专利名称：一种黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺。
背景技术：
α-半乳糖苷酶是一种催化α-半乳糖苷类物质分解成低聚寡糖、蔗糖及果糖等单糖的酶类，广泛存在于微生物、植物、动物中。α-半乳糖苷酶在食品、医药工业各方面都具有很重要的应用价值。在甜菜制糖工业中，糖蜜中的棉子糖经α-半乳糖苷酶分解，不仅能提高产率，还能提高提高效率。此外，在医药上和多糖树胶的改性上也有着广泛的应用。近年来研究表明，该酶作为一种特异性外源饲用酶，在饲料工业中也有着广泛的应用前景。在豆类籽实和饼粕饲料中有较高的α-半乳糖苷类物质的存在，这类物质不仅降低了饲料的营养价值，而且在动物后肠中易引起食糜滞留，导致肠道胀气，消化紊乱，引发胰腺增大、下痢等疾病。在以豆饼、杂粕等为日粮的饲料中添加α-半乳糖苷酶和其他酶协同作用，可有效提高饲料的利用率，消除由α-半乳糖苷类物质引起的抗营养作用。具有高活性的α-半乳糖苷酶生产菌的选育及高效能的发酵工艺是提供廉价α-半乳糖苷酶制剂，使该产品实行产业化生产的关键前提。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺陷，提供一种黑曲霉变种及其在固态基质上的发酵工艺。
本发明解决其技术问题采用的技术方案。本发明所述的为一种黑曲霉变种(Aspergillusnuger v.Tiegh)，孢子黄褐色，于2004年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1182。
本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶的黑曲霉变种的生物学特性为，菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45-70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0微米，瓶梗6-9×2.5-3.0微米，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5微米，壁粗糙。
本发明提供的黑曲霉变种，采用固态发酵工艺，可产生高活性的α-半乳糖苷酶。该发酵工艺具有原材料易得，工艺简单，酶活性高、单位酶活生产成本低廉的特点。可有效分解富含饼粕饲料中的α-半乳糖苷类物质，提高畜禽生产性能。
本发明的黑曲霉变种的诱变选育过程为1.出发菌株的选择本单位保存若干黑曲霉菌种以及从中科院微生物所、中科院土壤所、上海工业微生物所引进的若干分枝犁头霉、蝇卷霉等菌种及从土壤样本中分离获得的不同菌属的菌种，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株代号为R15#的黑曲霉菌株产α-半乳糖苷酶活性最高，达83U/g干基。选定该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株。
2.菌株的复合诱变选育将在马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的R15#菌株的新鲜孢子，用无菌水洗下，并制成单孢子悬浮液(孢子浓度在107-108个/ml)。分别取2ml单孢子悬浮液于试管，置钴源室进行辐照处理。处理剂量为0(ck)，3Mraed，5Mraed，7Mraedt 10Mraed。经Co60辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，逐步稀释101、102、103、104、105、106、107倍，涂布于PDA平板培养基上，每个稀释度3个平板，28-30℃下培养72-96小时后，挑取不同形状的单孢菌落于PDA斜面，在28-30℃下培养72-96小时后，进行诱变菌种的三角瓶固体发酵的初筛、复筛，获得目的菌株RC32#，酶活达125U/g干基。
进一步将RC32#菌进行多次紫外线照射和亚硝基胍复合诱变，获得一株黑曲霉变种RM45#，产酶活性达175U/g干基。
所述的斜面保藏培养基为马铃茹葡萄糖琼脂(PDA)去皮马铃茹20克切成小块后加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml。
所述的筛选用固体发酵培养基为麸皮85％，豆粕13％，无机盐2％。加水使含水率达到55％-60％。
本发明的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种可运用固体发酵工艺，制备出高效能的α-半乳糖苷酶制剂应用于饲料工业或制糖工业。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案。利用本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，其固体发酵生产α-半乳糖苷酶的制备工艺流程为1.将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，成熟(长出丰满孢子)后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用。
所述PDA斜面为马铃茹葡萄糖琼脂培养基，其组成为去皮马铃茹20克切成小块，加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml。
2.将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌。冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72-96小时。成熟(长出丰满孢子)后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用。
所述的产酶种子培养基为麸皮99％，(NH4)2SO41％，加水使培养基含水率达55％-60％。
3.发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养3d；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
所述的后处理是1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。2)、.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。
所述的发酵培养基为麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH4)2SO43％，产酶诱导剂4％，加水使培养基含水率达55％-60％。
本发明有益的效果是利用本发明提供的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，采用上述固体发酵法生产α-半乳糖苷酶，其发酵产物(干曲)的酶活平均可达286IU/g，最高可达345IU/g，比国际上同类产品酶活44-56IU/g，高出5倍，比国内报导的同类技术生产的产品酶活126IU/g，高出2.26倍。
保藏说明保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所(100080)
保藏日期2004年6月24日保藏编号(CGMCC NO)1182分类命名黑曲霉请求保藏人浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步介绍实施例1一、菌种培养1、斜面菌种培养将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为107-108个/ml)，待用。
2.固体种子培养将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH4)2SO4溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。
3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。
二、产酶发酵培养1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为107-108个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。
2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH4)2SO43％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气半装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。
3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
三、后处理1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。
2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。
四、结果每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下批次酶活(IU/g)No1 263No2 251No3 284平均266实施例2一、菌种培养1、斜面菌种培养将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为107-108个/ml)，待用。
2.固体种子培养将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH4)2SO4溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。
3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。
二、产酶发酵培养
1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为107-108个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。
2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH4)2SO43％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30mi n灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。
3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
三、后处理1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。
2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。
四、结果每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下批次酶活(IU/g)No1 285No2 345No3 312平均314实施例3一、菌种培养1、斜面菌种培养将本发明的黑曲霉变种RM45#接种在马铃茹葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，待长出丰满黄褐色孢子后，用无菌水制成孢子悬浮液(浓度为107-108个/ml)，待用。
2.固体种子培养将1.5kg麸皮以1∶1.2-1.5的比例加入1％的(NH4)2SO4溶液，充分混匀后，制成固体种子培养基。该培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，充分搅拌均匀，按每瓶500ml三角瓶装入30克含水且接种的培养基。
3.接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72小时。待培养基表层和内部长出丰满黄褐色孢子后，取出，置4℃冰箱，待用。
二、产酶发酵培养1、取培养成熟待用的固体种子三角瓶，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到菌种孢子悬浮液。再用无菌水稀释成孢子浓度为107-108个/ml的产酶菌种孢子悬浮液。
2.将发酵培养基按麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH4)2SO43％，产酶诱导剂4％的比例充分混合，加水使培养基含水率达55％-60％，配制成产酶发酵培养基，装入由二层棉布缝制的布袋。该产酶发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入无菌透气方盘(60cm×40cm×10cm)，并用保湿透气半装置盖于方盘上，以控制培养过程的温、湿度。
3.将接种后的方盘置于30℃培养恒温条件下培养65-72小时。发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h翻曲一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
三、后处理1.发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。
2.烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲。并按所述酶活性试验方法检测。
四、结果每批发酵产物按四分法取样，共取样品三批次，按本发明所述α-半乳糖苷酶活性测定方法，测定三批次的酶活，结果如下批次酶活(IU/g)
No1279No2265No3296平均 280采用对硝基苯酚法测定所得α-半乳糖苷酶制剂中的α-半乳糖苷酶活性的方法如下一、酶活单位定义在pH4.0、40℃条件下，每分钟降解对硝基酚α-D-吡喃半乳糖苷释放出1μmol对硝基酚的酶量为1个α-半乳糖苷酶活单位，简称为IU。
二、仪器设备UV1100紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器厂)、恒温水浴锅、酸度计(精度±0.01pH)、分析天平(感量0.1mg)、秒表或定时钟。
三、试剂1、对硝基酚(p-NPH)标准溶液精确称取对硝基酚(简称p-NPH，Sigma公司出品，批号117H5057)100mg，用蒸馏水溶解，并定容至100ml。然后配制成浓度分别为0，10μg.mL-1，20μg.mL-1，30μg.mL-1，40μg.mL-1，50μg.mL-1的对硝基酚标准溶液以制成标准曲线。
2、对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖(p-NPG)溶液(Fluka公司出品，批号WA13251)精确称取对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖150.5mg，用蒸馏水溶解，定容至100ml。冷冻保藏。
3、0.5M Na2CO3溶液精确称取无水碳酸钠53克，用蒸馏水溶解，定容至1000ml。
4、pH 4.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液甲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
乙液称取柠檬酸(C6H8O7.H2O)21.01g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。.
使用溶液取甲液385.5ml，加乙液614.5ml混合均匀，用pH计校正至pH为(4.0±0.05)，备用。
5、酶液制备称取酶干曲2.000克，加蒸馏水40ml，于40℃浸泡30min，期间搅拌3-4次。然后用蒸馏水定容至100ml，用新华1号滤纸过滤，取滤液用于测定酶活。
四、测定方法1、对硝基酚标准曲线绘制分别吸取不同浓度的对硝基酚标准溶液0.5ml(每号作3支平行管)，加pH4.0缓冲液1.5ml，0.5M Na2CO3溶液2.0ml。充分发摇匀后，以0.5Ma蒸馏水代替对硝基酚标准溶液的试管为空白，于分光光度计在吸光度为400nm处，用5mm比色皿比色。以吸光度(OD值)为横座标，以对硝基酚浓度为纵坐标，绘制标准曲线，或计算K值。
2、测定步骤吸取经适当稀释的待测酶液0.5ml加pH4.0缓冲液1.0ml，于40℃水浴预热5min，底物也同时预热。加入5m mol/L的p-NPG底物0.5ml于各试管中，立即计时。精确反应10min，立即加入0.5M Na2CO3溶液2.0ml中止反应。取出，于分光光度计400nm处比色.(用5mm比色皿)。空白管在加入酶液和缓冲液后，即加入2ml 0.5M Na2CO3，反应结束后再加入0.5ml底物。
1.3.2.3计算由比色测获得的ABS(OD)值，以回归计算法，(或用K值)按下式计算α-半乳糖苷酶活力A2(IU.g-1)A=[(Ax-A0)×K+C0]×Nt×W×139]]>式中Ax----样品吸光度OD值，A0----空白管吸光度OD值，K----对硝基酚标准曲线斜率， C0---对硝基酚标准曲线截距，N---样品总稀释倍数，t----反应时间，W称取酶制剂的重量(g)，139----对硝基酚分子量。
权利要求
1.一种黑曲霉变种，其特征在于，为一种黑曲霉变种(Aspergillus nuger v.Tiegh)，孢子黄褐色，于2004年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCCNo.1182。
2.根据权利要求1所述的高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种，其特征在于，该高活性α-半乳糖苷酶黑曲霉变种的生物学特性为菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45-70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450微米；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20微米，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70微米，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0微米，瓶梗6-9×2.5-3.0微米，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5微米，壁粗糙。
3.一种根据权利要求1所述黑曲霉变种在固态基质上的发酵工艺，其特征在于1)、将上述的黑曲霉变种接种在PDA斜面上，于28-30℃下恒温培养72-96小时，长出丰满孢子即成熟后，用无菌水制成孢子悬浮液，待用；其中PDA斜面为马铃茹葡萄糖琼脂培养基，其组成为去皮马铃茹20克切成小块，加水100ml煮沸30min，四层纱布过滤后，加入葡萄糖2克，琼脂2克，并补足水分至100ml；2)、将产酶种子培养基经121℃，30min灭菌；冷却后，按1-5％量接入斜面菌种孢子悬浮液，最后接种后的固体种子培养基，于28-30℃下恒温培养72-96小时；长出丰满孢子即成熟后，注入冷却的无菌水充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种孢子悬浮液，待用；所述的产酶种子培养基为麸皮99％，(NH4)2SO41％，加水使培养基含水率达55％-60％；3)、发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入产酶种孢子悬浮液，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶，于30℃培养3d；发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束；其中的发酵培养基为麸皮75％，豆粕粉15％，鱼粉3％，(NH4)2SO43％，产酶诱导剂4％，加水使培养基含水率达55％-60％。
4.根据权利要求3所述黑曲霉变种在固态基质上的发酵工艺，其特征是进行后处理工序，具体为1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干；2)、烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，得酶干曲；并按所述酶活性试验方法检测。
全文摘要
本发明涉及一种黑曲霉变种，孢子黄褐色，于2004年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会，其保藏号为CGMCC No.1182。该菌种的生物学特性为菌落在查氏培养基上生长适度，25℃，7天，直径45－70mm；质地绒毛状或稍带颗粒状；分生孢子结构大量，浅褐色，无渗出液；菌落反面略带黄色。本发明有益的效果是利用本发明提供的高活性α－半乳糖苷酶黑曲霉变种，采用固体发酵法可产生高活性的α－半乳糖苷酶，其发酵产物(干曲)的酶活平均可达286IU/g，最高可达345IU/g，比国际上同类产品酶活44－56IU/g，高出5倍，比国内报导的同类技术生产的产品酶活126IU/g，高出2.26倍。
文档编号C12R1/685GK1884478SQ20061005248
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者许尧兴, 许少春, 李艳丽, 姚晓红, 李孝辉 申请人:浙江省农业科学院