1302、1303进行选择，从而仅测定来自特定荧光体的光。细胞的荧光成像利用物镜1305、成像透镜1306、CCD相机1307进行。对它们进行控制、取得图像数据的控制计算机是1308。
[0134]接下来，对流通系统1201的控制体系进行说明。流通系统的控制计算机是1309，其控制XY平台1310从而使显微图像移动。此时，在控制计算机上，能够使使用细孔阵列片上的位置坐标、细胞识别标签的序列数据和XY平台位置坐标计算出的显微图像上的位置坐标对应。该控制计算机1309对下述装置进行适当的控制:控制细胞的流动池系统的细胞导入的细胞导入控制装置1311，控制改变细胞的状态的分化诱导剂、调节细胞的应答的试剂、用于使细胞破碎的裂解液、用于样品处理的试剂的导入的试剂控制装置1312，控制细胞培养条件、PCR时的温度循环的温度、CO2浓度控制装置1313，多余的试剂、细胞、培养基更换等所使用的上部试剂排出装置1314，用于将制备的核酸扩增产物排出的下部试剂排出装置1315。最终获得的核酸扩增产物被传递至第二代(大规模)DNA测序系统1205，进行序列分析。此时，设为用于测序的emPCR、桥接扩增在该系统中进行。在控制计算机上验证过的图像的位置信息和细胞识别标签序列信息被输送至整合信息系统1206，进行由荧光图像获得的蛋白量与基因表达量的比对。进而，利用同一系统进行基因表达分析数据的经时变化推测。由此，可以对基因表达网络的动力学进行测定。
[0135]此外，该荧光显微镜不仅用于细胞内的测定，还可以用于对导入到细孔阵列片中的、用抗体捕捉的细胞因子等由细胞分泌的物质进行免疫荧光染色并对其量进行测定。当然，还可以同样地操作，用于破碎后的基因表达量的分析。
[0136]图14显示组合微分干涉显微镜来代替荧光显微镜的例子。微分干涉显微图像不使用荧光试剂，仅对形状进行测定，是再生医学等需要将细胞体输回体内的情况下对细胞的影响最小的测定方法之一。是能够对由该图像获得的细胞形状的变化与基因表达的变化之间进行比对的情况下细胞损伤最少、能够进行详细的细胞分类的测定系统。
[0137]1401是光源，在这里，是卤素灯。1402是偏光镜，1403、1404分别是Wollaston滤光片和Wollaston棱镜。1405是聚光镜，1406是物镜。
[0138]图15显不使用CARS显微镜作为光学显微镜的例子。CARS显微镜与拉曼显微镜、IR显微镜同样，可获得对应于激光激发部分的化学种类的光谱，因此能够使有关细胞状态的信息量比微分干涉显微镜更多。而CARS为非线性过程，与拉曼信号相比信号强度强，可以以较弱的激光激发强度获得充分的信号，因此具有对细胞的损伤小的优点。通过使这样的CARS图像与基因表达分析数据相对应，从而能够进行更为详细的细胞状态的判断。
[0139]1501是光源，在这里，是脉冲激光(微芯片激光)。利用光束分离器1502将其分为两束，一束导入至非线性纤维(光子晶体光纤)1503，生成斯托克斯光。另一束光直接用作栗浦光和探针光，利用水浸物镜1504聚光于样品(细胞中)，生成反斯托克斯光。利用高通滤光片1505仅使反斯托克斯光透过，通过分光器1506，利用分光器用C⑶相机1507取得相干反斯托克斯拉曼光谱。
[0140](实施例4)
[0141]本实施例显示，细胞捕获部并非由与细胞同等程度大小的开口部构成、而是由固定有化学捕捉细胞表面的物质，即与细胞表面的物质化学结合的物质的区域构成的例子。将针对实施例1(图1)改变了细胞捕获部的例子示于图16。配置了在核酸捕获(捕捉)中使用的珠子上的一部分区域固定有与细胞表面结合的抗体等蛋白质的珠子。珠子上的抗体可以附加捕捉特定种类的细胞的功能。例如，被称为⑶(cluster of differentiat1n)抗体的一组抗体是对应于以白细胞为中心的细胞的膜蛋白的种类的抗体组。将该抗体生物素化并用珠子上的链霉亲和素固定，使用喷墨打印技术打印在图16的细胞捕获部2上，从而能够捕捉具有特定CD分类的抗原的细胞。当然，毋庸置疑，也可以不直接将CD抗体固定于珠子上，而是通过生物素修饰了的第二抗体固定于珠子上。此外，可以将CD抗体以外的抗体固定于珠子上，也可以将结合于细胞上的受体的分子固定。作为这样的分子的例子，有纤连蛋白。已知纤连蛋白与细胞上的整联蛋白相结合。通过将纤连蛋白固定于珠子上，可以捕捉粘接性的细胞。
[0142]作为与细胞表面的物质化学结合的物质的其他例子，可以列举细胞外基质，例如胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白等。
[0143]接下来，显示对应于实施例3 (图2)的器件构成中化学地进行细胞捕捉的例子。这是在核酸提取器件的透明区域的一部分固定用于捕捉细胞的物质的例子。捕捉用物质可以使用与上述同样的抗体，也可以使用其他物质。图17显示核酸提取器件的构成例。将细胞捕捉用抗体1702固定于细胞捕获部2。固定方法是利用将生物素化的抗体和链霉亲和素固定于该区域。能够仅捕捉具有对应于抗体的抗原1703的细胞。
[0144]进而，显示对应于实施例2(图7)的例子。如图18所示，在细孔阵列片71上的用于捕捉细胞的区域1801固定抗体，从而形成了能够捕捉具有对应于抗体的抗原1802的细胞的细胞捕获部。为了将抗体固定于特定位置，使用喷墨打印头对经生物素化的抗体进行打印，每次为数十PL左右。通过实施例3所示的方法，器件整个表面被链霉亲和素覆盖，因而仅在特定区域固定有抗体。
[0145](实施例5)
[0146]实施例1?4中，描述第二链形成工序(图2(d)-(e)和图8 (c)-(d)所示的工序)和PCR扩增工序(图2(f)和图8(e))也在图5、图10、图11或图12所示那样的装置中进行的例子。其中，可如下进行:对于核酸提取器件1901的全部或将核酸提取器件分割为多个器件的器件，将器件如图19所示插入到树脂制的管1902(—般使用的0.2mL、l.5mL容量等的管)或96孔、384孔板中，通过使第二链合成和PCR扩增所需的试剂1903在该管中混合来进行。通过设为这样的构成，关于这些工序的条件，不仅使用者能够自由地对条件进行改变，而且，从第二链合成开始在管中进行，从而还能够将细胞识别标签、分子识别标签从与实施例1-4所示的位置相反侧的末端插入。
[0147]本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。
[0148]产业可利用性
[0149]根据本发明，能够对多个培养细胞、多个免疫细胞、(血中)癌细胞等进行生物体分子的定量、序列确定、分子鉴定，能够对处于何种状态的细胞组以何种程度的数量在生物体中存在进行测定。其还可以进行癌症等的早期诊断、测定iPS细胞的非均质性。
[0150]符号说明
[0151]1:细胞
[0152]2:细胞捕获部
[0153]3:流路
[0154]4:核酸捕获部
[0155]5:流路
[0156]6:平面基板
[0157]7:上部反应区域
[0158]8:下部反应区域
【主权项】
1.一种核酸提取器件，其特征在于，具有: 用于固定各个单个细胞的细胞捕获部， 用于从所述细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部而从上至下流动的流路， 介由所述流路与所述细胞捕获部相连并配置于所述细胞捕获部的下方，将提取的核酸固定的核酸捕获部，以及 将核酸提取后的溶液由所述核酸捕获部向与所述细胞捕获部相反侧排出的流路， 所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。2.根据权利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含固定有用于核酸捕获的DNA的珠子。3.根据权利要求1所述的核酸提取器件，其特征在于，所述核酸捕获部包含细孔中固定有用于核酸捕获的DNA的多孔质膜。4.根据权利要求1?3中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部固定有与细胞表面的物质化学结合的物质。5.根据权利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含用于确定在芯片上的位置的序列。6.根据权利要求2或3所述的核酸提取器件，其特征在于，所述用于核酸捕获的DNA的一部分包含根据所捕获的核酸分子的不同而不同的序列。7.根据权利要求6所述的核酸提取器件，其特征在于，具有导入用于对所述核酸捕获部所捕获的RNA进行逆转录的酶的单元。8.根据权利要求1?7中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方由光学透明的材料构成。9.根据权利要求1?8中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方设有核酸捕获部。10.根据权利要求1?8中任一项所述的核酸提取器件，其特征在于，所述细胞捕获部的正下方以外的区域设有核酸捕获部。11.一种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1?10中任一项所述的核酸提取器件和导入用于构建CDNA文库的试剂的单元。12.—种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1?10中任一项所述的核酸提取器件以及导入用于构建cDNA文库的试剂和用于核酸扩增的试剂的单元。13.一种核酸处理装置，其特征在于，具有权利要求1?10中任一项所述的核酸提取器件，以及用于利用微分干涉显微镜、相位差显微镜、拉曼显微镜或相干拉曼显微镜对捕获于细胞捕获部的细胞进行观察的显微镜部。14.一种方法，其特征在于，为利用具有细胞捕获部和配置于所述细胞捕获部下方的核酸捕获部的核酸提取器件从细胞提取核酸的方法，包括下述工序: 使细胞与所述细胞捕获部接触，从而将各个单个细胞捕获于所述细胞捕获部的工序， 使用于从细胞提取核酸的核酸提取液通过所述细胞捕获部，通过从上至下连通的流路来流动的工序， 将提取的核酸固定于所述核酸捕获部的工序，以及 使核酸提取后的溶液从所述核酸捕获部介由流路在与所述细胞捕获部相反侧排出的工序， 所述核酸提取器件中，所述细胞捕获部、所述两条流路以及所述核酸捕获部在上下方向上形成配对，该配对在平面方向上配置有多个。
【专利摘要】为了对多个细胞中的多个基因进行基因表达，需要在分离细胞后提取基因，进行核酸扩增，通过序列分析进行基因表达分析。然而，细胞的分离对细胞造成损伤，需要使用昂贵的系统。将细胞捕获部和核酸捕获部的一对结构在上下方向上配置，提取细胞的各个基因，在核酸捕获部合成cDNA，扩增核酸，通过第二代测序进行序列分析，从而高精度地进行各个细胞中的基因表达分析。
【IPC分类】C12Q1/68, C12M1/00, C12N15/09
【公开号】CN105026562
【申请号】CN201380073998
【发明人】白井正敬, 神原秀记, 谷口妃代美, 田边麻衣子
【申请人】株式会社日立制作所
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年3月12日
【公告号】WO2014141386A1