专利名称：氨基酸－葡萄糖衍生物的的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氨基酸-葡萄糖衍生物配合物及其制备方法，特别涉及一种氨基酸-葡萄糖衍生物的99mTc配合物及其制备方法。
背景技术：
葡萄糖是人体主要的能量来源，并且脑和心脏的正常工作更离不开葡萄糖的代谢。18F-FDG(2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose)是医学诊断中极其重要的PET放射性药物，例如在心脏病学和神经学方面。此外，由于在许多类型的肿瘤中，葡萄糖的代谢水平显著提高，因此，18F-FDG常常用于肿瘤的诊断和评价。众所周知，18F-FDG是PET临床葡萄糖代谢显像诊断的卓越的放射性分子探针，但由于其价格昂贵和应用条件过高，临床应用受到很大限制。近年来，以肿瘤细胞葡萄糖过度代谢为靶向依据，设计99mTc标记的葡萄糖代谢型显像药物，是放射性药物研究的热点之一。
虽然国内外在研制新型99mTc标记的葡萄糖衍生物肿瘤显像剂方面做了大量工作，取得了许多很有价值的研究成果，但也存在一些普遍性的问题和缺陷①与葡萄糖相连接的双功能连接剂分子体积太大、99mTc与双功能连接剂配位所形成的基团的生物化学性质、电荷性质等改变了与之相连的糖基团的性质，影响了葡萄糖的生物活性，导致标记物不能被葡萄糖转运蛋白(GLUTs)识别而转运进入肿瘤细胞或不能被己糖激酶作用；②双功能连接剂与99mTc配位能力不强；③99mTc标记的葡萄糖衍生物在体内、外稳定性不好等等。
设计合成新的99mTc标记的葡萄糖代谢型肿瘤显像靶向药物，须满足以下要求①为保持糖的生物活性，和糖相连接的双功能连接剂分子量和体积要尽量小，从而使糖的生物活性尽可能不受或少受影响；②双功能连接剂应该具有较强的与锝或铼配位的能力，易于在温和的条件下进行标记；③双功能连接剂和糖相连接的位点很重要，这会影响配合物被葡萄糖转运蛋白识别和细胞内被己糖激酶催化，例如C2、C3不能连接太大的基团，否则将严重影响己糖激酶对糖类衍生物的识别作用；C6上的羟基对糖在细胞内的代谢有直接影响(磷酸化)，必须保留；④99mTc标记的葡萄糖衍生物应具有较强的体内外稳定性；⑤双功能连接剂尽可能具有较好的生物相容性。
氨基酸是很好的生物相容性物质，同时也可作为分子量及体积都相对较小的双功能连接剂。因此将半胱氨酸、半胱氨酸甲酯连接葡萄糖，与99mTc配位，探索其在肿瘤组织中的摄取，研制新的肿瘤显像剂具有极大的经济和社会效益。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种通过分子量小、生物相容性好的氨基酸类双功能连接剂连接的葡萄糖衍生物的99mTc配合物。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的方案一一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物，其核心为[99mTcO]3+其配位体为下述通式L7或L8
本发明的另一目的是提供上述99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的方案之一一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物的制备方法，其步骤如下1.半胱氨酸甲酯连接的葡萄糖衍生物(L7)的合成(1)合成路线 (2)合成方法a.化合物1(半胱氨酸甲酯盐酸盐)的合成将亚硫酰氯在冰盐浴条件下(-15℃)滴加到甲醇中，混合物搅拌，将L-半胱氨酸加入，在室温下搅拌；旋转蒸发，用乙酸乙酯洗涤所得固体数次，得半胱氨酸甲酯盐酸盐；
b.化合物L7的合成将半胱氨酸甲酯盐酸盐加入到装有甲醇的圆底烧瓶中，加入三乙胺，室温搅拌，将葡萄糖加入，回流，室温继续搅拌，旋转蒸发，所得固体用乙酸乙酯重结晶，得白色固体；2.99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物(即99mTcO-L7)的制备配体结构 Tc配合物的结构 通过与99mTcO-葡庚糖酸盐(即99mTcO-Gluceptate，以下简称为99mTcO-GH)进行配体交换反应制备99mTcO-L7配合物；99mTcO-GH的制备称取GH(即葡庚糖酸，英文Glucoheptonic acid的缩写)20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的盐酸溶液(1.0mg/ml，0.1MHCl)调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的99mTcO4-溶液(370MBq/ml)，30～40℃下反应10min；TLC监测(生理盐水/聚酰胺，甲醇/新华一号)，测量放射化学纯度，HPLC(高效液相色谱)监测；99mTcO-L7配合物的制备取标记好的99mTc-GH 0.15ml，加入到5mg/ml的配体(L7)水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC(薄层色谱)和HPLC(高效液相色谱)监测，测放射化学纯度。
方案之二一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物的制备方法，其步骤如下1.半胱氨酸连接的葡萄糖衍生物(L8)的合成(1)化合物的结构 (2)合成方法将半胱氨酸，D-葡萄糖加入到乙二醇二甲醚和水(8/2)的混合溶液中，加热回流，出现白色固体，冷却后减压抽滤，分别用乙醇和乙醚洗涤沉淀，乙醇重结晶，产品L8为白色粉沫；2.99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物(即99mTcO-L8)的制备配体结构
Tc配合物的结构 通过与99mTcO-GH进行配体交换反应制备99mTcO-L8配合物99mTcO-GH的制备称取GH20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的盐酸溶液(1.0mg/ml，0.1M HCl)调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的99mTcO4-溶液(370MBq/ml)，30～40℃下反应10min；TLC监测(生理盐水/聚酰胺，甲醇/新华一号)，测量放射化学纯度，HPLC监测；99mTcO-L8配合物的制备取标记好的99mTcO-GH 0.15ml，加入到5mg/ml的配体(L8)水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC和HPLC监测，测放射化学纯度。
本发明的99mTcO-氨基酸连接的葡萄糖配合物的有益效果①具有较高的肿瘤摄取(注射后60min，99mTcO-L7的肿瘤摄取为1.81±0.04 ID％/g，99mTcO-L8的肿瘤摄取为2.53±1.18 ID％/g)；
②标记物在肿瘤中滞留时间较长(注射后180分钟，99mTcO-L7的肿瘤摄取值为1.82±0.38 ID％/g；99mTcO-L8为1.52±0.20 ID％/g)。
③靶/非靶比值较高，99mTcO-L7在注射后180分钟，肿瘤/肌肉比值为6.27±0.33；肿瘤/血比值为1.54±0.32)，对显像十分有利。
下面通过具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
具体实施例方式
实施例199mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物(L7)的制备方法，其步骤如下1.半胱氨酸甲酯连接的葡萄糖衍生物(L7)的合成(1)合成路线 (2)合成方法a.化合物1(半胱氨酸甲酯盐酸盐)的合成将26ml(300mmol)亚硫酰氯在冰盐浴条件下(-15℃)滴加到甲醇中，混合物搅拌20min，将12.1g(100mmol)L-半胱氨酸加入，在室温下搅拌24h。旋转蒸发，用乙酸乙酯洗涤所得固体数次，得半胱氨酸甲酯盐酸盐，产品产率82.9％。
H1-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ(ppm)3.29-3.33(m，2H)，3.36-3.42(m，2H)，3.76(s，3H)，4.35-4.37(m，1H).
b.化合物L7的合成将13.5g(100mmol)半胱氨酸甲酯盐酸盐加入到装有60ml甲醇的圆底烧瓶中，加入13.9ml(100mmol)的三乙胺，室温搅拌10min，将19.8g(100mmol)葡萄糖加入，回流1小时，室温继续搅拌18小时，旋转蒸发，所得固体用乙酸乙酯重结晶，得白色固体。
产物产率46.3％产物熔点107.3～109.0℃元素分析结果实测值N4.50，C39.72和H6.35％；理论值N4.71，C40.40和H6.44％；H1-NMR(DMSO-d6500MHz)δ(ppm)2.73-2.77(m，1H)，2.86-2.90(m，1H)，3.00-3.03(m，1H)，3.19-3.22(m，1H)，3.33-3.35(m，2H)，3.49 (m，1H)，3.56-3.59(m，3H)，3.62(m，1H)，3.66(s，1H)，3.71-3.72(m，3H)，3.87(m，1H)，4.20(m，1H)，4.36(broad，1H)，4.48(broad，1H)，4.76(m，1H)；R(KBr)3560，3280，2926，1744，1725，1435，1346，1238，1215，1125，1087，1063，1027 cm-1；MS(ESI)实测值298.1(M+H)+，320.1(M+Na)+；
理论值298.0(M+H)+，320.0(M+Na)+。
2.99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物(即99mTcO-L7)的制备配体结构 Tc配合物的结构 通过与99mTcO-GH进行配体交换反应制备99mTcO-L7配合物99mTcO-GH的制备称取GH 20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的盐酸溶液(1.0mg/ml，0.1M HCl)调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的99mTcO4-溶液(370MBq/ml)，30～40℃下反应10min；TLC监测(生理盐水/聚酰胺，甲醇/新华一号)，测量放射化学纯度，HPLC监测；99mTcO-L7配合物的制备取标记好的99mTc-GH 5～6滴，加入到5mg/ml的配体(L7)水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC和HPLC监测，测放射化学纯度。
3、标记物放射化学纯度的测定用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)的方法分别测定标记物放射化学纯度。
薄层层析(TLC)采用双体系一是生理盐水为展开剂，聚酰胺薄膜为支持体；另一个是甲醇为展开剂，新华1号层析纸(浙江杭州新华造纸厂制造)为支持体。
HPLC条件A相0.1％三氟乙酸水溶液；B相0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；梯度条件0～10minA＝100％，B＝0；10～20minA＝50％，B＝50％；20～30minA＝0，B＝100％。流速1.0ml/min。
4、结果与讨论标记物放射化学纯度的测定TLC分析各组分在双体系的Rr值如表2所示表299mTcO-L7在双体系TLC的Rf值
经双体系TLC测定，标记物放射化学纯度都大于95％。
实施例2半胱氨酸连接的葡萄糖衍生物(L8)的合成(1)化合物的结构 (2)合成方法将1.2g(10mmol)半胱氨酸，1.9g(10mmol)D-葡萄糖加入到乙二醇二甲醚和水(体积比为8/2)的混合溶液中，加热回流3h，出现白色固体，冷却后减压抽滤，分别用乙醇和乙醚洗涤沉淀，乙醇重结晶，产品L8为白色粉沫。
产率67.7％产物熔点163.3～165.8℃元素分析结果实测值N 5.11，C 37.42和H 6.10％；理论值N 4.94，C 38.16和H 6.05％质谱分析MS(ESI)实测值284.0(M+H)+，306.0(M+Na)+；理论值284.0(M+H)+，306.0(M+Na)+；H1-NMR(DMSO-d6500MHz)δ(ppm)2.87(m，1H)，3.02(m，1H)，3.20(m，1H)，3.36-3.38(m，2H)，3.44-3.48(m，1H)，3.45(m，2H)，3.56-3.59(m，2H)，3.59-3.75(m，3H)，4.05(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)；IR(KBr)3357，2935，1617，1559，1385，1341，1300，1243，1125，1070，1037，1011cm-1。
2.99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物(即99mTcO-L8)的制备配体结构 Tc配合物的结构 通过与99mTcO-GH进行配体交换反应制备99mTcO-L8配合物99mTcO-GH的制备称取GH 20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的盐酸溶液(1.0mg/ml，0.1M HCl)调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的99mTcO4-溶液(370 MBq/ml)，30～40℃下反应10min；TLC监测(生理盐水/聚酰胺，甲醇/新华一号)，测量放射化学纯度，HPLC监测；99mTcO-L8配合物的制备取标记好的99mTc-GH 5～6滴，加入到5mg/ml的配体(L8)水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC和HPLC监测，测放射化学纯度。
3、标记物放射化学纯度的测定用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)的方法分别测定标记物放射化学纯度。
薄层层析(TLC)采用双体系一是生理盐水为展开剂，聚酰胺薄膜为支持体；另一个是甲醇为展开剂，新华1号层析纸为支持体。HPLC条件A相0.1％三氟乙酸水溶液；B相0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；梯度条件0～10minA＝100％，B＝0；10～20minA＝50％，B＝50％；20～30minA＝0，B＝100％。流速1.0ml/min。
4、结果与讨论标记物放射化学纯度的测定TLC分析各组分在双体系的Rr值如表2所示表299mTcO-L8在双体系TLC的Rf值
经双体系TLC测定，标记物放射化学纯度都大于95％。
试验荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠的生物分布试验实验材料及试剂ICR 小鼠 雌性 18～22g北京医科大学动物部荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠 18～22g北京大学临床肿瘤医院1.99mTc配合物的制备按照上述实施例的方法制备各配合物，并且用TLC(薄层色谱)和HPLC(高效液相色谱)检测其放射化学纯度。所有进行动物分布研究的标记物的放射化学纯度均大于90％。
2.99mTc配合物在荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠体内的分布荷瘤鼠生物分布实验方法荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠于雌性BACB/C小鼠前左腋下植入2×106肿瘤细胞，生长约10天后肿瘤直径为10～13 mm；将标记产物溶液用纯水稀释到11.1MBq/ml。取出0.1ml稀释后产物溶液，加入9.9ml生理盐水，混匀后取出0.1ml，作为标准溶液；取荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠，体重为(20±2)g，3只为一组。尾静脉注入0.1ml(1.11MBq)的标记率大于90％的配合物，分别于注射后选择30min、60min、180min、120min、240min中的三个时相断头处死，取血、肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、骨等称重，测定放射性计数，计算各脏器和组织的摄取量。99mTcO-氨基酸连接的葡萄糖配合物的荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠的生物分布实验数据见表5。
表599mTcO-L7、99mTcO-L8的荷EMT-6乳腺癌肿瘤小鼠的生物分布
(ID％/g±SD)
注数据为每克脏器摄取剂量占总注射剂量的百分数的平均值(平行三只小鼠)，SD是平均值的标准偏差。
结果讨论由以上实验数据可知99mTcO-氨基酸连接的葡萄糖配合物具有较高的肿瘤摄取(注射后60min，99mTcO-L7的肿瘤摄取为1.81±0.04 ID％/g；99mTcO-L8的肿瘤摄取为2.53±1.18 ID％/g)并且标记物在肿瘤中滞留时间较长(注射后180分钟，两者的摄取值分别为1.82±0.38 ID％/g和1.52±0.20ID％/g)，同时99mTcO-L7的靶/非靶比值较高(注射后180分钟，肿瘤/肌肉比值为6.27±0.33；肿瘤/血比值为1.54±0.32)，这对显像比较有利。与美国目前正进行临床研究的99mTc-ECDG相比有一定的优点(注由于文献中进行99mTc-ECDG的研究时用是荷A549人类肺癌鼠，数据仅供参考。99mTc-ECDG的肿瘤摄取120min为0.415±0.123％ID/g，240min为0.414±0.161％ID/g；肿瘤/血120min为0.424±0.022，240min为0.502±0.120；肿瘤/肌肉120min为2.754±0.120，240min为2.795±0.980)。
权利要求
1.一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物，其核心为[99mTcO]3+，其配位体为下述通式L7或L8。
2.一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物的制备方法，其步骤如下(1).半胱氨酸甲酯连接的葡萄糖衍生物的合成a.半胱氨酸甲酯盐酸盐的合成将亚硫酰氯在冰盐浴条件下，即-15℃，滴加到甲醇中，混合物搅拌，将L-半胱氨酸加入，在室温下搅拌；旋转蒸发，用乙酸乙酯洗涤所得固体数次，得半胱氨酸甲酯盐酸盐；b.化合物L7的合成将半胱氨酸甲酯盐酸盐加入到装有甲醇的圆底烧瓶中，加入三乙胺，室温搅拌，将葡萄糖加入，回流，室温继续搅拌，旋转蒸发，所得固体用乙酸乙酯重结晶，得白色固体；(2).99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物的制备Tc配合物的结构 通过与99mTcO-GH进行配体交换反应制备99mTcO-L7配合物99mTcO-GH的制备称取GH 20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的0.1M的盐酸溶液，调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的370MBq/ml的99mTcO4-溶液，30～40℃下反应10min；用生理盐水和聚酰胺，甲醇和新华一号双体系，进行TLC监测，测量放射化学纯度，HPLC监测；99mTcO-L7配合物的制备取标记好的99mTcO-GH 5～6滴，加入到化合物L7的5mg/ml的水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC和HPLC监测，测放射化学纯度。
3.一种99mTc标记的氨基酸-葡萄糖衍生物配合物的制备方法，其步骤如下(1)半胱氨酸连接的葡萄糖衍生物的合成将半胱氨酸，D-葡萄糖加入到乙二醇二甲醚和水以重量比为8∶2配制成的混合溶液中，加热回流，出现白色固体，冷却后减压抽滤，分别用乙醇和乙醚洗涤沉淀，乙醇重结晶，产品L8为白色粉沫；(2).99mTcO-氨基酸连接葡萄糖配合物的制备Tc配合物的结构 通过与99mTcO-GH进行配体交换反应制备99mTcO-L8配合物99mTcO-GH的制备称取GH 20～30mg，溶于0.5～1.0ml生理盐水，加入0.1mlSnCl2的0.1M的盐酸溶液，调pH＝7.0～7.5，加入1.0ml新淋洗的99mTcO4-溶液(370MBq/ml)，30～40℃下反应10min；用生理盐水和聚酰胺，甲醇和新华一号双体系，进行TLC监测，测量放射化学纯度，HPLC监测；99mTcO-L8配合物的制备取标记好的99mTcO-GH 5～6滴，加入到化合物L8的5mg/ml的水溶液中，调pH＝8.0，沸水浴10min；用0.2μm滤膜过滤，TLC和HPLC监测，测放射化学纯度。
全文摘要
本发明涉及一种
文档编号A61K103/10GK101066982SQ200710064209
公开日2007年11月7日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者刘锰, 朱霖, 刘亚静 申请人:北京师范大学