专利名称：高氮酵母及其制备方法
技术领域：
本发明涉及酿酒酵母及其制备方法。
背景技术：
面包酵母在分类学上属于酿酒酵母。酵母是一种单细胞微生物，其形态为圆形、椭圆形、卵圆形，大小随菌种的差异而不同。酵母细胞中含水分65%_70%，其中约有15%为游离水；含碳水化合物为25%_35%， 大多以多糖形式存在；含蛋白质40%-60%，酵母含有完整的氨基酸群，包括人体必需的8种氨基酸，特别是在谷物蛋白中含量较少的赖氨酸，在酵母中含量较高。此外，酵母中的氨基酸比例接近联合国粮农组织(FAO)推荐的理想氨基酸组成值，故其营养价值较高。灰分 5%-10%，大多以磷和钾的含量较多。酵母也是天然的营养来源和营养载体，其营养成分具有 “三低四优”的特点，即低脂、低糖、不含胆固醇，富含优质完全蛋白质、完整的B族维生素、以生命结合态形式存在的多种矿物质和功能膳食纤维。在自然界中，所选育的酵母存在自身蛋白含量低、生物量积累缓慢等缺点。因此有必要对酵母细胞进行诱变和筛选，最终得到蛋白含量高，生物量积累快的优良菌种。为今后工业化生产奠定坚实的基础。目前所使用的微生物菌种选育技术主要包括物理方法如紫外线诱变，化学方法如，亚硝基胍、氯化锂、硫酸乙二酯(DES)等单一诱变或几种物质相结合诱变的方法。采用上述的物理、化学方法均存在着工作量大，诱变效率低下等诸多问题。且对菌种自身会产生不同程度的抗性。另一种主要采用基因工程育种的方法，主要包括原生质体融合技术、DNA 重组技术。原生质体融合技术是目前最常用也是最有效的菌种诱变手段之一，优点是细胞结构简单，生长迅速，所需设备简单，操作方便。缺点是突变率低，诱变剂效果不稳定。DNA 重组技术其优点在于目的性强，能按照人们意愿改造目的基因。但缺点在技术难度大，mRNA 贮存时间短，操作过程复杂。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种高氮酵母。利用重离子辐照诱变得到高氮酵母，为酵母工业化提供优良菌种。本发明的又一目的在于提供一种高氮酵母的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种高氮酵母，是Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC No 5004，保藏日期为2011年6月四日；经重离子辐照诱变，其含氮量为40_60%。高氮酵母的制备方法，其主要特点是包括以下步骤
(1)准备菌种-.Saccharomycescerevisiae 酿酒酵母
(2)制备固体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4O. 2%-3%、MgSO4O. 03%-1. 5%、KH2PO4O. 2%-1. 5%,琼脂 0. 5%_1· 5%,其余为水；(3)制备液体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4 0. 2%-3%、MgSO4 0. 03%-1. 5%、KH2PO4 0. 2%-1. 5%,其余为水；
(4)斜面培养将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35 °C静置培养；
(5)种子培养挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养8_12小时，摇床转速为100-300r/min，接种量为 5%-10% ；
(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy-100Gy ；
(7)酵母菌种若保藏时间较长需要在_80°C保藏，若是斜面保藏在4°C保藏。一种高氮酵母的制备方法，其主要特点是包括以下步骤
(1)准备菌种-.Saccharomycescerevisiae 酿酒酵母
(2)制备固体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4O. 2%-3%、MgSO4O. 03%-1. 5%、KH2PO4O. 2%-1. 5%,琼脂 0. 5%_1· 5%,其余为水；
(3)制备液体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4 0. 2%-3%、MgSO4 0. 03%-1. 5%、KH2PO4 0. 2%-1. 5%,其余为水；
(4)斜面培养将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35 °C静置培养；
(5)种子培养挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养8_12小时，摇床转速为100-300r/min，接种量为 5%-10% ；
(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy-100Gy ；
(7)酵母菌种若保藏时间较长需要在_80°C保藏，若是斜面保藏在4°C保藏。所述的高氮酵母的制备方法，还包括以下步骤将步骤(6)的酵母菌种接入到 500ml或IOOOml三角瓶中在所述的液体培养基中进行扩大培养，液体培养基为pH4_6，在 25-35°C的温度下，摇床培养6-12小时，摇床转速为100_300r/min、接种量5%_10%。所述的高氮酵母的制备方法，还包括以下步骤 所述的高氮菌种的筛选
(1)酵母的培养及分离
与权利要求2步骤1-6相同条件下，分别对不同剂量下的菌种进行液体培养，将所述的酵母菌悬液在3000-400()r/min离心分离得到湿菌体，蒸馏水洗涤，分离，重复上述操作2_4 次，加入1 :10的80-100°C的热蒸馏水进行破壁，维持此温度约20-30min后、离心分离收集上清液备用；
(2)蛋白含量的测定a初筛，将上述收集到的上清液在不同分光光度下测定其分光光度值，在^Onm和^Onm处，分别测定分光光度值与所测的蛋白浓度有线性关系，带入公式蛋白浓度=1. 45 X A260-O. 74X A280其中A26(1、A280分别代表在^Onm和^Onm处的吸光度值； 依次进行初步筛选；b精确测定，利用GB/T 5009. 5-2003中规定的蛋白含量测定方法对初筛的菌种进行定量的测定。
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本发明有益效果利用重离子辐照诱变处理微生物菌种，为发酵行业提供优良目的菌株并使之产业化体现出其实用性及其可操作性。丰富了菌种诱变的方法，并为今后以重离子诱变微生物开拓了新的天地。重离子诱变技术的主要优点表现在(1)变异率高，一般比自然变异率高1000倍以上；( 变异谱宽，即变异的类型多，能够得到新类型的微生物菌种；(3)变异稳定性强，能够得到相对稳定的菌种(正、负突变同时存在)且能够缩短筛选周期；(4)突变可操作性强，能够较容易地完成对微生物的辐照诱变。1通过重离子辐照诱变处理得到了高氮的酵母菌种。利用重离子诱变技术能够有效地筛选出所需的目的菌种，与现有的诱变技术相比具有独到的诱变优越性。2利用简单的破壁方法利用热蒸馏水进行速效破壁，省去了酵母自溶的时间、与超声破壁和高压均质破壁相比节省设备费用，降低筛选成本。3提高了筛选效率和准确度，将筛选分为2个阶段，缩短了筛选菌种所需要的时间，提高了筛选效率。同时，利用分光光度计进行蛋白含量测定，降低了误差，提高了数据的准确度。利用碳重离子对酵母悬浮液进行辐照处理，通过多次实验对辐照剂量、菌悬液浓度、半致死率以及正突变率的研究确定了最佳的辐照剂量。并通过筛选工作得到了含氮量为50%-60%的高氮酵母菌种，较初发菌种含氮量提高了 10%-15%。重离子辐照作为一种新型的微生物诱变方法具有广阔的应用前景，同时得到的高氮酵母菌种为今后生产酵母系列产品奠定了坚实的基础。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例1 一种高氮酵母，其主要特点是feccAarofflj^M cerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No 5004；
高氮酵母的制备方法，其主要特点是包括以下步骤
(1)准备菌种..Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母酿酒酵母 2399，该酵母购于中国科学院微生物研究所。(2)制备固体培养基按质量百分比葡萄糖3. 0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%_1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4O. 2%-3%、MgSO4O. 03%-1. 5%、KH2PO4O. 2%-1. 5%,琼脂 0. 5%_1· 5%，其余为水；
(3)制备液体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4 0. 2%-3%、MgSO4 0. 03%-1. 5%、KH2PO4 0. 2%-1. 5%,其余为水；
(4)斜面培养将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35 °C静置培养；
(5)种子培养挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养8_12小时，摇床转速为100-300r/min，接种量为 5%-10% ；
(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为100Gy ；
6(7)酵母菌种若保藏时间较长需要在_80°C保藏，若是斜面保藏在4°C保藏。实验例1; 1、实验内容
1. 1菌种Saccharomyces cerevisiae酿酒酵母；酿酒酵母 2399，该酵母购于中国科学院微生物研究所。1. 2培养基葡萄糖3. 0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%_1. 0%、酵母浸出粉0. 2-1. 0%、 NH4S040. 2%-3%、MgS040. 03%-l. 5%、KH2P040. 2%-1. 5%,其余为水。1. 3实验器材
三角瓶、电炉、灭菌锅、摇床、超净工作台、一次性培养皿 1. 4种子培养
挑取3环斜面菌种接入到已灭好菌的液体培养基中，在适宜的温度下摇床培养8-12小时，待菌悬液肉眼观察浑浊进行一定比例的稀释，作为重离子诱变辐照前的初发菌悬液。培养条件种子培养基PH4-6、发酵温度25-35°C、摇床转速100-300r/min、接种量5%-10%
1. 5重离子辐照处理
将菌悬液分装入一次性培养皿中，选取不同的辐照剂量点分别进行重离子辐照处理， 辐照剂量为20Gy-100Gy。按照预定的辐照计量对实际辐照剂量进行矫正，所测数据用来指导和完成后续的实验。1.6高氮菌种的筛选 1. 6. 1酵母的培养及分离
在相同条件下，分别对不同剂量下的菌种进行液体培养，将培养后的酵母菌悬液在 3000-4000r/min离心分离得到湿菌体，利用蒸馏水洗涤，分离重复上述操作3次，加入一定比例的热蒸馏水进行稀释、破壁、离心分离收集上清液备用。1.6. 2蛋白含量的测定
分为初筛和精确测定两部分，由于筛选工作烦多复杂，需要进行初步筛选，将上述所收集上到的清液在不同分光光度下测定其分光光度值，在一定的范围内，分光光度值与所测的蛋白浓度有线性关系，因此可以作为出筛的标准，即浓度越大分光光度值越大。依次进行初步筛选。精确筛选的目的是利用GB/T 5009. 5-2003中规定的蛋白含量测定方法对初筛的菌种进行定量的测定。确定辐照处理后具体的蛋白含量。通过上述方法的筛选，目前实验室已经得到蛋白含量大于55%的高氮酵母菌种。实施例2 —种高氮酵母，除步骤(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比100比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为60Gy ；其余同实施例1。实施例3 —种高氮酵母，除步骤(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比102比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy ；其余同实施例1。实施例4 所述的高氮酵母的制备方法，步骤1-5与实施例1相同，步骤6为重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98比例的稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为80Gy-100Gy。实施例5 所述的高氮酵母的制备方法，步骤1-5与实施例1相同，步骤6为重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比100比例的稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy-80Gy。实施例6:所述的高氮酵母的制备方法，还包括以下步骤将步骤(6)的酵母菌种接入到500ml三角瓶中在所述的液体培养基中进行扩大培养，液体培养基为PH4-6，在 25-35°C的温度下，摇床培养6-8小时，摇床转速为100-300r/min、接种量5%_10%。实施例7 所述的高氮酵母的制备方法，还包括以下步骤将步骤(6)的酵母菌种接入到IOOOml三角瓶中在所述的液体培养基中进行进一步的扩大培养，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养6_8小时，摇床转速为100-300r/min、接种量 5%-10%。实施例8 所述的高氮酵母制备方法，还包括以下步骤 所述的高氮菌种的筛选
(1)酵母的培养及分离
与权利要求2步骤1-6相同条件下，分别对不同剂量下的菌种进行液体培养，将所述的酵母菌悬液在3000-400()r/min离心分离得到湿菌体，蒸馏水洗涤，分离，重复上述操作2_4 次，加入1 :5的5-15°C蒸馏水进行稀释、破壁、离心分离收集上清液备用；
(2)蛋白含量的测定a初筛，将上述收集到的上清液在不同分光光度下测定其分光光度值，在400nm处，分光光度值与所测的蛋白浓度有线性关系，蛋白浓度越大分光光度值越大。依次进行初步筛选；b精确测定，利用GB中规定的蛋白含量测定方法对初筛的菌种进行定量的测定。通过上述方法的筛选，目前实验室已经得到蛋白含量大于55%的高氮酵母菌种。高氮酵母菌种的应用，高氮酵母抽提物是一种天然调味料，具有纯天然、营养丰富、味道鲜美、香味醇厚的优点，因此可广泛应用于食品加工、保健食品等诸多行业。由于生活水平与饮食习惯的差异，酵母抽提物的研究及生产在欧美等西方发达国家已有较长的历史，并得到了广泛的应用，而我国则处于刚起步阶段，但随着经济水平的迅速发展，消费者对食品安全、营养、健康的追求与人民的生活水平及饮食习惯发生了很大的提高和变化，酵母抽提物作为一种天然、安全、健康的食品配料，市场需求将不断扩大。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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权利要求
1.一种高氮酵母，是feccAarofflj^M cererisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No 5004；高氮酵母的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)准备菌种-.Saccharomycescerevisiae 酿酒酵母(2)制备固体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4O. 2%-3%、MgSO4O. 03%-1. 5%、KH2PO4O. 2%-1. 5%,琼脂 0. 5%_1· 5%,其余为水；(3)制备液体培养基按质量重量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4 0. 2%-3%、MgSO4 0. 03%-1. 5%、KH2PO4 0. 2%-1. 5%,其余为水；(4)斜面培养将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35 °C静置培养；(5)种子培养挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养8_12小时，摇床转速为100-300r/min，接种量为 5%-10% ；(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy-100Gy ；(7)酵母菌种保藏需要在-80°C保藏，若是斜面保藏在4°C保藏。
2.一种高氮酵母的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)准备菌种-.Saccharomycescerevisiae 酿酒酵母(2)制备固体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4O. 2%-3%、MgSO4O. 03%-1. 5%、KH2PO4O. 2%-1. 5%,琼脂 0. 5%_1· 5%,其余为水；(3)制备液体培养基按质量百分比葡萄糖3.0%-5. 0%、蛋白胨0. 5%-1. 0%、酵母浸出粉 0. 2-1. 0%、NH4SO4 0. 2%-3%、MgSO4 0. 03%-1. 5%、KH2PO4 0. 2%-1. 5%,其余为水；(4)斜面培养将培养皿内的单菌落挑取后接入到已灭好菌的所述的固体培养基斜面上，25-35 °C静置培养；(5)种子培养挑取斜面菌种接入到已灭好菌的所述的液体培养基中，液体培养基为pH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养8_12小时，摇床转速为100-300r/min，接种量为 5%-10% ；(6)重离子辐照处理待菌悬液肉眼观察浑浊进行1比98-102比例稀释，对菌悬液进行重离子辐照诱变，辐照剂量为20Gy-100Gy ；(7)酵母菌种保藏在-80°C，斜面保藏在4°C。
3.如权利要求2所述的高氮酵母的制备方法，其特征还包括以下步骤将步骤(6)的酵母菌种接入到500ml或IOOOml三角瓶中在所述的液体培养基中进行扩大培养，液体培养基为PH4-6，在25-35°C的温度下，摇床培养6_12小时，摇床转速为100-300r/min、接种量 5%-10%。
4.如权利要求2所述的高氮酵母的制备方法，其特征是还包括以下步骤所述的高氮菌种的筛选(1)酵母的培养及分离与权利要求2步骤1-6相同条件下，分别对不同剂量下的菌种进行液体培养，将所述的酵母菌悬液在3000-4000r/min离心分离得到湿菌体，蒸馏水洗涤，分离，重复上述操作2-4次，加入1 :10的80-100°C的热蒸馏水进行破壁，维持此温度约20-30min后、离心分离收集上清液备用；(2)蛋白含量的测定a初筛，将上述收集到的上清液在不同分光光度下测定其分光光度值，在^Onm和^Onm处，分别测定分光光度值与所测的蛋白浓度有线性关系，带入公式蛋白浓度=1. 45 X A260-O. 74X A280其中A26(1、A280分别代表在^Onm和^Onm处的吸光度值； 依次进行初步筛选；b精确测定，利用GB中规定的蛋白含量测定方法对初筛的菌种进行定量的测定。
全文摘要
本发明涉及酿酒酵母及其制备方法。一种高氮酵母，是Saccharomycescerevisiae酿酒酵母，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5004；经重离子辐照诱变，其含氮量为40-60%。重离子诱变技术的主要优点表现在(1)变异率高，一般比自然变异率高1000倍以上；(2)变异谱宽，即变异的类型多，能够得到新类型的微生物菌种；(3)变异稳定性强，能够得到相对稳定的菌种(正、负突变同时存在)且能够缩短筛选周期；(4)突变可操作性强，能够较容易地完成对微生物的辐照诱变。
文档编号C12N1/18GK102337224SQ20111025084
公开日2012年2月1日 申请日期2011年8月29日 优先权日2011年8月29日
发明者李文建, 王菊芳, 肖国青, 马良 申请人:中国科学院近代物理研究所