酵母细胞中的细菌木糖异构酶活性的制作方法
【专利说明】醒母细胞中的细菌木糖异构酶活性
[0001] 本专利申请要求提交于2013年3月11日的美国国家申请13/792321的权益，其 全部内容W引用方式并入。
技术领域
[0002] 本发明设及酵母的基因工程领域。更具体地，鉴定一组木糖异构酶，其在被工程化 W进行其表达的酵母细胞中是活性的。
【背景技术】
[0003] 目前酵母是用于发酵制备乙醇的生物体或选择。最常见的是使用酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)，在使用过程中用从谷物或膠液获得的己糖作为碳水化合物 来源。使用从纤维素类生物质制备的水解产物作为发酵的碳水化合物来源是可取的，因为 运是易得的可再生资源，不会与食品供应产生竞争。在葡萄糖之后，纤维素类生物质中第二 丰富的糖是木糖，一种戊糖。酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)并非天然能够代谢木 糖，但能经过工程化（木糖异构酶活性的表达W将木糖转化为木酬糖，W及额外的途径工 程化）W代谢木糖。
[0004] 成功地表达在酵母中有活性的异源的细菌木糖异构酶已受限。某些特异性木糖细 菌异构酶序列已被报道为酵母中的木糖利用途径提供木糖异构酶活性。例如US7, 622, 284 公开了一种表达来自厌气性瘤胃真菌属（Piromycessp.)的木糖异构酶的酵母细胞。 US2012/0184020公开了表达分离自生黄瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens)的木 糖异构酶的真核细胞。类似地W02011078262公开了来自栖北散白蚁巧eticulitermes spera化S)和达尔文澳白蚁（Mastotermesdarwiniensis)中的每种的多种木糖异构酶，和 与运些酶具有高度序列同一性的蛋白，W及它们在真核细胞中的表达。W0212009272公开了 包含来自软弱贫养菌（Abiotrophiadefectiva)的木糖异构酶和与之具有序列同一'性的其 它（酶）的构建体和真菌细胞。
[0005] 但仍需要另外的工程化的酵母细胞，其表达木糖异构酶活性W成功利用木糖，从 而在发酵过程中允许有效利用得自的纤维素类生物质的糖类。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了经工程化W表达提供木糖异构酶活性的多肤的重组酵母细胞。
[0007] 因此，本发明提供了包含异源核酸分子的重组酵母细胞，所述异源核酸分子编码 多肤，所述多肤具有木糖异构酶活性并且氨基酸序列与选自SEQIDNO:1，3,5和7的氨基 酸序列相比具有至少约85%的序列同一性。
[0008] 在另一方面本发明提供了制备具有木糖异构酶活性的酵母细胞的方法，其包括W 下步骤：
[0009] a)提供酵母细胞；
[0010]b)导入编码多肤的异源核酸分子，所述多肤具有木糖异构酶活性并且其氨基酸序 列与选自SEQIDNO:1，3,5和7的氨基酸序列相比具有大于95%的序列同一性；
[0011] 其中制备具有木糖异构酶活性的酵母细胞。
[001引序列描沐
[0013] 根据下面的详细描述和附带的序列描述可更充分地理解本发明，下面的详细描述 和附带的序列描述形成了本专利申请的一部分。
[0014] 下列序列符合37C.F.R. 1. 821-1. 825 ("对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开 的专利申请的要求-序列规则"）并且符合世界知识产权组织（WIP0)标准ST. 25 (2009)和 EP0和PCT的序列表要求（规则5. 2和49. 5 (a-bis)，W及行政性指示的208节和附录C)。 用于核巧酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. § 1. 822中列出的规定。
[001引表1 :太糖择构酶《化的沈QIDN0,Pi及经密码子优化W在酿酒酵母中表武的编 码区 [0016]
[0018] *nd=未设计
[0019] 沈QIDNO:17是载体PHR81的核巧酸序列，其包含ILVp-巧1A(血l)-ILV5t嵌合 基因。
[0020] SEQIDNO: 18是P5整合载体的核巧酸序列。
[0021] 沈QIDNO: 19是URA3缺失痕的核巧酸序列。
[0022] 沈QIDNO:20是ura3A后删除区的上游核巧酸序列。
[0023] 沈QIDNO:21是ura3A后删除区的下游核巧酸序列。
[0024] 沈QIDNO:22是hiS3 A后删除区的上游核巧酸序列。
[00巧]沈QIDNO:23是his3A后删除区的下游核巧酸序列。
[0026] 沈QIDNO:24是PJT254的核巧酸序列。
【具体实施方式】
[0027] 可使用下列定义阐释权利要求和说明书：
[002引如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它变型旨在包 括非排它的包括。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限 于那些元素，但可W包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品 或设备固有的元素。此外，除非明确指明相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的"或"。 例如，条件A或B满足下列任一项：A为真实的（或存在的）且B为虚假的（或不存在的）， A为虚假的（或不存在的）且B为真实的（或存在的），W及A和B均为真实的（或存在 的）。
[0029] 此外，设及元素或组分例子（即出现）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在为非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少 一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0030] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
[0031] 如本文所用，用术语"约"修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变 化，它们可能发生在例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序 中；运些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的 差异中；等。术语"约"还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而 不同的量。无论是否由术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术 语"约"指在报告数值10 %范围内，优选地在报告数值5 %范围内。
[0032] 术语"木糖异构酶"是指催化D-木糖和D-木酬糖的互变的酶。木糖异构酶狂I) 属于被分类为EC5. 3. 1. 5的酶的组。
[0033] 术语"木糖利用途径"是指包含基因的代谢途径，所述基因编码足W将木糖转化为 目标化学制品的酶。在目标化学制品为乙醇的情况下，此类途径通常包含编码W下酶的基 因：木酬糖激酶畑S1)、转醒醇酶灯AL1)、转酬醇酶1灯化1)、D-核酬糖-5-憐酸3-表异构 酶（RPE1)、和核糖5-憐酸酬醇异构酶（服II)。该途径的元件对宿主细胞可W是天然的或 异源的。
[0034] 术语"基因"是指表达特定蛋白或功能RNA分子的核酸片段，其在编码序列之前和 之后可任选地包括调控序列5'非编码序列和3'非编码序列。"天然基因"或"野生型基 因"指具有其自身调控序列的天然存在的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基因， 包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含来源于不 同来源的调控序列和编码序列，或来源于相同来源、但W不同于天然存在的方式排列的调 控序列和编码序列。"内源性基因"是指在生物体基因组中其天然位点的天然基因。"外来 的"基因是指在宿主生物体中通常不存在、但通过基因转移导入宿主生物体的基因。外来基 因可包括插入非天然生物体的天然基因或嵌合基因。
[0035] 术语"启动子"或"启动控制区"是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA 序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整体来源于天然基因，或由 来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。本领域的技 术人员应当理解不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中的表达，或在不同发育 阶段的表达，或响应于不同环境条件的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下 引起基因表达的启动子称为"组成型启动子"。
[0036] 如本文所用，术语"表达"指衍生自基因的编码（mRNA)或功能性RNA的转录和稳 定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肤。"过表达"是指在转基因生物体中基因产物制备 超过了在正常生物体或非转化过的生物体中的制备水平。
[0037] 如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定 遗传。被转移的核酸可W质粒的形式保持在宿主细胞中，或某些被转移的核酸可整合进宿 主细胞的基因组。包含转化的核酸片段的宿主生物被称为"转基因的"或"重组的"或"转 化的"生物体。
[003引如本文所用，术语"质粒"和"载体"是指通常携带有不属于细胞中屯、代谢的部分 的基因的染色体外元件，并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可为来源于任何 来源的自主复制的序列、基因组整合序列、隧菌体或核巧酸序列、线性或环状的单链或双链 DNA或RNA，其中多个核巧酸序列连接或重组至细胞中能够导入启动子片段和选定基因产 物的DNA序列W及合适的3'非翻译序列的独特结构。
[0039] 术语"可操作地连接"指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序 列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该编 码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列 可W按有义或反义的取向可操作地连接到调控序列。