一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种评价黑曲霉麸曲孢子活力的方法。
【背景技术】
[0002] 柠檬酸（Citric Acid)是一种具有多种功能的重要有机酸，广泛应用于食品、医 药、化工等领域；是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸，全球产量超过170万吨。 同时，柠檬酸又具有优良的生物特性，在生物聚合、药物运输、细胞培养等新兴产业领域有 巨大的应用潜力，其需求量以每年5%的速度增长。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)是一类重要的工业微生物，由于具有酶系安全，利用 碳源种类多，产酸能力强，耐酸能力较强等优点而备受柠檬酸产业的亲睐。工业化生产中， 一批成熟的黑曲霉孢子需要经过试管斜面培养、茄子瓶培养、麸曲桶等方式逐级扩大培养。 由于孢子活力缺乏有效的考察标准，一般通过将其转接发酵培养基，通过比较发酵产酸效 果，以此来作为传代扩大培养的指标；但这种方法所需周期较长、工作量相对较大，缺乏系 统性和规范性，同时延长了孢子培养周期。
[0004] 目前，关于细胞活力评价方法主要集中在生物医学工程方面，检测细胞的生长和 增殖，新药筛选、细胞毒性试验等，价格低廉成为细胞活性检测的主要方法。常用的方法有 MTT法，FCM法，ATP法等，测定的基本原理主要利用了细胞膜的完整性和新陈代谢的能力。 但这些检测方法存在操作流程较长，反应试剂需要现用现配，像MTT具有致癌性，仪器价格 昂贵等缺陷。
[0005] 麸曲孢子为黑曲霉特殊的休眠体，孢子壁较厚且通透性差，外源物质难于介入；同 时孢子之间作用力较强，孢子粘附在一起，很难形成分散均匀的单孢子；因而，关于黑曲霉 麸曲孢子活力研宄鲜有报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价 方法。本发明可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；其它微生物孢子活力评 价，均适用本技术。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法，包括如下步骤：
[0009] (1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过 滤，获得黑曲霉麸曲孢子悬液；
[0010] ⑵在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加〇. 05% (v/v)的吐温80,同时在超声波清洗仪 中处理，获得分散均匀的单孢子悬液，并调节孢子悬液浓度为1〇6~10 7个/mL ;
[0011] ⑶用磷酸缓冲液配置8~14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液；
[0012] (4)将步骤⑵与⑶的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均勾，并用盖 子密封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线；
[0013] (5)测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。
[0014] 步骤⑴与（3)缓冲液pH范围为6. 5~9. 0。
[0015] 步骤（2)超声波清洗仪处理时间为30~120s。
[0016] 亚甲基蓝用刃天青或其他还原性染料代替。
[0017] 本发明有益的技术效果在于：
[0018] 本发明技术目的是针对柠檬酸生产菌种的黑曲霉麸曲孢子逐级扩大培养存在流 程复杂、周期长、孢子活力筛选工作量大等问题，提供一种评价黑曲霉麸曲孢子活力评价方 法，提高种子活力，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率。
[0019] 亚甲基蓝染色法可对酵母细胞进行活性检测，活细胞中的还原酶能使浸入细胞内 的亚甲基蓝脱色，但死细胞由于酶失活，不发生脱色作用而保留初始的蓝色。本发明在黑曲 霉麸曲孢子悬液中添加吐温80分散孢子，在超声波清洗仪中处理进一步分散孢子，同时能 够疏松孢子壁提高通透性，从而便于基于亚甲基蓝还原性的特点，建立一种评价黑曲霉麸 曲孢子活力的方法。
[0020] 本发明相比于现有技术所具有的优点有：
[0021] (1)本发明能够定量直接反应孢子活力，具有准确度高，检测速度快，安全无毒，对 设备要求低和成本低廉等优点；
[0022] (2)提高种子活力，同时可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；
[0023] (3)可以解决传统孢子活力评价方法孢子活力筛选工作量大，灵敏度低，无需严格 的无菌操作，易受杂菌污染影响，周期长等缺点，提高活力检测针对性。
【附图说明】
[0024] 图1为实施例1不同活力的孢子与吸光度变化量曲线。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例，对本发明进行具体描述。在下面所有的实施方案中，孢子计数采 用血球计数板。孢子活力检测采用亚甲基蓝褪色程度表征，通过吸光度的变化表征活力。其 它无特殊说明，均采用本领域常用的知识和方法。下面实施例中的黑曲霉种子的来源是江 苏国信协联能源有限公司生产菌种。
[0026] 实施例1 :
[0027] 配置PDA平板，试管斜面和茄子瓶培养基。玉米芯颗粒与水按照1:1比例混合均 匀，添加玉米浆调节总氮量含量（TN = 1%~3% )，灭菌，获得麸曲桶培养基。黑曲霉菌种 接种于PDA平板培养基活化，35~38°C培养箱培养40~48h ;挑取单菌落接种试管斜面， 35~38°C培养箱，培养5~7天，获得成熟的黑曲霉孢子；挑取一环试管斜面孢子，接种前 子瓶培养基，35~38°C培养8~10天，获得成熟的黑曲霉孢子；无菌水清洗茄子瓶孢子，获 得孢子菌悬液，转接麸曲桶，每天翻桶2~3次，35~38°C培养8~10天，获得成熟的黑曲 霉麸曲孢子。
[0028] 取一定量的麸曲孢子，用pH 7. 0的磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤玉 米芯颗粒。在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05% (v/v)的吐温80,在超声波清洗仪中处理 30s，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子浓度107个/mL。取新鲜孢子液与灭活处理后的 孢子液分别按照 0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6 :4、7:3、8:2、9:1、10:0 比例混合均匀，配置 不同活力的孢子悬液。
[0029] 分别取lmL上述孢子悬液与lmL的8mg/L亚甲基蓝溶液于比色皿中，盖上比色皿 盖，反应420s，于663nm波长处吸光度-时间扫描曲线，测定反应体系初始与反应结束的吸 光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。获得不同活力孢子与吸光度的变化量如图1所 述。
[0030] 从图1中可以看出，随着体系中孢子活力（即活孢子浓度）增加，其对亚甲基蓝的 褪色反应程度越剧烈，亚甲基蓝的褪色程度AA与体系中鲜活孢子含量之间存在较好的线 性相关（y = 〇. 008x+0. 227, R2= 0. 995)。由此可以说明，亚甲基蓝的褪色程度，可以很好 的反映体系中细胞的活力情况。
[0031] 实施例2
[0032] 配置PDA平板，试管斜面和茄子瓶培养基。玉米芯颗粒与水按照1:1比例混合均 匀，添加玉米浆调节总氮量含量（TN = 1%~3% )，灭菌，获得麸曲桶培养基。黑曲霉菌种 接种于PDA平板培养基活化，35~38°C培养箱培养40~48h ;挑取单菌落接种试管斜面， 35~38°C培养箱，培养5~7天，获得成熟的黑曲霉孢子；挑取一环试管斜面孢子，接种前 子瓶培养基，35~38°C培养8~10天，获得成熟的黑曲霉孢子；无菌水清洗茄子瓶孢子，获 得孢子菌悬液，转接麸曲桶，每天翻桶2~3次，35~38°C培养8~10天，获得成熟的黑曲 霉麸曲孢子。
[0033] 取一定的麸曲孢子，用pH 9. 0的磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤玉米 芯颗粒。在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0.05% (v/v)的吐温80,在超声波清洗仪中处理 120s，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子浓度107个/mL。取5mL新鲜麸曲孢子悬液，依 次向试管中加入0、1、2、3、4、51^加热杀死的孢子悬液，剩余体积用口119.0的磷酸缓冲液补 充，定容体积10mL，配置同等活力、不同浓度的麸曲孢子悬液。
[0034] 分别取lmL上述孢子悬液与lmL的12mg/L亚甲基蓝溶液于比色皿中，盖上比色皿 盖，反应420s，于663nm波长处吸光度-时间扫描曲线，测定反应体系初始与反应结束的吸 光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。获得同等活力、不同浓度的麸曲孢子悬液与吸光 度的变化量如表1所述。从表1中可以看出，同等活力孢子、不同浓度的麸曲孢子悬液的褪 色程度基本是一致的。由此可以说明，亚甲基蓝的褪色程度，可以很好的反映体系中细胞的 活力情况。
[0035] 表1同等活力孢子的亚甲基蓝还原反应
【主权项】
1. 一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗麸曲孢子，用三层纱布过滤，获 得黑曲霉麸曲孢子悬液； (2) 在黑曲霉麸曲孢子悬液中添加0. 05% (v/v)的吐温80,同时在超声波清洗仪中处 理，获得分散均匀的单孢子悬液，并调节孢子悬液浓度为IO6~10 7个AiL; (3) 用磷酸缓冲液配置8~14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液； (4) 将步骤⑵与（3)的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均勾，并用盖子密 封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线； (5) 测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)与（3)缓冲液pH范围为6. 5~ 9. 0 〇
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)超声波清洗仪处理时间为30~ 120s〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于亚甲基蓝用刃天青或其他还原性染料代 替。
【专利摘要】一种黑曲霉麸曲孢子活力的评价方法：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，用磷酸缓冲液清洗，过滤，获得黑曲霉麸曲孢子悬液；(2)添加0.05％(v/v)的吐温80，超声波处理，获得分散均匀的单孢子悬液，调节孢子悬液浓度为106～107个/mL；(3)用磷酸缓冲液配置8～14mg/L浓度的亚甲基蓝溶液；(4)将步骤(2)与(3)的溶液按照v/v为1:1的比例于比色皿中混合均匀密封，反应420s，于663nm波长处扫描吸光度-时间曲线；(5)测定反应体系初始与反应结束的吸光度，以吸光度的变化表征细胞活力大小。本发明可以有效缩短成熟种子培养时间，提高原料利用率；其它微生物孢子活力评价，均适用本技术。
【IPC分类】C12R1-685, C12Q1-02
【公开号】CN104789635
【申请号】CN201510224891
【发明人】石贵阳, 王宝石, 张 杰, 胡志杰, 蒋小东, 孙福新, 张梁, 李由然, 丁重阳, 李赢, 顾正华
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月5日