专利名称：基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及利用两种纳米材料水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni)Fe2O4固定葡萄糖氧化酶并以复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT和Mg (Ni ) Fe204/G0D/CHT修饰玻碳电极制作葡萄糖生物传感器的方法，属纳米技术和电化学分析检测技术领域。
背景技术：
近年来，随着人们生活水平的提高和老年人口的增多，糖尿病成为世界性的多发病和常见病，并严重危胁着人类健康，成为仅次于心血管病和癌症的第三大危险疾病。因此葡萄糖的含量的测定对糖尿病的预防和治疗有着重要的意义。电化学生物传感器由于其简单、快速、灵敏度高和选择性好等优点在葡萄糖检测中占有重要的地位。葡萄糖氧化酶因其催化效率高、稳定性好以及对D-葡萄糖的催化高度专一性等特点成为人们制备葡萄糖传感器的理想模型。自Updike和Hicks在1967年制备第一支葡萄糖传感器以来，葡萄糖生物传感器经历了第一代，第二代及第三代生物传感器。 而人为加入具有电催化氧化还原作用的电子媒介体是第二代生物传感器的一大特点。本发明即利用二茂铁甲酸作为电子媒介体的。但由于酶的一些弱点(易流失，活性不能保持长久等)限制了此类葡萄糖传感器的应用。因此有效固定葡萄糖氧化酶以保持酶活性成为此类葡萄糖传感器的研究重点。为此研究者利用多种材料如聚合物膜，介孔材料，碳纳米管和粘土等来固定酶保持酶的活性。阴离子粘土又称水滑石(LDHs)(分子式为[M(II)1-,M(III),(0Η)2Γ+[(Χ,//_)· Η20] 〃)因其特殊多孔性、含水率高，并且无毒，成本低以及结构稳定性好等物理和化学性能，为固定酶提供了较好的生物环境，特别由Co2+，Ni2+，Mn3+等在碱溶液中具有电子传递和氧化还原作用的过渡金属组成的水滑石，近来引起了越来越多的研究者的兴趣。如NiAl-LDH， ZnAl-LDH等水滑石已被用来制备生物传感器。但是三元素组成的水滑石MgNiFe-LDH 及其衍生物还没有被用于此类研究中。本发明就是利用利用共沉淀法合成的纳米材料 MgNiFe-LDH及其衍生物固定葡萄糖氧化酶用于葡萄糖生物传感器的研究。本发明是将纳米技术和生物传感技术结合在一起。通过纳米材料水滑石或其衍生物为生物酶提供良好的生物环境，使葡萄糖氧化酶在此环境中充分发挥对葡萄糖的催化作用。
发明内容
本发明的目的在提供两种新的纳米材料水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni) Fe2O4,并利用纳米材料的优良特性有效固定葡萄糖氧化酶(GOD)，与成膜性良好的壳聚糖 (CHT)的协同作用制备出了修饰剂MgNiFe-LDH/GOD/CHT和Mg (Ni ) i^e204/G0D/CHT复合膜滴涂玻碳电极制作了一种葡萄糖生物传感器的方法。一种基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器的制备方法，其特征在于具有以下的制备过程和步骤
A.首先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni )Fe204，用共沉淀法制备， 其制备过程如下先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH，在惰性气氛下在三颈瓶中加入摩尔比为 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在剧烈搅拌下加热到40 °C，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3碱液混合液(2 :1)，直到溶液pH=10为止，然后所得悬浮液继续搅拌下在100 °C下晶化6小时后，抽滤、洗涤至中性，所得滤饼在70 V 的烘箱中干燥M h,即得三元水滑石纳米粒子，记为MgNiFe-LDH ；
将MgNiFe-LDH在900°C下焙烧2小时，即制备得到水滑石衍生物，即纳米材料Mg (Ni) Fe2O4 ；
B.将三元水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni)Fe204纳米材料分别和壳聚糖(CHT)、 葡萄糖氧化酶(GOD)组合修饰在玻碳电极上制备成两种用于测定葡萄糖浓度的生物传感器；其制备过程如下
B-1.用传统的方法处理玻碳电极首先用金相砂纸抛光，然后依次用1.0μπι，0.3μπι 和0. 05 μ m Al2O3悬浊液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用HNO3溶液(1 1)、无水乙醇和二次水超声清洗；
B-2.修饰剂的配制将1. 6 mg的三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4纳米材料分散于1 mL CHT醋酸溶液(0. 5%，r/V，即g/mL)，超声分散均勻，加入1.6 mg GOD继续超声至分散均勻；
B-3.将上述两种分散均勻的修饰剂10 μ L滴涂在干净的玻碳电极表面上，4°C冰箱里过夜干燥，使电极表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT复合膜； 即得基于纳米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg(Ni)Fe2O4的葡萄糖生物传感器。一种葡萄糖浓度的测定，采用上述的基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器来测定，其特征具有以下测定步骤为
a.使用前，将此化学修饰玻碳电极先在pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡，然后在-0. 4 +0. 8V的电位窗口中循环伏安法扫描至图形稳定；再用二次蒸馏水冲洗干净；
b.将纳米材料复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni) i^CVGOD/CHT修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼片电极为对电极，组成传统的三电极体系； 电化学测定时，修饰电极放置在以恒定速率搅拌的0.1 M pH 7.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中加入了 0.5 mM 二茂铁甲酸；分别在0.60 V和0.50 V最佳电位下，记录电流-时间曲线， 当背景电流达到稳态，用微量进样器加葡萄糖样品，记录电流响应信号；得到葡萄糖浓的响应时间-电流曲线；然后按照常规计算方法测得葡萄糖浓度。。本发明分别利用三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物尖晶石铁氧体Mg(Ni)Fe2O4纳米粒子的独特性质来有效固定葡萄糖氧化酶，并用复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni) i^204/G0D/CHT滴涂玻碳电极，制备出葡萄糖氧化酶生物传感器。其优点是(1)纳米粒子的比表面积大，具有介孔结构，在纳米粒子表面或孔间固定酶的效率高，有效保持了酶的活性；(2)水滑石的层状结构促进了酶和电解质媒介体间的电子传递作用；水滑石衍生物即尖晶石型铁氧体具有立方体结构，它是软磁铁氧体材料，具有一定的分散能力可以使酶和基体之间的反应加快，检出限更低。本发明中的修饰电极是一类新型纳米材料固定酶的电化学传感器，用于葡萄糖的快速电化学测定，利用水滑石及其衍生物纳米粒子所制得的葡萄糖生物传感器具有活性高、稳定性好、成本低和寿命长等优点，有望得到实际应用。
图la，b分别为本发明中具有层状结构的水滑石MgNiFe-LDH (a)及其衍生物-尖晶石型铁氧体Mg (Ni)Fe2O4 (b)纳米材料的X-射线衍射图(横坐标为X-射线扫描角度2T， 纵坐标为X-射线衍射峰强度I)。图2a，b分别为本发明中两种纳米材料分别固定葡萄糖氧化酶与壳聚糖一起组成的复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT (a)和Mg (Ni) Fe204/G0D/CHT (b)修饰玻碳电极构建的葡萄糖生物传感器，在最优化条件下对葡萄糖浓度响应的时间-电流曲线(横坐标为时间t， 纵坐标为电流值/p)。
具体实施例方式现将本发明的具体实施例叙述于后。
本实施中生物传感器的制备过程和步骤如下
A.首先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH及其衍生物Mg (Ni )Fe204，用共沉淀法制备， 其制备过程如下先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH，在惰性气氛下在三颈瓶中加入摩尔比为 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在剧烈搅拌下加热到40 V，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3碱液混合液，体积比为2 1，直到溶液pH=10 为止，然后所得悬浮液继续搅拌下在100 °C下晶化6小时后，抽滤、洗涤至中性，所得滤饼在70 0C的烘箱中干燥M h，即得三元水滑石纳米粒子，记为MgNiFe-LDH。将MgNiFe-LDH 在900°C下焙烧2小时，即制备得到水滑石衍生物，即纳米材料Mg (Ni)狗204。B.生物传感器制备
(1)首先用金相砂纸抛光玻碳电极，然后依次用Ι.ομπι,ο.3μπι和0.05μπι Al2O3悬浊液在鹿皮上抛光至镜面，最后分别用HNO3 (1 1)、无水乙醇和二次水超声清洗；
(2)修饰剂及传感器的制备将1.6 mg三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4 纳米材料分散于1 mL CHT的醋酸(0. 5%，w/v即g/mL)溶液，超声分散均勻，加入1. 6 mg GOD继续超声至分散均勻；将10 μ L分散均勻的修饰剂MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni) Fe204/G0D/CHT滴涂在干净的玻碳电极表面上，4 °C冰箱里过夜干燥，使电极表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni ) Fe204/G0D/CHT复合膜，即得基于纳米材料三元水滑石 MgNiFe-LDH或其衍生物Mg (Ni)Fe2O4的葡萄糖生物传感器。利用上述生物传感器测定葡萄糖浓度的方法，其步骤如下
(1)使用时，先把化学修饰电极在PH=7. 0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡，然后在-0. 4 0. 8V的电位窗口中循环伏安法扫描至稳定；再用二次蒸馏水冲洗干净。(2)将上述化学修饰的玻碳电极用于葡萄糖浓度的测定；具体测定方法如下将纳米材料复合膜修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼片电极为对电极，组成传统的三电极体系；电化学测定时，修饰电极放置在以恒定速率搅拌的0. 1 M PH 7.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中加入了 0.5 mM 二茂铁甲酸。分别在电位为0.60 V和0.5 V下，记录电流-时间曲线，当背景电流达到稳态，用微量进样器加葡萄糖样品，记录电流响应信号；得到葡萄糖浓度响应时间-电流曲线，然后按照常规计算方法测得葡萄糖浓度。纳米材料结构及化学修饰电极的电化学性能表征
通过X-射线衍射仪图，可知合成了具有良好晶体结构的水滑石材料MgNiFe-LDH和立方晶体结构的尖晶石型铁氧体材料Mg (Ni)I^e2O4，如图la，b所示。化学修饰电极对葡萄糖进行电化学测定
在最佳测试条件下，MgNiFe-LDH/GOD/CHT (a)或 Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT (b)复合膜修饰电极对葡萄糖的电流-时间响应如图2所示。由图可见，达到95%稳态电流的时间都很短(均小于10 s)，这主要是因为制得的纳米材料对生物酶具有生物相容性、多孔性以及电子传递促进性等优良特性。所制备的生物传感器对葡萄糖的电流响应均随着葡萄糖浓度的增加而逐渐增大。MgNiFe-LDH/GOD/CHT复合膜修饰的电极在1. 0—8. 0 mM范围内，电流与葡萄糖浓度成线性关系，线性相关系数r =0.989，检测限为0.12 mM (信噪比为3)；用Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT复合膜修饰的电极在在1. 0—7. OmM范围内，电流与葡萄糖浓度成线性关系，线性相关系数r =0.991，检测限为0.05 mM (信噪比为3)。基于纳米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg (Ni )Fe2O4的葡萄糖生物传感器表现了良好的重现性和稳定性。对等浓度的葡萄糖溶液进行15次测定，其标准偏差分别为1. 165%和2. 18%。电极不用时在4°C的冰箱中存放一个月后，电流响应均保持在90% 以上。且不受一些常见的金属离子或果糖、木糖等其它糖类的干扰，专一性好。
权利要求
1.一种基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器的制备方法，其特征在于具有以下的制备过程和步骤A.首先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni )Fe204，用共沉淀法制备， 其制备过程如下先制备三元水滑石晶体MgNiFe-LDH，在惰性气氛下在三颈瓶中加入摩尔比为 2 1 1 的 Mg (NO3) 2 · 6H20, Ni (NO3) 2 · 6H20 和 Fe (NO3) 3 · 9H20 水溶液，在剧烈搅拌下加热到40 °C，滴加一定比例的NaOH和Na2CO3碱液混合液(2 :1)，直到溶液pH=10为止，然后所得悬浮液继续搅拌下在100 °C下晶化6小时后，抽滤、洗涤至中性，所得滤饼在70 V 的烘箱中干燥M h,即得三元水滑石纳米粒子，记为MgNiFe-LDH ；将MgNiFe-LDH在900°C下焙烧2小时，即制备得到水滑石衍生物，即纳米材料Mg (Ni) Fe2O4 ；B.将三元水滑石MgNiFe-LDH及其衍生物Mg(Ni)Fe204纳米材料分别和壳聚糖(CHT)、 葡萄糖氧化酶(GOD)组合修饰在玻碳电极上制备成两种用于测定葡萄糖浓度的生物传感器；其制备过程如下B-1.用传统的方法处理玻碳电极首先用金相砂纸抛光，然后依次用1.0μπι，0.3μπι 和0. 05 μ m Al2O3悬浊液在麂皮上抛光至镜面，最后分别用HNO3溶液(1 1)、无水乙醇和二次水超声清洗；B-2.修饰剂的配制将1. 6 mg的三元水滑石MgNiFe-LDH或衍生物Mg (Ni)Fe2O4纳米材料分散于1 mL CHT醋酸溶液(0. 5%，r/V，即g/mL)，超声分散均勻，加入1.6 mg GOD继续超声至分散均勻；B-3.将上述两种分散均勻的修饰剂10 μ L滴涂在干净的玻碳电极表面上，4°C冰箱里过夜干燥，使电极表面形成均勻的MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg (Ni)Fe204/G0D/CHT复合膜； 即得基于纳米材料三元水滑石MgNiFe-LDH或其衍生物Mg(Ni)Fe2O4的葡萄糖生物传感器。
2.一种葡萄糖浓度的测定，采用根据权利要求所述的基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器来测定，其特征具有以下测定步骤为a.使用前，将此化学修饰玻碳电极先在pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡，然后在-0. 4 +0. 8V的电位窗口中循环伏安法扫描至图形稳定；再用二次蒸馏水冲洗干净；b.将纳米材料复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni) i^CVGOD/CHT修饰的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，钼片电极为对电极，组成传统的三电极体系； 电化学测定时，修饰电极放置在以恒定速率搅拌的0.1 M pH 7.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中加入了 0.5 mM 二茂铁甲酸；分别在0.60 V和0.50 V最佳电位下，记录电流-时间曲线， 当背景电流达到稳态，用微量进样器加葡萄糖样品，记录电流响应信号；得到葡萄糖浓的响应时间-电流曲线；然后按照常规计算方法测得葡萄糖浓度。
全文摘要
本发明涉及基于三元水滑石及其衍生物的葡萄糖生物传感器的制备方法。本发明方法利用LDH及其衍生物纳米材料的优异特性有效固定葡萄糖氧化酶,并促进电子传递作用。具体方法如下先将1.6mgMgNiFe-LDH和Mg(Ni)Fe2O4纳米材料分散于1mL0.5%(w/v)CHT溶液，超声分散均匀，加入1.6mgGOD继续超声分散均匀，即得所需修饰剂。将修饰剂滴涂于玻碳电极表面即成葡萄糖生物传感器。本发明方法分别用纳米材料MgNiFe-LDH和Mg(Ni)Fe2O4固定葡萄糖氧化酶，并用复合膜MgNiFe-LDH/GOD/CHT或Mg(Ni)Fe2O4/GOD/CHT分别修饰玻碳电极，制备出两种葡萄糖生物传感器，用于葡萄糖的电化学测定，所固定的酶活性高、稳定性好和专一性强，对葡萄糖的测定具有快速、灵敏和准确等特点。
文档编号G01N27/327GK102243208SQ20111015667
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者丁亚平, 刘小娟, 叶代新, 徐彦红, 王玉龙, 罗立强 申请人:上海大学