a2CO3 lmol/L (反应终止液） 1. 4. 3试管摇床发酵复筛 将初筛斜面上的菌落于超净台分别接种于含真菌浓缩液培养基和细菌浓缩液培养基 的试管中，接种后于120r/min，30°C条件下摇床培养4d.。
[0031] 1.4.4酶活测定 在0D42(lnm下测吸光值，空白对照为酶液用去离子水代替的混合物。
[0032] 酶活测定方法：将发酵培养液于3 000 r/min离心10 min，得上清粗酶液，用微量 进样器取0.1 mL适度稀释的粗酶液，加入0. 9 mL pH4. 5的0. 2 mo/L Na2HPO4-O. I mol/L 朽1檬酸缓冲液，于50°C恒温水浴预热5~10 min,再加入已预热5~10 min的I mL 5 mmol /L的p-NPG溶液，用秒表精确计时，10 min后立即加入I mL I mol · L-I的Na2CO3 溶液终止反应，室温放置5 min，于442(| nm处测光吸收值0D。
[0033] 酶活计算：每毫升酶液每分钟水解产生1 μ mol的对硝基苯酚的酶活力，定义为一 个酶活单位，计算公式如下： 仏〇\"10\0.1=0# 0.369 ,00 4，上式中，1酶活单位（4/11^)，10:反应时间， N:原酶液稀释倍数，0. 1:取0.1 mL酶液反应，C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的 值 C=O. 369 · OD · N。
[0034] 1. 5 诱变 将步骤1. 4试管摇床发酵复筛获得β -葡萄糖苷酶活性较高的棘孢曲霉菌进一步UV 诱变处理，再通过EMS (甲基磺酸乙酯）和DES (硫酸二乙酯）联合诱变，获得一株β-葡萄 糖苷酶酶活性最高的棘孢曲霉菌株，命名为：曲霉（Aspergillus sp.)BG30,保藏单位：中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No. 7799。
[0035] 2、菌株的鉴定 上述棘孢曲霉菌株的菌落特性为：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25°C黑暗条件下培 养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初期球形， 后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8. 5-11. 0 μ m，褐色，壁光滑，顶囊球形，直径 33-42 μ m，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10* μ m，分生孢子椭圆形，少数球形或近 球形，浅到褐色，具明显小刺，2. 9-4. 7*2. 5-4. 0 μ m，未见有性孢子。
[0036] 3、本发明的棘孢曲霉菌株用于β-葡萄糖苷酶生产 斜面培养基的组成为：葡萄糖5. 0g，氯化钠3. 0g，硝酸钾3. 0g，磷酸氢二钾0. 06g，硫 酸铜0· 004g，麸皮10. 0g，酒石酸钾钠0· 005g，氯化铁0· 005g，硫酸锰0· 005g，琼脂20. 0g， 乳糖10. 〇g，蒸馏水l〇〇〇mL，pH值5. 5~6. 0,所述斜面培养基配置好后于0. 08Mpa灭菌 20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
[0037] 发酵培养基1 (以IL计):麸皮34g，硫酸铵I. 8g，MgS04 ·7Η20 0· 4g，蛋白胨I. 2g， FeSO4 · 7H20 0· 008g，葡萄糖 2g，pH 5· 45。
[0038] 发酵培养基2 (以IL计):麸皮36g，硫酸铵2. 0g，MgS04 ·7Η20 0· 5g，蛋白胨I. 5g， FeS04 · 7H20 0· Olg，葡萄糖 2g，pH 5· 55。
[0039] β -葡萄糖苷酶生产方法如下： (1) 将曲霉沙.）BG30接入斜面培养基，于28~34°C，进行增殖培养96h， 获得种子； (2) 将种子接入产酶培养基，于28-34?进行发酵培养96h，发酵液进行离心分离获得 β -葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过分离、纯化获得β -葡萄糖苷酶。
[0040] 发酵完毕后按步骤1. 4. 4酶活测定方法，测定发酵液中β -葡萄糖苷酶的活性，具 体结果如下：发酵培养基1获得的发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活为7.343 U/mL，发酵培 养基2获得的发酵液中β -葡萄糖苷酶的酶活为7. 543 U/mL。
[0041] 上述棘孢曲霉的发酵液经40~70% (NH4) #04分级沉淀，透析，DEAE阴离子交换 柱层析，Sephadex G-25凝胶柱脱盐，真空冷冻干燥后得到的β-葡萄糖苷酶，其比活达到 521. 853U/mg，纯化9. 7倍，酶的回收率为66%。
[0042] 上述分离得到的β -葡萄糖苷酶能够耐65~100°C高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸和 11%酒精，具有较强的增香，转糖苷酶活性，可以用作酶法合成烷基糖苷，如用于催化葡萄糖 和抗坏血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷，在65°C，3min完成，而市售的β -葡萄糖苷酶要在40°C 条件下36h方能完成。
[0043] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1. 一种棘孢曲霉菌株，其特征在于：该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉 (Aspergillussp. )BG30,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCCNo. 7799。2. -种权利要求1所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：所述棘孢曲霉菌株在生 产e-葡萄糖苷酶中的应用。3. 根据权利要求2所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：包括以下步骤： (1) 将曲霉（Asper价沙.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子； (2) 将种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得e-葡萄糖苷酶粗酶 液，所述粗酶液经过分离、纯化获得葡萄糖苷酶。4. 根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（1冲所述增殖培养 的温度为28~34°C，培养时间为56~150h。5. 根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（2)中所述发酵培养 的温度为28~34°C，培养时间为56~150h。6. 根据权利要求5所述的棘孢曲霉的应用，其特征在于：所述发酵培养为摇床培养，摇 床的转速为80~300r/min。7.根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（1冲斜面培养基的 组成为：葡萄糖2. 0-5. 0g，氯化钠3. 0g，硝酸钾3. 0g，磷酸氢二钾0. 06g，硫酸铜0. 004g，麸 皮10. 0g，酒石酸钾钠0. 005g，氯化铁0. 005g，硫酸锰0. 005g，琼脂20. 0g，乳糖0-10. 0g，蒸 馏水lOOOmL，pH值5. 5~6.0,所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲 霉BG30进行培养。8. 根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（2)中产酶培养基 的组成以IL培养基计为：麸皮34~36g，硫酸铵I. 8~2. 0g，MgSO4 ?7H20 0. 4~0.5g，蛋白胨 1. 2~I.5g，FeSO4 ?7H20 0? 008~0?Olg，葡萄糖0-20g，pH5. 45~5. 55。
【专利摘要】本发明涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域，该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉（Aspergillus sp.）BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No.7799。本发明的棘孢曲霉菌株发酵时胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性高，副产物少，β-葡萄糖苷酶易分离纯化，分离纯化成本低，因此，以本发明的棘孢曲霉菌株作为出发菌株发酵生产β-葡萄糖苷酶易于实现工业化生产。CGMCC NO.779920130628
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/66, C12N9/42
【公开号】CN104893985
【申请号】CN201510176113
【发明人】袁辉
【申请人】浙江科技学院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月15日