEP溶液；山羊抗小鼠 IGM(u)、兔抗小鼠 IGM(u)、山羊 抗小鼠，Fab2 ;FC 受体阻断剂获自 ThermoFisher Scientific (www. Thermofisher, com)。EPS 微阵列显微载玻片、Superfrost Gold显微镜载玻片、Screw载玻片帽夹；Fisher牌100mm 和60mm陪替氏培养皿，以及平底6孔非组织培养板来自于ThermoFisher。
[0057] 用链亲和素涂覆的Dynabead?生物素结合剂磁珠 ；CELLectin Biotin Binder试 剂盒，其包含通过DNA连接子用链亲和素（以提供用于释放结合至生物素化抗-细胞抗体 的细胞的DNA酶切割位点）涂覆的磁珠；以及Dynabead? FlowComp Flexi，Part A和Part B，包含用修饰的链亲和素涂覆的磁性颗粒的试剂盒、DSB-X生物素抗体标记试剂盒以及用 于将结合至DSB-X生物素化抗-细胞抗体的细胞释放出来的基于D-生物素的释放剂均获 自Invitrogen (www. invtrogen. com)。热失活胎牛血清、RPMI培养基1640、不含興或缓的 D-PBS以及纯化的小鼠 IgM获自Invitrogen。
[0058] 包含右旋糖苷涂覆的使用双特异性四抗体复合体（TAC)的磁性纳米颗粒（可同 时识别与抗-细胞抗体连接的右旋糖酐和生物素分子）的EasySep?人生物素阳性细胞选 择试剂盒获自 StemCell Technologies (www. stemcell, com)。SuperEpoxy?载玻片获自 Arrayit Corporation (Sunnyvale, CA. 94089)。表面活化的Nexterion?载玻片 H 和 P 获自 SCHOTT North America Inc.，Louisville，KY.40228。
[0059] 小鼠 IgG溶液、小鼠血清、山羊IgG溶液和山羊血清获自Equitech-Bio, Inc.， Kerrville，TX. 78028。四甲基联苯胺（TMB)微孔过氧化物酶底物系统来自Neogen Corporation, Lexington KY。FITC (异硫氰酸突光素 ）、AMCA (7-氨基-4-甲基香豆 素-3-乙酸）、Alexa Fluor? 350 以及 Dylight350 来自于 Invitrogen 和 Thermo Scientific。 细胞核染色所用的TO-Pro获自Invitrogen。针对⑶36、⑶71和糖血型蛋白A的市售 抗体来自于Invitrogen。识别胎儿ε球蛋白的抗体来自于Fitzgerald Industries International (www. Fitzgeral-fii. com)。将所购抗体用检测探针进行预标记或使用厂商 的操作说明进行内部标记。
[0060] 用于进行FISH(突光原位杂交）的试剂和试剂盒来自于Aneu Vysion(www. abbottmolecular. com)。其他所有的化学试剂都是最高品质的，获自Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO 或 Amresco，Inc.，Solon，OH。八孔微量滴定（微孔）板和架是 Griner Internatl. , Germany 的产品。
[0061] 抗体
[0062] 分泌单克隆抗体4B9的杂交瘤克隆已保藏在德国微生物菌种保藏中心 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ,不伦瑞克 (fcaunschweig), Germany)，保藏登记号为 DSM ACC 2666,保藏日为 2004 年 7 月 13 日。
[0063] 抗-胎儿NRBC抗体可以是单克隆、多克隆或任意其他胎儿NRBC结合剂组合。对 由稀有细胞（例如胎儿NRBC)表达的各种表面和/或内部抗原决定簇具有广谱性或专有性 结合亲和力的适当的双位点"夹心式"细胞捕获和检测和/或鉴定结合伴侣可以用于本发 明的方法中。这些也可基于市售抗体及所报道的表达和特异性的配对选择。例如，识别胎 儿NRBC的市售和专利抗体的清单包括但不限于与细胞表面分化标记物簇（CD)，例如CD36、 ⑶71、⑶47反应的抗体以及针对糖血型蛋白A、i_抗原和ε球蛋白的抗体。
[0064] 制备单克隆以及多克隆抗体的方法业已成熟[Harlow Ε.等人，1988Antibodies. New York，Cold Spring Harbor Laboratory]。可根据由 P.Tijssen 编著的业已成熟 的标准实验室程序"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays"（In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Eds :R. H. Burdon 和 P. H. van Kinppenberg ;Elsevier Publishers Biomedical Division，1985)来制备单克隆抗体，其 基于 Kohler 和 Milstein 最初的技术（Kohler G. ,Milstein C.Nature256 :495,1975)。也 可通过本领域已知的其他方法来生产抗体，包括但不限于用特异性DNA进行免疫。
[0065] 对于配对抗体的选择需要特别考虑的是，捕获抗体（涂覆在固体支持物上）和检 测抗体（与检测标记相连接）同时结合至在胎儿NRBC分化生物标记物表面上表达的相同 或不同决定簇上的能力。胎儿NRBC捕获/检测结合伴侣也可包括抗体片段、嵌合抗体、人 源化抗体、通过对现存抗体进行重建而开发的抗体和细胞结合肽、合成抗体、合成结合剂、 重组抗体以及通过筛选噬菌体展示文库和其他类似的表达和选择系统所选择的肽和蛋白 质结合剂。
[0066] 可通过已知的标准方法来产生针对整个胎儿NRBC、针对胎儿NRBC亚级分（例如分 离的细胞膜、分离的细胞核和分离的质膜）；针对胎儿NRBC前体和/或胎儿干细胞；针对胎 儿细胞可溶性蛋白、肽和糖蛋白；针对其他相关抗原性分子的结构已知或未知的多克隆或 单克隆抗体。其他的合适的免疫用抗原包括但不限于合成肽、专门设计的分子和胎儿NRBC 抗原模拟结构。可利用标准免疫和采血程序在多个物种中产生抗体，包括但不限于小鼠、大 鼠、兔、山羊、绵羊、驴、马和鸡。可通过业已成熟并广泛使用的标准抗体纯化方案来对动物 的采集血或杂交瘤细胞培养基进行分级分离和纯化。
[0067] 实施例
[0068] 无细胞 4B9ELISA
[0069] 本发明一个实施方式中的4B9ELISA包括将4B9抗体直接或间接涂覆在固体支持 物上，使用用辣根过氧化物酶体（HRPO)标记的山羊抗小鼠 IgM(Fab) 2来检测结合的4B9， 并使用HRPO底物四甲基联苯胺（TMB)对反应进行比色定量。然而在直接涂覆中，通过与检 测抗小鼠抗体-HRPO缀合物温育（0. 025ug/ml测定缓冲液；IOmM NaPO4, pH7. 4,含有8. 8g NaCl、0. 5g BSA、0. 5mL吐温-20以及2. 5mL生物防腐剂proclin/L)来检测4B9,而间接涂 覆则涉及将未标记的或生物素化的4B9(10ug/mL)分别与二抗或用链亲和素涂覆的支持物 预先温育。
[0070] 通常，在几乎相同的条件下（即抗体体积（50uL/反应）、检测缓冲液体积（IOOuL/ 反应）和60分钟振荡或混合温育），对微量滴定孔、试验管中的磁性颗粒以及16孔分区组 件（Grace Bio labs)中的载玻片进行比较评估。在用ELISA洗涤缓冲液（0.05mM Tris， pH7. 4,含有0.05%吐温-20)洗涤四次并加入检测抗体-HRPO缀合物（lOOuL/测定）之后， 如上所述洗涤每个反应支持物并与lOOuLTMB底物温育10分钟。在使用磁性颗粒和分区载 玻片的情况下，随后将IOOuL反应过的底物转移至干净的微量滴定孔中。接着向所有孔中 加入IOOuL/孔的终止溶液（0. 2M硫酸）并在450nm和620nm处进行对比性双波长吸光度 测量。如上所述对涂覆在陪替氏培养皿或六孔组织培养平板上的抗体进行优化和评估，除 了各种试剂所使用的体积更大。
[0071] 用于将抗体或链亲和素涂覆在微量滴定孔或其它支持物上的通常程序如先前所 描述（31-34)。市售获得的磁性颗粒大多用链亲和素或抗-小鼠 IgM涂覆。根据生产商的 操作说明洗涤珠（25uL含有I X IO7个珠），并将其与浓度不断增加的生物素化4B9或未标 记的4B9抗体温育。将结合珠的抗体重悬浮于IOOuL检测缓冲液中并与IOOuL抗-小鼠 IgM-HRPO缀合物温育，如上所述对反应进行定量。根据先前公布的方法（31-34)或生产商 的操作说明将已经被功能化以用于共价或非共价蛋白标记的市售载玻片偶联至抗体或链 亲和素。为了整个活化表面的标记，将载玻片固定在单孔载玻片组件（Grace Bio-lab)中 并与涂覆抗体或链亲和素的4mL/载玻片温育。对于比较性试验，将载玻片划分进16孔组 件中，并向每个孔加入IOOuL浓度增加的生物素化4B9或未标记的4B9抗体。温育和洗涤 之后，加入IOOuL/孔的抗小鼠 IgM-HRPO缀合物并如上所述对反应进行定量。使用合适体 积的涂覆和封闭缓冲液如上所述将抗体或链亲和素涂覆在陪替氏培养皿或六孔组织培养 平板上。对于比较性评估，如对于磁性颗粒和载玻片所描述，对广泛使用的涂覆有链亲和素 或第二抗体的透明八孔平板（Griner Bio-One, Microclon600高结合）进行类似的4B9结 合检测。
[0072] 作为选择，可以使用相同抗体或不同抗体对如上所述或本领域技术人员已知的合 适的固体表面进行部分涂覆和单独处理，使得被抗-胎儿细胞抗体捕获的阳性细胞可以与 作为非特异性结合量度的被无关抗体捕获的细胞进行对比。后者可以通过用例如正常小鼠 IgM或相当的非特异性细胞捕获抗体（例如抗糖血型蛋白-A)包被预定的区段来完成。例 如，使用供应商（例如Grace-Bio-Lab)提供的各种多孔玻片组件可以容易地将载玻片划 分成两个、四个或更多个区段/孔，并且所有的孔或孔的组合或载玻片的部分是用相同的 抗-胎儿细胞抗体或用特异性和非特异性（对照）抗体在独立的孔中或载玻片的独立部分 中进行涂覆。
[0073] 在某些实施方式中，对载玻片的预定区段或部分，或者对各种固相基质上的微点、 微孔或以已知的SBS/ANSI形式存在的微阵列（例如96、384、1536等点阵列）进行涂覆。在 其他实施方式中，对整个固相表面上进行涂覆。具有电势的预定涂覆区域可用于对分离的 基质进行细胞定位、细胞鉴定和细胞移动/转移的自动化和/或手动扫描。
[0074] 可利用例如由Arrayit Corporation所提供的用于涂覆显微镜载玻片（www. arrayit.com)的各种点微阵列打印装置，或者通过对特殊制造的微板（例如那些可由 Curiox Biosystems (www. curiox. com)可得到的）上物理性产生的微阵列孔（96、384、1536 等）进行涂覆，来完成对各种表面的涂覆。涂覆有抗体的以标准SBS/ANSI兼容性微板形式 存在的微阵列点（或通过将涂覆的支持物置于SBS/ANSI兼容性载体中）极大地促进了各 个过程的自动化。通过将能够进行液体处理、温育以及洗涤的各种微板兼容性仪器与通过 各种物理和/或非接触性方式（例如基于声波的分散机或其它合适的手段）进行细胞染 色、可视化/鉴定和/或转移以用于下游的染色体和基因分析的自动化能力相组合，可对后 者进行辅助。
[0075] 检测抗体与HRPO的偶联步骤如所述进行（31-34)。偶联反应涉及用Sulfo-SMCC 进行的酶活化和用已被2-亚氨基硫杂环戊烷活化的抗-小鼠检测抗体进行随后的反应。根 据标准程序来进行生物素-抗体偶联（34)。
[0076] 对这种简单的定量ELISA系统进行对比性评估，即评估4B9与（a)广泛使用的液 相磁性颗粒，（b)广泛使用的微量滴定孔以及（c)大表面固相支持物（例如显微镜载玻片、 陪替氏培养皿和大六孔组织培养平板）的结合特性。ELISA促进了对所公开的细胞分离技 术和平台的演变具有重要意义的很多方面的快速发展、优化和比较性评估，如果可能确定 的话，这是极其困难的。后者包括但不限于（1)，4B9在各种浓度（0.5-40ug/mL)下以及在 各种涂覆缓冲液（磷酸盐，PH6. 5,磷酸盐，pH8. 0,硼酸盐，pH8. 5,碳酸盐，pH9. 1)下对于各 种支持物的非共价（被动）或共价结合性质的比较性评估；（2)，在各种浓度（l_40ug/ml) 下在上述缓冲液中涂覆到各种支持物上的抗-物种抗体（例如山羊抗-小鼠 IgM)的非共 价结合性质和4B9结合能力；（3)用五种不同的生物素标记制剂（见材料）以各种摩尔比 (10-400摩尔生物素/摩尔抗体）进行标记的增加量的4B9抗体与各种市售的和/或人工 内部涂覆链亲和素的支持物的结合；以及（4)增加量的未标记4B9与最佳涂覆的第二抗体 (例如，山羊抗-小鼠 IgM)与各种支持物的结合。
[0077] 细胞捕获
[0078] 可使用标准非共价或共价结合方法将捕获抗体非共价地涂覆于、共价地偶联至或 连接至各种固相支持物上。该固体支持物可以是试管、珠、微粒、滤纸、各种膜、玻璃滤器、载 玻片、玻璃或硅芯片、磁性纳米和微米颗粒、磁棒、磁套以及微流体、微电子和微磁性机械细 胞分离系统和设备、各种玻璃或塑料室，或其它的本领域已知的材料和支持物的形式。后者 也可包括各种用于插入至患者循环系统以进行体内细胞采集的医疗仪器。
[0079] 细胞释放
[0080] 涂覆有特异性抗体、亲和素、链亲和素或其修饰物，或抗-物种抗体以及亲和结合 剂（例如蛋白-A或蛋白-G)的微米颗粒和纳米颗粒在细胞分离领域占据主导地位。这些 方法通常包括具有期望特异性的镜磁性标记的抗体，将磁性化的抗体与靶标样品（例如母 体血液）进行温育，以及当将强磁体放置于温育室外面时保留靶标细胞（正向选择）或不 期望的细胞（负向选择）（18)。
[0081] 尽管免疫磁性细胞分选（MACS)方法相对便利、便宜并且易于操作，但据报道该技 术倾向于具有几个显著的局限性，包括低效、低产率、细胞俘获、珠与珠之间的相互作用或 凝聚、细胞损伤、不一致性以及与免疫染色方法之间存在自动荧光干扰。为了改进其性能， 已经采用了几种也倾向于导致显著误差、细胞损失和不一致性的样品预处理富集方法（过 滤、密度梯度分离、差别化细胞裂解或具有或不具有负向免疫选择的基于大小的分离）（18， 23,29)〇
[0082] 已经开发出了通过在颗粒和所采用的抗体之间引入可切割性连接以将捕获的细 胞从磁性颗粒上分离下来的策略。涉及可取代的生物素标记或通过竞争性抗体解离抗体 的替代性策略也已经被开发出并能市售得到（Invitrogen ;Miltenyi Biotech ;Stem cell technologies)〇
[0083] 抗体4B9与可切割（二硫键连接）的生物素（例如Sulfo-NHS-SS和 NHS-SS-PG12-生物素）、包含在Invitrogen Biotin结合剂试剂盒中的DXB-X-生物素以及 Invitrogen CELLectin试剂盒联合使用。在将4B9偶联至链亲和素涂覆的孔中或相应的试 剂盒提供的磁性颗粒上之后，将固体支持物-4B9复合体与浓度增加的切割或置换试剂温 育30分钟。接着洗涤固体支持物，并使用上述的无细胞4B9ELISA进行反应。通过将经处 理测试中剩余的信号以及未处理的对照测试中产生的总信号进行比较，可容易地确定出 抗体释放系统的效率。
[0084] 捕获细胞的检测和鉴定
[0085] 用于检测捕获细胞的抗体能够用于细胞检测及鉴定的双重目的。后者是可能的， 具体是通过使用两步免疫反应步骤（31-35)，其中由特异性抗体捕获靶标分子，随后进行洗 涤步骤以除去未附着的分子，并利用特异性/或非特异性检测抗体对特异性捕获的分子进 行检测。在两步捕获/检测形式中，特异性捕获的血液分子可被非特异性或广泛反应性的 检测抗体所检测这一事实（36)，是本发明方法的优点与灵活性的进一步证明，这是由于利 用非特异性细胞检测抗体也可准确地检测特异性捕获的细胞。
[0086] 通过从母体血液中捕获胎儿细胞，洗涤以除去未附着的细胞，并用特异性和/或 非特异性检测抗体检测捕获的细胞，研究了上述构想在胎儿NRBC分离中的应用。在一系列 的两步法"夹心式"平行实验中，由固相4B9抗体所捕获的胎儿NRBC在洗涤之后，用经标记 的4B9或者用广泛识别表达于各种胎儿甚至母体血液细胞上的表面标记物的另一种经标 记抗体（例如与GPH-A、⑶36、⑶71或⑶47具有反应性的抗体）进行检测。在第二次洗涤 步骤之后，还针对ε-球蛋白对分离的细胞进行染色并在显微镜分析。在所有情况中，还对 用检测抗体染色的分离细胞进行ε -球蛋白染色，证实了该技术的特异性并将特异性捕获 /检测的细胞鉴定为胎儿原始NRBC。由于ε-球蛋白仅对原始胎儿细胞具有特异性（17， 20,22)并且4Β9对于原始和成熟细胞均具有特异性，检测出未被ε-球蛋白染色的胎儿细 胞是可能的。然而，在妊娠一期的母体血液中，原始NRBC是占据优势地位的细胞类型，一直 到妊娠12周（20)。
[0087] 利用检测抗体对4Β9捕获胎儿细胞进行表面染色以及利用ε -球蛋白抗体进行细 胞质染色的结果一致，这具有重大的意义。这个观察结果第一次证实和确认利用简单的两 步法夹心式方法能够对循环稀有细胞进行有效地捕获、检测和鉴定，以提供高度灵敏、特异 性和可再现的用于对循环血液分子进行定量的免疫测定。
[0088] 检测抗体可以直接偶联到报告分子上或通过次级检测系统间接检测。后者可能 基于几种不同原理的任意一个或组合，所述原理包括但不限于经抗体标记的抗-物种抗体 以及其他形式的免疫学或非免疫学桥接和信号扩增系统（例如生物素-链亲和素技术，蛋 白-A和蛋白-G介导的技术或核酸探针/抗-核酸探针等）。用于直接或间接抗体偶联的 标记可以是任意的已报道的可检测分子。合适的报告分子可以是本领域技术人员所已知的 免疫细胞化学、分子生物学、光学、荧光以及电子显微镜、细胞免疫分型、细胞分选、流式细 胞术、细胞可视化、检测、计数和/或信号输出定量领域所已知的那些。
[0089] 合适的标记的实例包括但不限于突光团、发光标记、金属复合体、放射性同位素、 生物素、链亲和素、酶或其他检测标记及标记的组合，例如酶和发光底物。合适的酶及其底 物的示例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β -半乳糖苷酶、萤光素酶以及本领域已知的其 他检测系统。可以标记并同时或依次使用一种以上具有特异性和/或非特异性的抗体，以 增强细胞检测、鉴定和/或特异性。在此应用中，用本领域已知的具有不同且可区分的信 号输出性质、检测信号、光谱或荧光发射光谱的不同标记对每个抗体进行标记。在免疫细 胞化学和细胞检测显微术领域中广泛使用的合适标记的实例包括但不限于FITC(异硫氰 酸突光素 ）、AMCA (7_ 氛基 _4_ 甲基香?素-3_ 乙酸）、Alexa Fluor488、Alexa Fluor594、 Alexa Fluor350、DyLight350、藻红蛋白、别藻蓝蛋白。用于检测细胞核的染色剂包括 Hoechst33342、LDS751、TO-PRO 和 DAPI。
[0090] 胎儿NRBC分离免疫测定
[0091] 根据本发明一个实施方式的胎儿NRBC分离检验提供了双位点"夹心式"免疫测 定，以第一温育步骤、洗涤和第二温育步骤的两步法"顺序"过程来实施。在该检验中，将 合适量的洗涤过的全血加入到用4B9直接或间接（通过链亲和素或二抗）预先涂覆的盘 (IOmL/盘）、6孔组织培养平板（3mL/孔）或载玻片（IOmL/塑料载玻片容器中的2片载 玻片）中，并在持续不断地轻微混合下温育60分钟。温育之后，轻轻吸出血液，用合适量 的PBS(GIBC0 DPBS)洗涤温育室或载玻片五次。接着用适当稀释的检测抗体4B9或任意 其他镜适当标记的胎儿NRBC鉴定检测抗体如上所述进行温育。如上温育和洗涤之后，分 离的细胞准备进一步进行处理。根据所建立和报道的程序（20, 22, 23)，此过程的示例包括 但不限于固定、透化和免疫探测胎儿NRBC鉴定标记物（例如ε-球蛋白）以及细胞核复 染色。作为选择，可以利用所建立的方法（21，37)和从供应商处购买得到的试剂（例如， AneuVysion (www. abbottmolecular. com))，通过FISH (突光原位杂交）对细胞进行染色体 分析，以指示特异性的染色体和基因异常。
[0092] 也可通过显微操作或通过将整个细胞群从基质或支持物上剥离来除去细胞，以根 据易于利用和已知的方法来进行下游的染色体、分子和基因测序技术。后者包括但不限 于检测非整倍体（21、18、13、X和Y)的FISH、用于非整倍体的QF-PCR、Array-CGH或利用 几个商业公司的广泛使用的市售试剂、试剂盒和设备的用于检测基因突变或多态性的基因 组测序，其中。实例包括 BioReferenc Laboratories、Abbott，s Aneuvysion、GenomeDX、 Gen-Probe、Signature Labs、Ambry Genetics、Invitrogen、Beckman、Bio-Rad、Molecular Devices、Applied Biosciences 和 Illumina Inc〇
[0093] 米集在EDTA管中的全血（母体血液/非妊娠出血/雄性血）于2000rpm(Beckman Allegra)下离心10分钟。弃去血浆级分，并将细胞层以1+2体积比重悬浮于缓冲液#1中 (不含Ca 2+和Mg2+的PBS，具有0. 1 % BSA、5mMEDTA、2. 5% FC受体阻遏物），轻轻混匀，并如 上所述进行离心。重新洗涤细胞层2次，并在使用前重悬浮至原血体积。
[0094] 利用发表的方法（31)用抗体或蛋白以10ug/mL涂覆缓冲液（50mM硼酸钠，PH8. 5) 的浓度对固体支持物进行涂覆。简而言之，将支持物与适量体积的涂覆捕获抗体或蛋白 质溶液在室温下温育过夜。随后洗涤经涂覆支持物一次：支持物洗涤缓冲液（IOmM KP04， pH7. 4)，并在适当体积的封闭溶液（具有1 % BSA的洗涤缓冲液）中温育1小时。在使用 前，用洗涤缓冲液洗涤一次或者在封闭缓冲液中储藏于4°C最多1周。可以将抗体或蛋白 质涂覆在各种支持物上，并以即时使用的干燥形式提供。利用购自几家商业公司（例如 Invitrogen (www. invitrogen. com)和 Thermo Scientific (www. piercenet. com))的试剂和 试剂盒，可以容易地进行4B9检测抗体以及其他合适的检测和/或验证抗体与各种荧光探 针（例如FITC)的偶联。
[0095] 细胞染色和分析方法
[0096] 细胞膜、细胞质和细胞器的免疫荧光、免疫酶促和细胞化学染色的方法目前业已 成熟并且普遍市售的。这包括根据已建立和报道的程序（20,22,23)进行固定、透化、对胎 儿NRBC鉴定标记物（例如⑶抗原、GPH-A、I抗原和胎儿ε -球蛋白）进行探测以及进行 细胞核复染色。通过FISH进行染色体染色的技术也是业已成熟的（21，37)，市售的试剂和 试剂盒也是普遍可获得的[AneuVysion(www. abbottmolecular. com)]。用于下游基因和/ 或分子测试的技术也可普遍获得。后者包括但不限于用于非整倍体的QF-PCR、Array-CGH 或利用可普遍获得的市售试剂、试剂盒和设备对于所有基因畸形的基因组测序。
[0097] 在本发明的一个实施方式中，根据已建立的方法，利用用DyLight350或Alexa Fluor350标记的单克隆抗体对4B9捕获的细胞进行胎儿ε -球蛋白染色。简而言之，在完 成洗涤步骤之后，用冰冷的甲醇（_20°C )固定捕获的细胞10分钟，并利用4%甲醛在室温 下固定10分钟。洗涤之后，细胞用〇. 1 % Triton X-100于PBS中透化（室温下5分钟）， 用PBS中的1% BSA封闭，并在相同的缓冲液中与经标记的抗ε -球蛋白抗体温育（室温下 2小时或4°C下过夜）。对于细胞核的复染色，加入合适体积的PBS中的4uMT0-PR0-l溶液， 用箔片盖住温育反应，室温下温育10分钟。随后，用PBS洗涤细胞一次并进行分析。按照制 造商的试剂和试剂盒使用说明来进行染色体FISH (AneuVysion，见www. abbottmolecular. com)。
[0098] DNA 分离和 PCR
[0099] 对3毫升全血进行双离心，在4°C下于1500rpm离心10分钟，随后于3700rpm离 心10分钟。使用QIAamp小试剂盒（Qiagen)按照厂商的说明从血楽中分离不含细胞（CFF) 的胎儿DNA。取10微升用于Y染色体确定。对于基因组DNA分析，将捕获的细胞从分离平 台中剥落到DPBS中，转移到离心管中，并于5000rpm离心5分钟，将细胞球团汇集到一个管 中。离心之后，将细胞球团重悬浮于21uL的5mM Tris，pH8. 0中，通过三个冷冻/解冻循环 裂解。使用 ChelexlOO (Sigma Chemical Co, St. Louis，MO)分离基因组 DNA 并重悬浮于 5mM Tris，pH8.0中。利用ABI St印OnePlus RT-PCR系统根据厂商的操作说明对SRY、DYS14和 β -肌动蛋白进行实时PCR(RT-PCR)。SRY的引物和探针的序列为：
[0100] 正向引物：5' -TGGCGATTAAGTC AAATTCGC-3'
[0101] 反向引物：5，-CCCCCTAGTACCCTGACAATGTATT-3，；以及
[0102] 检测探针：5，-(FAM)AGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGA(BHQl)-3，
[0103] DYS14的引物和探针的序列为：
[0104] 正向引物：5' -CATCCAGAGCGTCCCTGG-3，
[0105] 反向引物：5' -TTCCCCTTTGTTCCCCAAA-3'
[0106] 检测探针：5，- (HEX) CGAAGCCGAGCTGCCCATCA (BHQ) -3 '
[0107] 肌动蛋白的引物和探针的序列为：
[0108] 正向引物：5，-GCGCCGTTCCGAAAGTT-3，
[0109] 反向引物：5，-CGGCGGATCGGCAAA-3，；以及
[0110] 检测探针：5，-NED-ACCGCCGAGACCGCGTC(MGB)-3 ' (De Kok JB, Wiegerinck ET, Giesendorf BA, Swinkels Dff. 2002Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms using novel minor groove binding DNA oligonucleotides(MGB probes). Hum Mutatl9 :554-559) ICR 程序是 50°C 2 分钟，95°C 10 分钟，50 个循环的 95°C 15 秒和60°C I分钟。所有的分析进行三个重复，在所有重复中，Ct (循环阈值）< 40被认为 是阳性的。
[0111] 分离的可再现性
[0112] 由于较高的分离效率及使用便利性，随后的分离涉及用4B9Ab直接涂覆的陪替氏 培养皿。
[0113] 表1 :从血样中分离胎儿原始成红细胞

【权利要求】
1. 从哺乳动物的生物液体中分离或富集稀有细胞的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基质上的抗体，所述基质例如大平板、陪替氏培养皿、孔、微孔、载玻片、 条、杆、珠或微阵列板或微阵列载玻片，其中所述抗体结合所述稀有细胞的细胞表面抗原； (ii) 使固定化的抗体与生物液体样品接触，其中体液包含所述稀有细胞和多种其他细 胞； (iii) 将固定化的抗体与体液样品在适合于所述抗体与所述稀有细胞的细胞表面抗原 结合的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体；以及 (iv) 洗涤所述抗体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞并提供固定化的抗体-稀 有细胞复合体。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述抗体对胎儿细胞表面抗原是特异性的。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所述胎儿细胞表面抗原是胎儿有核红细胞抗原。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述抗体是抗体4B9。
5. 如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所述生物液体是血液、血浆、羊水、尿液或来自绒毛 膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液。
7. 对生物液体中的稀有细胞进行检测的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基质上的第一抗体，其中所述第一抗体结合所述稀有细胞的第一细胞 表面抗原； (ii) 使固定化的第一抗体与生物液体样品接触，其中体液包含所述稀有细胞和多种其 他细胞； (iii) 将固定化的第一抗体与体液样品在适合于所述第一抗体与所述稀有细胞的第一 细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞复合体； (iv) 洗涤所述第一抗体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞并提供分离的第一抗 体-稀有细胞复合体； (V)将所述第一抗体-稀有细胞复合体与结合所述稀有细胞的第二细胞表面抗原的第 二抗体在适合于所述第二抗体与所述第二细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗 体-稀有细胞-第二抗体复合体；以及 (Vi)检测所述第一抗体-稀有细胞-第二抗体复合体中的所述第二抗体，从而检测所 述体液样品中所述稀有细胞的存在。
8. 如权利要求7所述的方法，其中所述生物液体是血液、血浆、羊水、尿液或来自绒毛 膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液。
9. 如权利要求7所述的方法，其中所述第一抗体对胎儿细胞表面抗原是特异性的。
10. 如权利要求9所述的方法，其中所述第一抗体是抗体4B9。
11. 如权利要求9所述的方法，其中所述第二抗体对胎儿细胞表面抗原是特异性的。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述第二抗体对胎儿e-球蛋白、⑶36、⑶71或 ⑶47是特异性的。
13. 如权利要求7所述的方法，其中所述第一抗体对⑶36、⑶71或⑶47是特异性的。
14. 如权利要求7所述的方法，其中所述第二抗体是抗体4B9。
15. 如权利要求7所述的方法，其中通过将所述第一抗体-稀有细胞-第二抗体复合 体与特异性结合所述第二抗体的带有可检测性标记的第三抗体在适合于抗体结合的条件 下温育，以形成第一抗体-稀有细胞-第二抗体-第三抗体复合体；洗涤所述抗体-稀有细 胞-第二抗体-第三抗体复合体；检测所述带有可检测标记的第三抗体；从而检测所述样 品中的所述稀有细胞。
16. 对生物液体中的稀有细胞进行检测的方法，所述方法包括： (i) 提供固定在基质上的第一抗体，其中所述第一抗体结合所述稀有细胞的第一细胞 表面抗体； (ii) 使固定化的第一抗体与生物液体样品接触，其中体液包含所述稀有细胞和多种其 他细胞； (iii) 将固定化的第一抗体与所述体液样品在适合于所述抗体与所述稀有细胞的细胞 表面抗原结合的条件下温育，以形成第一抗体-稀有细胞复合体以及多种未结合的细胞； (iv) 洗涤所述第一抗体-稀有细胞复合体，以除去所述未结合的细胞； (v) 裂解所述第一抗体-稀有细胞复合体中的稀有细胞，以形成包含稀有细胞特异性 核酸序列的裂解物，并将裂解的细胞和与所述稀有细胞特异性核酸序列互补的核酸探针在 适合于所述核酸探针与所述稀有细胞特异性核酸序列杂交的条件下温育，以形成双链复合 体；以及 (vi) 检测所述双链复合体，从而检测所述体液样品中所述稀有细胞的存在。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述生物液体是人的体液。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述生物液体是血液、血浆、羊水、尿液或来自绒 毛膜绒毛取样（CVS)活组织检查的细胞悬浮液。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述稀有细胞是胎儿细胞。
20. 如权利要求18所述的方法，其中通过荧光原位杂交（FISH)来检测所述双链复合 体。
21. 如权利要求18所述的方法，其中所述稀有细胞特异性核酸序列是染色体异常的表 征。
22. 如权利要求21所述的方法，其中所述染色体异常是单基因异常。
23. 如如权利要求16所述的方法，其中所述稀有细胞特异性核酸序列是患癌倾向的表 征。
24. 用于从生物液体中捕获、检测和分离稀有细胞的试剂盒，所述试剂盒包括： (i) 固定在基质上的第一抗体，其中所述抗体对于所述稀有细胞的细胞表面抗原是特 异性的；以及 (ii) 以及适合于抗原抗体结合的缓冲溶液。
25. 估算每单位来自哺乳动物的生物液体中的稀有细胞数量的方法，其中所述方法包 括： (i) 提供固定在基质上的抗体，其中所述抗体结合所述稀有细胞的细胞表面抗原相； (ii) 使固定化的抗体与已知单位的生物液体样品接触，其中体液包含多种稀有细胞和 多种其他细胞； (iii) 将所述固定化的抗体与所述单位的体液样品在适合于所述抗体与所述稀有细胞 的细胞表面抗原结合的条件下温育，以形成抗体-稀有细胞复合体； (iv)洗涤所述抗体-稀有细胞复合体，以除去未结合的细胞，并提供固定化的抗体-稀 有细胞复合体；以及 (V)检测所述样品中固定化的抗体-稀有细胞复合体的数量，从而估算每单位所述生 物液体样品中稀有细胞的数量。
【文档编号】G01N33/68GK104364389SQ201280056066
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2012年11月13日 优先权日:2011年11月14日
【发明者】J·科霍斯罗维, L·H·凯尔纳, H·班娜妮 申请人:科勒本斯公司