专利名称：一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母atcc9763的筛选和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选和应用，尤其涉及该酵母在葡萄酒发酵，酸面团发酵，动物饲料生产和基因工程中的应用。
背景技术：
酿酒酵母(feccAarofflj^M cererisiae)，又称面包酵母或者出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母。它不仅应用于面包、馒头、酿酒等领域；在现代分子和细胞生物学中，也被用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。在葡萄皮、果柄及果梗上，生长有大量天然酵母，当葡萄被破碎、压榨后，酵母进入葡萄汁中，将葡萄汁中所含的糖进行发酵、降解，从而生产出醇美的葡萄酒。本发明采集的农家土制葡萄酒除具有葡萄本身果香外，也具有酵母产生的良好果香与酒香，口味新鲜清爽。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选和应用，该酿酒酵母具有耐温、耐酒精度、耐酸、耐糖、耐氧，产气能力强，生长快速等特点。一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，利用YPD培养基平板计数法和DGGE法分析葡萄酒原液菌群数量和组成并筛出7株菌，结合DGGE分析和测序结果，确定其中的酿酒酵母ATCC9763为葡萄酒中优势菌。在YPD培养基中分别添加不同浓度的葡萄糖和酒精，24 h后测定其OD6tltl值，检测不同浓度糖和酒精对其生长的影响作用。将YPD培养基调为不同的pH值，24 h后测定其0D_值，检测不同pH值对其生长的影响作用。将培养菌置于不同温度，24 h后测定其0D_值，检测不同温度对其生长的影响作用。将培养菌分别置于需氧和厌氧条件，每隔2 h取样测定其0D_值，绘制其生长曲线并比较其在需氧和厌氧条件下OD值的异同。是酿酒酵母ATCC9763应用于葡萄酒酿制该酿酒酵母可以在糖浓度0. 5-6. 5%的环境下大量生长，可以耐受0- %的酒精度，需/厌氧条件下皆可存活，因此可应用于葡萄酒生产工业。酿酒酵母ATCC9763应用于酸面团发酵该酵母可在pH 2. 5-8. 5下大量生长，耐酸能力强，可抵抗酸面团中乳酸菌产生的酸性物质；生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，产 CO2能力强，可应用于酸面团发酵产业。酿酒酵母ATCC9763应用于动物饲料生产该酵母生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，可为动物饲料提供较多蛋白质，B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质；该酵母耐酸能力强，可联合益生菌如乳酸菌一起使用，改善饲料风味，为动物提供益生物质；此外，该酵母需/厌氧条件下皆可存活，为生产用饲料深层发酵提供有利条件。酿酒酵母ATCC9763可应用为工程菌株该酵母生长迅速，需/厌氧下皆可高量生长，容易培养，可作为模式生物，研究酵母生物信息学和健全异源基因在酵母中进行功能互补。本发明应用如下
1、酿酒酵母ATCC9763应用于葡萄酒酿制
该酿酒酵母可以在糖浓度0. 5-6. 5%的环境下大量生长，可以耐受0- %的酒精度，需 /厌氧条件下皆可存活，因此可应用于葡萄酒生产工业。2、酿酒酵母ATCC9763应用于酸面团发酵
该酵母可在PH 2. 5-8. 5下大量生长，耐酸能力强，可抵抗酸面团中乳酸菌产生的酸性物质；生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，产(X)2能力强，可应用于酸面团发酵产业。3、酿酒酵母ATCC9763应用于动物饲料生产
该酵母生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，可为动物饲料提供较多蛋白质，B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质；该酵母耐酸能力强，可联合益生菌如乳酸菌一起使用，改善饲料风味，为动物提供益生物质；此外，该酵母需/厌氧条件下皆可存活，为生产用饲料深层发酵提供有利条件。4、酿酒酵母ATCC9763可应用为工程菌株
该酵母生长迅速，需/厌氧下皆可高量生长，容易培养，可作为模式生物，研究酵母生物信息学和健全异源基因在酵母中进行功能互补。本发明的优点是来源于农家自制葡萄酒的酿酒酵母ATCC9763，耐温、耐酒精度、 耐酸、耐糖、耐氧，产气能力强，生长快速，可应用于酸面团发酵、葡萄酒酿造、动物饲料生产、工程菌构建中。本发明对筛选得到的菌株用生理生化和分子生物学手段进行鉴定，确定其为酿酒酵母ATCC9763，之后对其进行了一系列的耐糖，耐酸，耐酒精和耐氧实验，确定其在酸面团发酵，酿酒和动物饲料中的潜在价值。葡萄酒酵母最适宜的繁殖温度是22 30 °C，当温度超过35 °C，酵母呈瘫痪状态，在40 ！以上时完全停止生长和发酵；发酵初期葡萄汁中含有一定量的氧，有利于获得强壮酵母，保证发酵的顺利进行，在发酵中后期，应控制氧的存在，保证在厌氧条件下进行发酵与陈酿；不同的酵母对糖的利用能力不一样，发酵率高的酵母适于酿造干葡萄酒，而发酵率低的适于酿造甜葡萄酒。此外，发酵过程中总酸度要适宜，以PH计，应控制在3 5的范围。饲料酵母通常用假丝酵母或脆壁克鲁维酵母经培养、干燥制成，是不具有发酵力、 细胞呈死亡状态的粉末状或颗粒状产品。它含有丰富的蛋白质(30 40%左右)、B族维生素、氨基酸等物质，广泛用作动物饲料的蛋白质补充物；它能促进动物的生长发育，缩短饲养期，增加肉量和蛋量，改良肉质和提高瘦肉率，改善皮毛的光泽度，并能增强幼禽畜的抗病能力。此外，因酿酒酵母与同为真核生物的动物和植物细胞具有很多相同的结构，又容易培养，被用作研究真核生物的模式生物，也是目前被人们了解最多的生物之一。人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物的，包括有关细胞周期的蛋白、信号蛋白和蛋白质加工酶。本发明筛选的酿酒酵母ATCC9763具有耐温(25-40 °C )、耐酒精度(0_29%)、耐酸 CpH 2. 5-8. 5)、耐糖(0. 5-6. 5%)、耐氧，产气能力强，生长快速等特性，为酸面团发酵、葡萄酒酿造、动物饲料生产、工程菌构建提供了优良的候选菌株。
图1为酿酒酵母菌落形态。图2为酿酒酵母菌体形态。图3 DGGE分析结果。图4测序基因碱基序列。图5为酿酒酵母对葡萄糖的耐受实验。图6为酿酒酵母对酸的耐受实验。图7为酿酒酵母对温度的耐受实验。图8为酿酒酵母对酒精的耐受实验。图9为酿酒酵母在需/厌氧条件下的生长曲线。图10为酿酒酵母产气状况。实施例1
1.葡萄酒原液倍比稀释，取100 μ L涂布于YPD或BHI琼脂平板，37°C、厌氧或好氧条件下培养至M-36小时，选取菌落数范围在30-300的平板进行活菌计数并观察其菌落形态；同时，挑选不同菌落形态的菌体进行下一步验证。2.将挑选得到的7株菌进行革兰氏染色，于油镜下观察其菌体形态。3.以上每种菌液各取1 mL提取基因组DNA 向2 mL离心管中加入700 ？ L的裂解缓冲液[500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0，50 mM EDTA, 4% SDS]，300 ？ L 酚 / 氯仿 / 异戊醇(25 :24 :1，！Iomega)和 0. 4 g 玻璃珠(0.35 g/0. 1 mm, 0. 05 g/0. 5 mm), 混勻，并将离心管置于涡旋振荡器上振荡10 min，20000Xg离心5 min后，向上清液中加入 150 ？ L 10 M乙酸铵，DNA随即使用两次酚/氯仿/异戊醇提取和一次氯仿提取，异丙醇沉淀，70% 乙醇洗涤，风干后，加入 100 ？ L TE缓冲液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 溶解 DNA 沉淀，加入 2 lRNase (10 mg/ml)在 37°C孵育 15 min。4.扩增 18S rDNA 引物为 FF390(F) (5' - CGATAACGAACGAGACCT -3' )，FR1 (R) + (5' - CCCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGCCGAICCATTCAA
TCGGTAIT -3')扩增体系(50 ？ L 包括 100 ng DNA 模板，IX EX Taq buffer, 200 μ M dNTP, 200 nM 各引物，1. 5 mM MgC12, 670 ng/μ L BSA, 1.25 U EX Taq DNA 聚合酶)参照 Muyzer 等方法。反应条件94 "C, 5 min; 94 "C 30 s;56 "C, 30 s;72 °C，1 min, 30 个循环；72 °C，7 min。5.使用8 %聚丙烯酰胺凝胶，35 % 65 % [100%变性梯度包含40% (ν/ν)甲酰胺和 7 M尿素]变形梯度。电泳采用 DCode Universal Mutation Detection System (变性梯度凝胶电泳仪，Bio-fcid Laboratories, Hercules, CA, USA)，首先在220 V电压下预电泳10 min，随后在85 V的固定电压下电泳16 h。电泳结束后，进行硝酸银染色。6.实验结果如图1-4所示从DGGE胶上可以看到，菌株1_4为相同菌且在葡萄酒中占优势；对其相应条带切胶测序得到其对应碱基序列(图4)，经BLAST比对后确定其为酿酒酵母ATCC9763。该酿酒酵母菌落形态与细菌相似(图1)，但较大较厚，呈乳白色，表面湿润、粘稠，易被挑起；菌体形态为单细胞(图2)，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠蒙形，出芽形成的子细胞尚未与母细胞分开，又长了新芽，形成成串的细胞。实施例2
1.将酿酒酵母ATCC9763按1%的量接种到含葡萄糖浓度为0. 5、1.5、2.5,3.5, 4.5、 5. 5、6. 5%的液体YPD中，37 °C需氧条件下培养M h，于OD6tltl下测定其吸光值。2.实验结果如图5所示随糖浓度升高，其菌体数量先上升后下降。糖浓度为 5. 5%时该菌生长状态最好，其0D_=3. 89 ；糖浓度升高，其生长受抑制，当糖浓度为6. 5%时， OD600=3. 44。实施例3
1.将酿酒酵母ATCC9763按1%的量接种到pH值不同的液体YPD中(2. 5、3. 5、4. 5、 5.5、6.5、7.5,8.5),37 V需氧条件下培养M h，于OD6c 下测定其吸光值。2.实验结果如图6所示随pH升高，其菌体数量总体表现为先上升后下降。当 pH=2. 5时，菌体数量最少0D_=0. 66 ；pH=6. 5时，菌体数量达到最高，其OD6tltl=L 60 ；之后，菌体数量随PH升高而减少。实施例4
1.将酿酒酵母ATCC9763按1%的量接种到液体YPD中，于25、30、37、42 °C需氧条件下培养M h, 0D_下测定其吸光值。2.实验结果如图7所示随温度升高，其菌体数量总体表现为先上升后下降。25°C 时，菌体数量最少，0D_=2. 19 ；温度为30 °C时，菌体数量达到最高，其0D6(1(1=2. 93 ；之后，菌体数量开始下降，40 °C时其OD6tltl=L 88。实施例5
1.将酿酒酵母ATCC9763按1%的量接种到含酒精浓度为0、2、4、5、6、8、9、10、12、 13、14、16、17、18、21、25、29% 的液体 YPD 中，37 "C 需氧条件下培养 24 h，于 OD6tltl 下测定其吸光值。2.实验结果如图8所示随酒精度升高，其菌体数量总体呈下降趋势，当酒精度高于8%时，菌体数量少且生长缓慢，其OD6qq=O. 036。尽管如此，我们用肉眼可以很清楚看到大量气泡贴附在试管壁上，间接表明0-29%酒精度下酿酒酵母ATCC9763可以存活且产气(图 10)。实施例6
1.将酿酒酵母ATCC9763按1%的量接种到液体YPD中，37 °C，在需/厌氧条件下，采用OD6tltl测定法测定不同时间(4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)酿酒酵母 ATCC9763的生长曲线。2.实验结果如图9所示0-8 h，需氧和厌氧条件下酿酒酵母ATCC9763差别不大； 之后，需氧条件下酿酒酵母ATCC9763菌体量明显高于厌氧条件，20 h，需氧菌和厌氧菌均达到最高生长量，需氧条件0D_=3.观，厌氧条件0D_=2. 80 ；之后，菌体数量有所下降。
权利要求
1.一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，其特征是利用YPD培养基平板计数法和DGGE法分析葡萄酒原液菌群数量和组成并筛出7株菌，结合DGGE分析和测序结果，确定其中的酿酒酵母ATCC9763为葡萄酒中优势菌。
2.根据权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，其特征是，在YPD培养基中分别添加不同浓度的葡萄糖和酒精，24 h后测定其0D_值，检测不同浓度糖和酒精对其生长的影响作用。
3.根据权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，其特征是，将YPD培养基调为不同的pH值，24 h后测定其OD6tltl值，检测不同pH值对其生长的影响作用。
4.根据权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，其特征是，将培养菌置于不同温度，24 h后测定其OD6tltl值，检测不同温度对其生长的影响作用。
5.根据权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选，其特征是将培养菌分别置于需氧和厌氧条件，每隔2 h取样测定其OD6tltl值，绘制其生长曲线并比较其在需氧和厌氧条件下OD值的异同。
6.一种权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的应用，其特征是是酿酒酵母ATCC9763应用于葡萄酒酿制该酿酒酵母可以在糖浓度0. 5-6. 5%的环境下大量生长，可以耐受0- %的酒精度，需/厌氧条件下皆可存活，因此可应用于葡萄酒生产工业。
7.—种权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的应用，其特征是酿酒酵母ATCC9763应用于酸面团发酵该酵母可在pH 2. 5-8. 5下大量生长，耐酸能力强，可抵抗酸面团中乳酸菌产生的酸性物质；生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，产CO2能力强，可应用于酸面团发酵产业。
8.—种权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的应用，其特征是酿酒酵母ATCC9763应用于动物饲料生产该酵母生长迅速，22 h内可达到对数稳定期，可为动物饲料提供较多蛋白质，B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物质；该酵母耐酸能力强，可联合益生菌如乳酸菌一起使用，改善饲料风味，为动物提供益生物质；此外，该酵母需/厌氧条件下皆可存活，为生产用饲料深层发酵提供有利条件。
9.一种权利要求1所述的一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的应用，其特征是酿酒酵母ATCC9763可应用为工程菌株该酵母生长迅速，需/厌氧下皆可高量生长，容易培养，可作为模式生物，研究酵母生物信息学和健全异源基因在酵母中进行功能互补。
全文摘要
一株耐高糖、高酒精和高酸酿酒酵母ATCC9763的筛选和应用，其应用如下1、利用该酿酒酵母耐受高糖、高酒精和生长快速等特点，可应用于葡萄酒发酵和生产；2、利用该酿酒酵母产气量大、生长快等特点，可应用于酸面团发酵生产；3、利用该酵母耐高酸，需/厌氧皆可生长等特点，可应用于动物饲料发酵生产；4、利用该酿酒酵母生长快，需/厌氧皆可生长等特点，可用作基因工程菌株。本发明的优点是来源于农家自制葡萄酒的酿酒酵母ATCC9763，具有耐高酸、高糖、产气量大、生长迅速等特点，可应用于葡萄酒生产，酸面团发酵和动物饲料发酵；此外，因该酿酒酵母生长迅速，需/厌氧皆可生长，可作为良好的工程候选菌株。
文档编号A21D8/04GK102373160SQ20111011697
公开日2012年3月14日 申请日期2011年5月8日 优先权日2011年5月8日
发明者万翠香, 姜淑英, 徐锋, 汪孟娟, 熊顺强, 许恒毅, 陈廷涛, 魏华 申请人:南昌大学