br>[0042](13) 一种核酸处理装置，其特征在于，具有(I)?(10)中任一项所述的核酸提取器件，以及用于利用微分干涉显微镜、相位差显微镜、拉曼显微镜或相干拉曼显微镜对捕获于细胞捕获部的细胞进行观察的显微镜部。
[0043](14) 一种方法，其特征在于，为利用具有细胞捕获部和配置于所述细胞捕获部下方的核酸捕获部的核酸提取器件从细胞提取核酸的方法，包括下述工序:
[0044]使细胞与所述细胞捕获部接触，从而将各个单个细胞捕获于所述细胞捕获部的工序，
[0045]使用于从细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部，通过从上至下连通的流路来流动的工序，
[0046]将提取的核酸固定于所述核酸捕获部的工序，以及
[0047]使核酸提取后的溶液从所述核酸捕获部介由流路在与所述细胞捕获部相反侧排出的工序，
[0048]所述核酸提取器件中，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
[0049]发明的效果
[0050]可以提供一种价格低廉的测定器件或装置，所述测定器件是在对单细胞中的核酸等生物体分子进行定量、或者进行序列确定、或者鉴定生物体分子的种类的器件中，增加了能够一次性测定的细胞数，同时能够有效地对细胞中的分子(例如mRNA)进行样品处理。
【附图说明】
[0051]图1是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0052]图2是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0053]图3是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0054]图4是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
[0055]图5是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0056]图6是显示本发明的核酸提取器件中使用的核酸的一个实施方式的概略图。
[0057]图7是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0058]图8是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
[0059]图9是显示本发明的核酸提取器件的使用方法的一个实施方式的概略图。
[0060]图10是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0061]图11是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0062]图12是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0063]图13是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
[0064]图14是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
[0065]图15是显示本发明的核酸处理装置的一个实施方式的概略图。
[0066]图16是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0067]图17是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0068]图18是显示本发明的核酸提取器件的一个实施方式的概略图。
[0069]图19是显示本发明的核酸提取器件的处理方法的一个实施方式的概略图。
【具体实施方式】
[0070]本发明的核酸提取器件的具体结构例如可以例示于图1。图1(a)是垂直于面状器件的面的方向的剖面图，图1(b)是与面并排的、上面的图的点划线部分的位置处的剖面图。具有下述特征的核酸提取器件是本发明的基本结构:具有将导入到器件中的细胞I 一个个固定的细胞捕获部2(图1中，细胞捕获部具有将细胞一个个固定的孔)、用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路3、介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部4、以及将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路5，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。根据需要，该结构还可追加构成于平面基板6上和内部的、用于导入细胞的上部反应区域7和用于将处理过的核酸排出的下部反应区域8。虚线箭头9是细胞的移动轨迹的例子，箭头10显示从细胞提取的核酸和处理过的样品的移动方向。
[0071]非专利文献2中记载的器件中，面内配置有细胞捕获部(cell capture chamber)、逆转录部(RT chamber)和PCR部(qPCR chamber)。必须分别面向2种反应槽配置比细胞捕获所需的面积大的面积，进而，还必须在面内配置用于控制液流的阀门、流路。因此，用来配置用于对单个细胞进行处理的单元结构(非专利文献2的结构中，包括细胞捕获部、逆转录部、PCR部和流路体系的单个细胞处理涉及的结构)的器件上的面积会增大。器件成本大致与器件的面积成比例，因而如果增加同时处理的细胞数，则会导致器件成本的提高。
[0072]图1的实施方式中，为了解决该问题，将核酸捕获部设置于细胞捕获部的正下方，由提取的核酸在核酸捕获部构建cDNA文库，对该文库进行之后的处理，从而能够在单个反应区域内进行多个反应。
[0073]为了提高核酸捕获的效率，优选核酸捕获部填装有多个珠子的结构、多孔质结构。通过增大这样的单位容积中的作为反应场所的表面积，即使反应槽小，效率也高，能够在短时间内进行反应。
[0074]进而，以构建的cDNA为模板，在器件上进行通过PCR、转录反应等进行的核酸扩增后，回收样品，在通过使用了第二代测序的测序进行定量时，通过使构建的cDNA的序列根据被捕获的位置的不同而不同，对于回收的样品溶液的测序能够对是来自哪个细胞的基因表达量进行鉴定。
[0075]由此，不需要对单元结构进行隔离或用于控制样品的移动的阀门机构、流路。
[0076]图1的构成中，通过将核酸捕获部4所需的试剂从上部反应区域7供给，从而在核酸捕获部进行PCR反应，PCR扩增产物从下部反应区域8回收。此时，优选以使器件整体的温度成为适合于PCR反应的温度循环的机构设置于器件的外侧。
[0077]作为进一步优选的结构，可以例示采取下述结构:为了能够事先使用非侵入式显微镜对细胞的状态进行测定，对于同一细胞通过基因表达分析等对细胞中的生物物质进行定量，不在固定有细胞的正下方配置核酸捕获部，而是配置于周边。
[0078]具体而言，是如图2所示的结构。图2(a)是垂直于面状器件的面的方向的剖面图，图2(b)是与面并排的、上面的图的点划线部分的位置处的剖面图。为了在从细胞I提取核酸前进行显微镜观察，器件中的21、22、23部分使用光学透明的材料。显微镜观察可以使用透射型显微镜、微分干涉显微镜、相位差显微镜、相干反斯托克斯拉曼显微镜(CARS显微镜)等。
[0079]显微镜观察结束后，为了进行核酸提取和逆转录，使样品和试剂在箭头10的方向上流动。样品处理的工艺与不进行显微镜观察时相同。
[0080]实施例
[0081](实施例1)
[0082]本实施例是涉及通过大量填装固定于珠子上的用于核酸捕获的DNA (DNA探针)来构成核酸捕获部的核酸提取器件和样品处理装置的实施例。
[0083]本实施例的核酸提取器件的单元结构的基本构成与图1所示的基本构成相同。然而，本实施例中，为如下那样的器件的构成:不仅从细胞提取核酸，捕捉mRNA，而且构建cDNA文库并将其作为模板，能够测序的末端具有已知序列且可获得足够量的核酸扩增产物。
[0084]将对应于本实施例的核酸提取器件中的用于处理一个细胞的单元结构的剖面图记载于图3(a)中。此外，图3、图4的(b)?(f)中记载了利用该器件能够进行的、从细胞的捕捉后的各细胞的核酸提取和核酸(mRNA)捕捉(b)、cDNA的合成(C)、核酸扩增(PCR)以及导入了测序所需的已知的末端序列的第二链的合成(d)、(e)和PCR扩增⑴的步骤的示意图。此外，图5中记载了核酸提取器件的整体构成图。图5(a)是对应于图1(a)、图3(a)的核酸提取器件的截面的整体图，图5(b)是图5 (a)的A-A’截面，是对应于图1(b)的附图。此外，图5(c)是对应于图5(a)的B-B’截面的剖面图。
[0085]接下来，对于核酸提取器件的运行，按处理顺序进行说明。图3(a)中，为了将悬浮于溶液的细胞I固定于器件上的特定的位置(细胞捕获部(开口部))2，使溶液从上部反应区域7向下部反应区域8通过细胞捕获部来流动。细胞随着溶液的流动而移动，到达细胞捕获部，由于细胞捕获部的开口径比细胞的直径小，因此细胞被固定于此。捕捉的细胞发挥对溶液流的栓塞的作用，因而流体向尚未捕捉细胞的细胞捕获部移动。因此，剩余的细胞向尚未捕捉细胞的部分移动并被捕捉。捕捉了目标数量的细胞I后，上部反应区域7中流动的溶液变换为用于使细胞破碎的Lysis buffer等核酸提取液(例如TWeen20等表面活性剂与蛋白分解酶的混合液)。同时，在11的方向上施加电场，使细胞中的核酸(mRNA)通过电泳移动至核酸捕获部4。核酸捕获部4是下述区域:在细胞捕获部2间的流路3和下部反应区域8间的流路5之间的区域填装了固定有用于捕获核酸的DNA探针31的珠子12的区域。
[0086]图3(b)显示固定有DNA探针31的珠子12表面的放大图。施加电场11，以使从细胞提取的mRNA32被捕捉至位于所捕捉的细胞的正下方的核酸捕获部中的珠子上。为了将捕捉的mRNA原始存在的细胞的位置信息以序列信息的形式保存，固定于珠子的DNA探针31含有根据核酸捕获部的位置的不同而不同的序列、即细胞识别序列。该DNA探针31的3’末端具有多聚T序列，通过与mRNA的3’末端的多聚A序列杂交来捕捉mRNA。配置于图1(b)和图5(c)的4所示的二维阵列上的核酸捕获部中填装有固定有具有各不相同的细胞识别序列的DNA探针31的珠子。
[0087]该mRNA捕捉用DNA探针31在本实施例中为稍为复杂的序列构成，如图3 (b)所示，作为DNA探针31，从5’末端开始，包括:30个碱基的PCR扩增用共有序列(Forward方向)、5个碱基的细胞识别用标签序列、包含15个碱基的随机序列的分子识别用标签序列、以及18个碱基的寡聚(dT)序列+2个碱基的VN序列。通过将PCR扩增用共有序列导入到DNA探针31中，能够在后续的PCR扩增工序中用作公共引物。此外，关于细胞识别标签，例如当为5个碱基的随机序列时，能够对45= 1024个单细胞进行识别。即能够一次性地从1024个单细胞制备cDNA文库，在如上所述最终获得的第二代测序的序列数据中，能够对来自哪个细胞进行识别。进而，通过将分子识别用标签序列(例如7个碱基)导入到DNA探针31中，能够对47= 1.6xl04分子进行识别，因此，能够由有关利用第二代测序获得的扩增产物的DNA序列数据，对来自相同细胞且具有同样的基因序列的扩增产物来自何种分子进行识别。即，由于能够对