一种棘孢曲霉菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
【背景技术】
[0002] β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC 3. 2. L 21)，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水 解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相 应的配基，这种酶存在于许多植物体，还存在于一些酵母、霉菌、木霉菌属及细菌甚至是昆 虫体内。β-葡萄糖苷酶可以将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质β-糖苷水解为具有浓 郁天然风味的香气物质。
[0003] 葡萄糖苷酶的可运用领域广泛：可以用在果汁行业用于增香脱苦，很多果汁 中含有很多风味前体物质一一 β -糖苷，只要通过一些酶的作用就能使这些糖苷配基挥发 释放，起到增香的作用，在众多的研宄中发现，棘孢曲霉产的葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、 茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研宄的热点，对于脱苦的原理和增香 类似，例如在青梅汁中，葡萄糖苷酶可以将其中的苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分 子的葡萄糖，这就使青梅的苦味大大减少；葡萄糖苷酶的脱苦还可以用在柑橘、橄榄等具有 一定苦味的水果中。
[0004] 另外，还可以用于一些糖苷类前体的分解来生产分解后产物，例如低聚龙胆糖的 生产、大豆异黄酮的生产，这两种产物的前体都是以结合型的糖苷形式存在。除了以上这些 领域，β-葡萄糖苷酶的应用领域还很宽泛，比如制造生物酒精，通过基因技术来达到防治 病虫害的目的，以及一些天然染料的生产，动物饲料的生产甚至是医药领域。
[0005] 现有技术中产β -葡萄糖苷酶的棘孢曲霉菌株胞外β -葡萄糖苷酶活性不高，本 申请的发明人获得一株具有较高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一株具有较高胞外β -葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。
[0007] 本发明另一个目的是提供该棘孢曲霉菌株在产生葡萄糖苷酶中的应用。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 一种棘孢曲霉菌株，该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉（Aspergillus sp.)BG30,保 藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No. 7799。
[0009] 本发明棘孢曲霉菌株的菌落形态特征：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25°C黑暗 条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初 期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8. 5-11. 0 μ m，褐色，壁光滑，顶囊球 形，直径33-42 μ m，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10* μ m，分生孢子椭圆形，少数球 形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0 μ m，未见有性孢子。
[0010] 所述棘孢曲霉菌株应用于β-葡萄糖苷酶中的生产，具体包括以下步骤： (1) 将曲霉（Asper价7Λλ5 5/7. ) BG30接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子； (2) 将种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β -葡萄糖苷酶粗酶 液，所述粗酶液经过分离、纯化获得β-葡萄糖苷酶。
[0011] 培养条件影响棘孢曲霉菌株的繁殖，进而影响其生产β-葡萄糖苷酶的能力，步 骤（1)中增殖培养的条件为温度28~34°C，培养时间56~150h ;步骤（2)中发酵培养的条件 为温度28~34°C，培养时间56~150h。
[0012] β -葡萄糖苷酶作为胞外产物，发酵完成后，β -葡萄糖苷酶存在于发酵液中，通 过常规的酶分离纯化方法即可分离纯化获得高酶活的β-葡萄糖苷酶。
[0013] 培养基的种类也是影响棘孢曲霉菌株繁殖的重要条件，步骤（1)中斜面培养基的 组成为：葡萄糖2. 0-5. 0g，氯化钠3. 0g，硝酸钾3. 0g，磷酸氢二钾0. 06g，硫酸铜0. 004g，麸 皮10. 0g，酒石酸钾钠0. 005g，氯化铁0. 005g，硫酸锰0. 005g，琼脂20. 0g，乳糖0-10. 0g，蒸 馏水lOOOmL，pH值5. 5~6. 0,所述斜面培养基配置好后于0. 08Mpa灭菌20min，划线接入曲 霉BG30进行培养。
[0014] 步骤（2)中产酶培养基的组成以IL培养基计为：麸皮34~36g，硫酸铵I. 8~2. 0g， MgSO4 · 7H20 0· 4~0· 5g，蛋白胨 1. 2~I. 5g，FeSO4 · 7H20 0· 008~0· Olg，葡萄糖 0-20g，pH 5· 45~5· 55。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： (1)本发明的棘孢曲霉菌株发酵时胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性高，副产物少，β-葡 萄糖苷酶易分离纯化，分离纯化成本低，因此，以本发明的棘孢曲霉菌株作为出发菌株发酵 生产β-葡萄糖苷酶易于实现工业化生产。
[0016] (2)本发明的棘孢曲霉发酵培养基成分简单，工业化生产中配料简单，无需预处 理，可以显著降低生产成本。
[0017] (3)本发明的棘孢曲霉菌株的培养条件工艺参数设计合理，过程易于控制。
【具体实施方式】
[0018] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
[0019] 1、菌株的分离纯化 1.1样本采集：从小竹林排水沟、野生茶树下、腐烂竹叶和枯桃树木等下的土壤中采集 25个土壤样品于无菌试管中。
[0020] 1. 2样本处理 试剂准备：含抗生素的样本处理液配置：氨苄青霉素 lg，卡那霉素〇.55g，氯化钠 8. 5g，吐温Ig溶于适量水中；Ig氯霉素用4. 5ml乙醇溶解；将乙醇-氯霉素溶液混入第一 步所得溶液中，定容至IL得到处理液。
[0021] 筛选培养基：含甲基红的察氏培养基（g/L):CMC_Na 15. 0,硝酸钠3. 0g，七水硫酸 镁0. 5g，氯化钾0. 5g，七水硫酸亚铁0. 01g，磷酸氢二钾l.Og，甲基红0. 2g，琼脂15g， 水 I. 0L。
[0022] 样品处理：在每支含土壤样本的无菌试管中加入IOmL含抗生素的样品处理液，并 于高速混匀机中混匀，静置30min。
[0023] 接种：分别将混合后的处理液取50 μ L于2mL的离心管中（第一管)，并加入950 μ L 生理盐水(无抗生素）即稀释20倍，从第一管中取50uL于第二管并计入950 μ L生理盐水， 以上步骤重复，最后取稀释倍数为400,8000,160000的10 μ L涂布于平板，于28°C霉菌培养 箱中培养。
[0024] L 3平板初筛 试剂准备：PDA培养基：马铃薯(去皮）200g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15~20g/L，制得 IL培养基，分别倒试管斜面、平板。
[0025] 菌落挑取：取单一霉菌接种于PDA斜面上于28°C霉菌培养箱中培养。
[0026] L 4试管摇床复筛 1. 4. 1试剂准备：配制IOX的真菌、细菌复筛培养基浓缩液： 真菌培养基浓缩液！（NH4)2SO4 20 g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 4g/L，MgSO4 ·7Η20 4g/L。 细菌培养基浓缩液：KH2PO4 100g/L，NaCl 20g/L，MgSO4WH2O 2g/L浓缩液配制完成后 于灭菌锅灭菌，放于无菌柜，待用。
[0027] 1. 4. 2浓缩液配制培养基： 真菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖0. 3g/L，CMC-Na 0. 5g/L，然后将体积定容到浓缩 液的10倍。
[0028] 细菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖0.3 g/L，蛋白胨I g/L，将溶液定容到浓缩 液的10倍。
[0029] ρΗ4· 5 的 0· 2 mol/L Na2HPO4-O. I mo mol/L 的柠檬酸缓冲液的配制：0· I mol/L 的 梓檬酸用磷酸二氢钠滴定至pH4. 5,定容。
[0030] 5 mmol /L的P-NPG (对硝基苯基葡萄糖苷）底物溶液 N