衍生自黑曲霉的新型葡萄糖氧化酶的制作方法
【专利说明】衍生自黑曲霉的新型葡萄糖氧化酶 发明领域
[0001] 本发明设及新型葡萄糖氧化酶变体。本文提供的葡萄糖氧化酶对于底物葡萄糖特 异性，并且从而显示出显著降低的耗氧率。在另一个方面，本发明提供了葡萄糖氧化酶，其 对于底物葡萄糖特异性，并且从而显示出显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的电子介质 增加的酶促活性。进一步地，本发明设及用于测量葡萄糖的试剂盒和传感器中的所述葡萄 糖氧化酶。
[0002] 特别地，本发明设及衍生自黑曲霉（心公6巧77扣5 如r)的葡萄糖氧化酶，除根据 沈QIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之外，另外具有在选自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ; 和V560的六个位置中的至少一个氨基酸置换。
[0003] 科学背景 糖尿病反映可W在全世界广泛发现的代谢疾病。糖尿病患者具有受损或缺失的激素膜 岛素产生，所述膜岛素控制血糖水平，并且因此在不足够的膜岛素应用的情况下，运些患者 具有高血糖症W及低血糖症的危险你e打心。〇/7ant/化3抑asis〇/化sAe沁S曲加？ and intermediate hyperglycaemia. WHO,and IDF (2006);肥0 Document Production service ISBN 9241594934]。
[0004] 为了确保膜岛素的正确应用，高度特异性、准确和容易处理的葡萄糖测量系统是 自测量系统和临床规模上的高流通量测量系统两者所需的。
[0005] 为了允许血液中的葡萄糖浓度的准确测定并且使得测量高度特异性，设及酶促反 应。目前，在糖尿病分析中使用的两类酶由葡萄糖脱氨酶(下文GDH)和葡萄糖氧化酶(下 义G&k)反巧k [册nes, J.，伽ller,和Surridge, N. (2008).The T'echnology Behind Glucose Meters: Test Strips. DIABETES TECHNOLOGY & T皿RAPEUTICS 10,10-26]。
[0006] GDH的主要优点在于它的氧不依赖性葡萄糖氧化，但该酶显示对某些其他临床相 关糖的轻微副活性，并且因此GDH是非特异性的仍_7別如0177,乂乂游化i打6,乂乂做;. On the mechanism and specificity of soluble,quinoprotein glucose dehydrogenase in the oxidation of aldose sugars. Biochemistry 37，13854-13861]。相之下，GOx 对于葡萄糖高度特异性，但它的氧化是强氧依赖性的/化M左a。5：么，化/知，瓜K，57端'AgA R. S.和Ananthanarayan，L. (2009). Glucose oxidase-an overview. Biotechnology Advances 27,489-501; Bentley, R.和化uberger, A. (1949).The mechanism of the action of notation. Biochem J 45，584-590]。
[0007] 更详细地，G化作为黄素蛋白属于氧化还原酶（即P-D-葡萄糖：氧1-氧化还原 酶）家族。通过采用分子氧作为电子受体，天然或野生型（下文WT)G化催化P-D-葡萄糖 氧化为D-葡糖酸-5 -内醋和&〇2 /参屈嫁妨，化乂度游必邸公6,足."化斯.巧e Oxidation of Glucose and Related Compounds by Glucose Oxidase from Aspergillus 化〇〇/?6化/5的^义旅$*-5'况?7。所述反应由下式描述： D-葡萄糖+ 〇2 -葡糖酸内醋+ &〇2 G化的底物可W分成两组：i)氧化半反应的电子受体，和ii)还原半反应的电子供体， 参嘴獻舰[Leskovac，V.，Trivic，S.，Wohlfalrrt，G.，Kandrac，J?和Pericin，D. (2005) ?GlucoseoxidasefromAspergillusniger:themechanismofactionwithmolecular oxygen，quinones，andone-electronacceptors,IntJBiochemCellBiol37， 7J7-7沉?7。本领域技术人员应认识到，除了D-葡萄糖之外，多种D-葡萄糖衍生物是GOx的 还原半反应的潜在底物。
[000引迄今为止已描述了来自不同起源的GOx。例如，来自海藻皱波角叉莱瓜W化AS。打5'所/5)的6(^在服7,544,795和服6,924,366中得到描述；来自丝状真菌枝抱属物种 (C知施邱ori拙7邱ec.)的GOx在W0 95/29996 ;W0 1998/020136中得到描述；并且来自黄 蓝状菌（沾知巧TC6W 的GOx在US6, 054, 318中得到描述D
[0009] 在文献中最佳描述的GOx来自黑曲霉/觀cAf，原乂，况命孤Ayr梦，公.，侣，原 和Schmid，民.D. (1993) ?The3DstructureofglucoseoxidasefromAspergillus niger.ImplicationsfortheuseofGODasabiosensorenzyme.Biosensors &Bioelectronics8，197-203;Wohlfahrt，G.，Witt，S.，Henclle，J.，Schomburg，D.， Kalisz，H.M?和Hecht，H.J. (1999) ? 1. 8and1. 9Aresolutionstructuresofthe Penici11iumamagasakienseandAspergillusnigerglucoseoxidasesasabasis formodellingsubstratecomplexes.ActaCrystallographicaSectionDBiological Ciystallography55,969-977]。
[0010] W089/126675描述了在重组系统中来自黑曲霉的GOx的生产，并且wo 2008/079227A1涉及在赋予改善的胆存稳定性的组合物中配制的得自黑曲霉的GOx。
[0011] 它是充分表征的蛋白质，形成大小160kDa的二聚体，并且其晶体结构已得到解决 [Hecht，比J.等人，Crystal-StructureOfGlucose-OxidaseFromAspergillus-Niger RefinedAt2. 3AngstromResolution.JournalOfMolecularBiology，1993. 229(1): 第 153-172页]。
[001引进一步已知，特别地，黑曲霉的野生型GOx(下文GOx-WT)显示出显著的温度稳定 性和对于底物葡萄糖的特异性。GOx是具有10-16%的高甘露糖型碳水化合物含量的糖蛋 皆化ayashi，S.和Nakamura，S. (1981) ?Multipleformsofglucoseoxidasewith differentcarbohydratecompositions.BiochimBiophysActa657,40-51;Pazur，J, H.，Kleppe，K.和Cepure，A. (1965).Aglycoproteinstructureforglucoseoxidase fromAspergillusniger.ArchBiochemBiophys111，351-357]。
[0013] 目前，GOx通常用于检测工业溶液或受试者体液(例如血液和尿）中的葡萄糖的生 物传感器中。
[0014] 目前可用的自测量装置中的大多数是原则上由下述组成的电化学传感器： a) 生物组分，即具有葡萄糖作为底物的各种酶， b) 指示器（电子元件)，和 C)信号转换器。
[0015] 在测量装置中，来自葡萄糖的电子经由介质通过生物组分（a)转移到电极（b)。信 号转换器（C)随后将电子信号转换成实时葡萄糖浓度，其与转移的电子量成比例。
[0016] 除了上述电化学传感器之外，还存在可用的光测传感器。此处的差异是来自葡萄 糖的电子转移到氧化还原指示剂染料(充当指示剂)。光度测量所得到的还原染料的变色。
[0017] 另一种主要应用可能变成(X)x在植入和小型化的生物燃料电池的阳极区室中的 用途，所述生物燃料电池燃烧来自血流的葡萄糖，并且从而给微型诊断装置或累提供动力。
[0018] 此外，G化在食品工业中的应用是众多的，因为它生成过氧化氨的能力，所述过氧 化氨具有抗微生物效应，可W用于改善某些食物产品的胆存稳定性，所述食物产品包括例 如奶酪、黄油和果汁。
[0019] G化在化妆品组合物中的应用同样可W利用抗微生物特性。己糖氧化酶在药物和 化妆品组合物中的潜在用途例如在S6, 924, 366;US6, 251，626和W0 2007/045251A2中 提出。
[0020] 此外，G化的用途在转基因植物及其他生物的生产中提出，所述转基因植物及其他 生物对于害虫或疾病具有降低的敏感性或增加的抗性(参见例如W0 1995/021924)。
[0021] 然而，依照本发明，G化在葡萄糖生物传感器中的用途具有显著兴趣。在运点上， W0 2009/104836A1描述了葡萄糖传感器，其包含就其附着至金属表面而改善的遗传改造 的(X)x变体。
[0022] Zhu等人在2006和2007年描述了在T30V和/或I94V中突变的衍生自黑曲霉 的(X)x突变体。因此，相应的双重突变体T30V;I94V也已得到描述如/，么，必(畑細，C， Zakhartsev，M.和Schwaneberg，U. (2006).Makingglucoseoxidasefitforbiofuel cellapplicationsbydirectedproteinevolution.BiosensorsandBioelectronics 21,2046-2051;化u,Z. ,Wang,M. ,Gau化m,A.,化zor,J. ,Momeu,C. ,R,P. ,andU,S. (2007).DirectedevolutionofglucoseoxidasefromAspergillusnigerfor ferrocenemethanol-mediatedelectrontransfer.BiotechnologyJournal2,241-248] (下文Zhu等人（2006/2007)。
[002引具体地，具有置换T30V和I94V的上述双重突变体在酶活性中轻微增加（keat从 69. 5/s到137. 7/s)，与(X)x-WT相比较，显示出在58°C至62°C范围内增加的热稳定性，化及 在8至11范围内改善的抑稳定性。然而，与GOx-WT相比较，所述衍生自黑曲霉的双重突 变体显不出相等的耗氧率。
[0024] EP2 415 863A1描述了核酸分子及其多肤，其具有(X)x活性，但在下述氨基酸 位置2、13、30、94和152中的至少S个中突变。特别地，除在酿酒酵母巧rces cereWsiae)中增加的表达水平之外，还具有置换N2Y、K13E、T30V、I94V和K152R的EP2 415 863A1的M12变体显示出对于作为电子受体的氧增加两倍的活性。
[0025]Hora邑uchi等K阳oraguchi,Y.，Saito,S.，Ferri,S.，Mori,K.，Kojima, K. ,Tsugawa,W.和Sode,K. (2012).TurningGlucoseOxidaseintoEssentially Dehydrogenase.Meet.Abstr. ,]hhmeMA2012-02,Is洲e18,Pages2057]化年 鉴定了设及本文描述的(X)x变体的氧化半反应的一个氨基酸残基位置，它是尼崎青霉 (化曲洗S3心ease)的GOx和黑曲霉的GOx变体。所述一个位置是尼崎青霉GOx 变体的S114和黑曲霉变体的相应T110。两个位置均替换为氨基酸丙氨酸，导致对于作为电 子受体的氧活性中的减少。例如，黑曲霉的(X)x变体显示出降低6. 6倍的耗氧量，并且因此 除363%的介质活性之外，还具有30. 4%的残留氧活性。
[002引本发明的根本问题 对于葡萄糖非特异性的GM1和氧依赖性的(X)x代表目前葡萄糖测量系统的关键酶。
[0027] 在本公开内容的上下文中，表达"对于葡萄糖非特异性"、"氧依赖性的"和"氧依赖 性"具有如定义部分中所述的含义。
[0028] 本发明的根本问题的解决方案 本发明的根本问题的解决方案是提供衍生自真菌黑曲霉的特别修饰且因此优化的GOx变体。
[0029] 令人惊讶和出乎意料地，本发明人已发现衍生自黑曲霉的新型(X)x变体对于葡萄 糖特异性，但不依赖于氧用于葡萄糖氧化且因此对于葡萄糖测量更准确。
[0030] 此外，令人惊讶和出乎意料地，本发明提供了新型(X)x变体，其对于葡萄糖特异 性，并且从而显示出显著降低的耗氧率和/或对于除氧外的电子介质显著增加的介质活 性。
[003。 本发明的主题是新型6化变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和I94V之 夕b其另外具有在选自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六个位置中的至少一个氨基 酸置换。
[0032] 在本公开内容的上下文中，表达"对于葡萄糖的酶特异性"或"对于葡萄糖特异性" 指示：当通过如条目ff)下的材料与方法中概述的介质测定进行测定时，本文提供的(X)x对 于底物葡萄糖〉99. 5%或〉99. 9%，特别是100%的活性。言下之意，当通过如条目ff)下的 材料与方法部分中概述的介质测定进行测定时，本文提供的(X)x对于除葡萄糖外的糖例如 半乳糖、麦芽糖、木糖和麦芽=糖的残留活性< 6%。
[0033] 在本公开内容的上下文中，表达"显著降低的耗氧率"指示：当如根据条目gg)下 的材料与方法部分中概述的ABTS测定，通过生色底物ABTS的氧化间接测定氧依赖性时，本 文提供的(Xk变体经过3分钟的时间段〉95%的残留氧含量。
[0034] 在本公开内容的上下文中，表达"显著降低的氧活性"或"对于作为电子受体的氧 显著降低的活性"指示：当通过如条目gg)下的材料与方法部分中概述的ABTS测定进行测 定时，特征在于残留氧活性《30%、或< 25%、或< 20%，特别是< 15%、或《10%的(X)x活 性。
[0035] 在本公开内容的上下文中，表达"显著增加的介质活性"或"对于除氧外的电子介 质显著增加的活性"指示：当通过如条目ff)下的材料与方法部分中概述的介质测定进行 测定时，特征在于根据SEQIDNO: 1的葡萄糖氧化酶对于除氧外的电子介质增加至少1.5 倍的活性的(X)x活性。
[0036] 因此，本发明的优化(X)x变体适合于植入改善的血糖测量系统中。
[0037] 发明概述 令人惊讶和出乎意料地，本发明人发现如Zhu等人（2006 ;2007)中描述的(X)x双重突 变体T30V;I94V(下文缩写为G0X-T30V;I94V)，适合作为进一步的特异性氨基酸置换的基 础，W获得氧不依赖性(X)x变体，其具有显著降低的氧化酶活性和伴随的显著增加的脱氨 酶活性，同时保留对于底物葡萄糖的特异性。进一步地，本发明人发现依照本发明的(X)x变 体另外或单独对于除氧外的电子介质显示出显著增加的介质活性。在运点上，本发明人还 发现依照本发明的(X)x变体接受除氧外的某些电子介质用于电子转移。因此，依照本发明 的GOx变体适合于改善的葡萄糖测量，特别是改善的血糖测量。
[0038] 在本公开内容的上下文中，表达"接受除氧外的某些电子介质用于电子转移"指 示：本文提供的(X)x变体与选自下述的介质相互作用且因此接受所述介质用于介导电子转 移的能力：亚硝基苯胺及其衍生物、偶氮化合物、吩嗦及其衍生物、吩嚷嗦及其衍生物、吩嗯 嗦及其衍生物、二茂铁及其衍生物、铁氯化钟、Ru-和Os-络合物、酿及其衍生物、吗I噪酪、紫 精、四硫富瓦締及其衍生物和献菁。
[0039] 本发明设及衍生自黑曲霉的(X)x变体，除根据SEQIDNO: 1的两个置换T30V和 I94V之外，其另外具有在选自S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六个位置中的至少一 个氨基酸置换。
[0040] 在另一个方面，本发明设及衍生自黑曲霉的(X)x变体，除根据SEQIDNO: 1的两 个置换T30V和I94V之外，其另外具有在选自A173 ;A332 ;F414 ;和V560的四个位置中的至 少一个氨基酸置换。
[0041] 在进一步方面，本发明设及(X)x变体，其具有在选自根据SEQIDNO: 1的(X)x的 S53 ;A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六个位置中的至少两个、或S个、或四个、或五个或 甚至六个协同且因此不同的氨基酸置换，导致耗氧率中的显著减少。
[0042] 进一步地，本发明设及(X)x变体，其具有在选自根据SEQIDNO: 1的(X)x的S53 ; A137 ;A173 ;A332 ;F414 ;和V560的六个位置中的至少两个、或S个、或四个、或五个或甚至 六个协同且因此不同的氨基酸置换，导致显著减少的耗氧率和/或对于除氧外的某些电子 介质显著增加的介质活性。
[004引因此，本发明的发明人已能够提供(X)x变体，与GOx-WT和根据SEQIDNO: 1的G化-T30V;I94V相比较，其氧化酶活性显著降低，同时与(X)x-WT和GOx-T30V;I94V相比 较，该酶的脱氨酶活性显著增加。
[0044] 在运点上，进一步出乎意料和令人惊讶的发现是：当在如条目gg)下的材料与方 法部分中概述的ABTS测定中，与GOx-WT和G0X-T30V;I94V相比较时，在位置F414和V560 中的特异性氨基酸置换显著降低本文提供的(X)x变体的耗氧率。用于所述置换的合适氨 基酸是所有剩余19种蛋白源氨基酸。特别地，合适的氨基酸是用于位置F414的Arg、Asn、 Asp、切S、Gly、His、Met、lie、Leu、Ser、1"虹、Tyr和Val，W及用于位置V560 的Ala、lie、 Leu、Met、Pro、Tyr、T虹和Val。
[0045] 作为另一个出乎意料和令人惊讶的发现：当与(X)x-T30V;I94V相比较时，除本文 提