专利名称：一株耐酸酵母及其代谢工程构建产l-乳酸重组菌的方法
技术领域：
本发明涉及一株耐酸酵母的筛选，以及产L-乳酸重组菌的构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
乳酸(Lactic acid)是一种重要的有机酸，广泛地存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸因其安全性、光学特性及其特殊的分子结构被广泛应用于食品、医药和化妆品等工业。乳酸分子内含有一个不对称的C原子，存在光学异构现象，具有D-型和L-型两种。由于人体只能利用L (+)-乳酸，因此世界卫生组织提倡在食品及医药行业使用L (+)-乳酸取代目前普遍使用的DL (+)-乳酸；另外L-乳酸的一个重要用途为合成聚乳酸，聚乳酸因可以由可再生资源生产并能被生物所降解而被认为是最有发展前景的聚合物之一。L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。现国内外研究的L-乳酸生产菌主要集中在乳杆菌、Lac tobacillus )、芽孢杆菌(Macillus )、乳球菌Uac tococcus )和根霉 0%办0/7狀)。在乳酸发酵过程中，pH值会随着乳酸的生成而逐渐降低，由于细菌和根霉菌耐酸性较差，当发酵液处于酸性时将影响菌株的生长和发酵能力。因此，工业上乳酸发酵过程常采用CaCO3作为中和剂，以维持最适pH值。但是乳酸钙结晶细小，结晶过程不易控制， 30%乳酸钙残留在结晶母液中，不能结晶出来，大量的副产物(石膏)会造成环境污染，成为乳酸生产企业三废处理的关键点和难点。相对于细菌和霉菌，酵母菌具有更好的耐酸特性，因此国内外研究者将研究重点逐渐转为利用基因工程方法改造遗传背景清晰的酿酒酵母，使其能够生产乳酸。虽然重组菌株在较高的酸性条件下能够生存和生长，但产乳酸能力普遍不强。Adachi E等人研究的重组产乳酸酵母在PH 3. 5时乳酸的最终产量仅为在pH 4. 5时的60%(Adachi Ε, Torigoe Μ, Sugiyama Μ, et al. Modification of metabolic pathways of Saccharotnyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate decarboxylase genes for the lactic acid fermentation at low pH value. J Ferment Bioeng, 1998，86(3) : 284-289. )0之后，Skory CD所研究构建的重组产乳酸酵母的最适PH值为5.0，当发酵液pH值低于5. O时，乳酸产量将有所降低(Skory CD. Lactic acid production by Saccharomyces cerevisiae expressing a Rhizopus oryzae lactate dehydrogenase gene. J Ind Microbiol Biotechnol (2003) 30: 22 - 27.)。因此后来研究者在利用重组产乳酸酵母进行发酵时，在发酵液中还是需要加入一定量的中和剂调节发酵液PH值。
发明内容
本发明的目的是为克服上述乳酸生产菌耐酸性不强的缺点，筛选出一株耐高浓乳酸且不利用乳酸的耐酸酵母菌株，在此基础上通过代谢工程改造，增加该菌株的乳酸代谢途径，使其能够在较低PH值下正常发酵生产L-乳酸。
为实现本发明的目的，本发明所采用的技术方案为
一株能够在以乳酸调节PH到2. 5的培养环境中生长但不利用乳酸的菌株，命名为木兰假丝酵母C4 {Candida magnoliae C4)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO :M2010362。一株木兰假丝酵母C42 {Candida magnoliae C42)，其为对所述的木兰假丝酵母 C4进行基因重组，获得木兰假丝酵母C42具有在低pH条件下发酵生产L-乳酸的性能。所述的木兰假丝酵母C42，在于将来源于米根霉As3. 819的乳酸脱氢酶编码基因 IdhA插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体，构建了重组质粒p^(212-h/7MX-A/AA，并电转化入木兰假丝酵母C4中，得到木兰假丝酵母C42。( 1)耐酸酵母菌株的筛选
称取5 g自然样品(采集自无锡市太湖边的土样)，加至含100 mL无菌生理盐水及玻璃珠的三角瓶中，在30°C下，150 r/min振荡打散30 min ；样品悬液用无菌生理盐水进行系列稀释，选择适合的稀释度，分别涂布于YEPD平板，30°C培养5 7 d，观察菌落生长情况，并将新长出的形态上有差异的单菌落挑出。从分离得到的单菌落中挑取典型的酵母菌落分别接种于以乳酸调节PH值至4的YEPD液体培养基中，30°C培养48 h。选择生长较好的酵母菌株依次接入含有93.5 g/L乳酸的筛选培养基中，培养48 h，选择出长势最好一株耐酸酵母，命名为C4。通过形态学和分子生物学鉴定，此耐酸酵母的分类地位属于木兰假丝酵母 Candida magnoliae {C. magnoliae)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO :M 2010362。(2)米根霉As3. 819的乳酸脱氢酶编码基因、lcM)的获得
提取米根霉As3. 819的染色体DNA，以其为模版进行PCR扩增，所用引物如下 Rl 5' -CGCGGATCCATGGTATT ACACTCA-3‘ R2 5' -CCGAAGCTTTCAACAGCTACTTTTA-3‘
PCR方法如下50 “1^反应体系中加入1011111101/1的引物1 1和1 2各1 yL，2mmol/ L 的 dNTP 5 μ L, 10 XExTaq Buffer 5 μ L，5 U/ μ L 的 ExTaq DNA 聚合酶 0.5 μ L,模板 1 μ L，加双蒸水补齐50 μ L ;PCR扩增条件95°C预变性5 min ;94°C变性30 s、55°C退火60 s、72°C延伸60 s，共30个循环最后72°C延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段回收试剂盒回收出1.01Λ的目标片段；纯化好的目标片段经I和历^d III双酶切，用 PCR片段回收试剂盒回收；p^(212-h/7MX经过I和历/ d III双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化后涂布含30 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板，37°C培养过夜；随机挑选6个菌落， 接种于30mL含30 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中37°C培养过夜，提取质粒，通过及I和 HinA III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有15%甘油的LB培养基中，冷冻保存于_70°C ；重组质粒命名为儿阳性重组子命名为JM109/
儿重组耐酸酵母命名为C42 ； (3)重组耐酸酵母C42的构建
取一支冷冻保存的JM109/pYX212-h/ MX-A/A儿接种于30 mL含30 μ g/mL卡那霉素的 LB培养基中37°C培养过夜，提取质粒，用电转化法转化野生型耐酸酵母C magnoliae,堵化子涂布于含800 μ g/mL G418抗生素的YEPD平板(G418抗性平板)，于30°C、培养2天； 长出的菌落重新划线至G418抗性平板，长出菌落初步确定为阳性转化子，再通过菌落PCR， 验证重组质粒miU-karm-ldhA已经转化入耐酸酵母C ffl^/^/iae，再将此重组菌进行细胞破碎，细胞破碎液稀释适当浓度后进行SDS-PAGE电泳，验证外源乳酸脱氢酶基因已经在耐酸酵母C ffl^T^/iae中得到表达。G418是一种与庆大霉素相关的氨基糖苷，是一种硫酸新霉素的类似物，其会干扰 80 S核糖体的功能以及真核细胞中的蛋白质合成，通常用作真核细胞(酵母菌)的选择试剂。为高效挑选阳性转化子，本发明将编码G418抗性的插入载体ρ (212，构建了载体 p^(212-々a/7MX。游离型表达载体讽2\2-kanWk-ldhA是将IdhA插入至载体ρ (212上启动子TPI 的下游，使其在载体12-kanWk上进行表达。基因IdhA的获得，载体12~kanWk-ldhA 的构建，基因IdhA在耐酸酵母中的表达详见实施例。该重组耐酸酵母能检测到乳酸脱氢酶(LDH)酶活，成功将A/似在耐酸酵母中表达，且异源基因的表达对酵母的生长没有影响，能以葡萄糖为底物进行发酵，发酵48 h后， 发酵液中能检测到L-乳酸。(4)用构建的重组耐酸酵母C42发酵产L-乳酸以葡萄糖为底物的发酵详见实施例。本发明的有益效果本发明为在自然界样品中筛选具有耐乳酸能力的酵母菌株， 通过代谢工程改造使其在低PH条件下具有较强的L-乳酸生产能力，L-乳酸产量达到42 g/L以降低产酸时中和剂的用量，节约成本，此研究结果在国内外尚无报道。利用G418抗性平板选择有本发明构建的载体m2\2-hmWl-ldM的耐酸酵母，即重组耐酸酵母。通过培养重组耐酸酵母，来检测发酵液中L-乳酸的含量。培养选择在250 mL摇瓶上进行，培养分两阶段，第一阶段主要用于酵母的生长，第二阶段主要用于产物合成；可以用高效液相色谱来检测L-乳酸，可以用SDS-PAGE检测异源蛋白的表达情况。依次对重组菌C42发酵条件发酵培养基初始糖浓度、发酵培养基初始PH值、发酵培养前期不同静置时间、发酵时不同接种量进行初步优化，获得L-乳酸产量达到42 g/L。生物材料样品保藏一株能够在以乳酸调节PH到2. 5的培养环境中生长但不利用乳酸的菌株，命名为木兰假丝酵母C4 (.Candida magnoliae C4)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，中国典型培养物保藏中心简写CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏日期为 2010 年 12 月 22 日，保藏编号为 CCTCC NO :M2010362。
图1 DNAman软件绘制耐酸酵母菌株的同源树图 2 质粒 pYX212-h/7MX
图 3 质粒 pYX212-h/7MX-A/似
图4质粒pYX212-h/7MX-A/似的验证
Lanel 载体 pYX212-h/7MXI 酶切；
Lane2重组质粒》TL2\2-kanm-ldhA PCR扩增A/似验证；
Lane3 重组质粒pYX212-h/7MX-A/似及I和历/ d III双酶切；Lane4 重组质粒 pYX212-h/7MX-A/似及I 酶切； λ DNA/Ai I marker。图5重组耐酸酵母的SDS-PAGE分析 Lanel耐酸酵母C magnoliae ；Lane2, Lane3重组耐酸酵母；Lane4蛋白分子量标准
图6不同初始糖浓度对重组耐酸酵母C42发酵产L-乳酸的影响20 g/ L( ■ ) ；60 g/L( · ) ；100 g/L( ▲ ) ；140 g/L ( ) ；180 g/L ( * ) ；200 g/L(
.·图7不同初始pH值对重组耐酸酵母C42发酵产L-乳酸的影响pH2.5( ■)； ρΗ3· 0 ( · ) ；ρΗ3· 5( A ) ；ρΗ4· 0 ( ) ；ρΗ7· ()(★)。图8不同静置培养时间对重组耐酸酵母C42发酵产L-乳酸的影响用于生长菌体的通风培养时间 0 h(_) ;8 h(·) ；16 h( A) ；24 h( ) ；32 h(*) ； 40 h( ·')
图9不同接种量对重组耐酸酵母C42发酵产L-乳酸的影响以接种后发酵液菌浓为标记 OD600=S、舊)',OD600=IQ ( · ) -,OD600=lh{ L· ) ’ 0 _=20(· ) ’ Ο _=25( ·)
具体实施例方式实施例1 耐酸酵母菌株C4的筛选
称取5 g自然样品(采集自无锡市太湖边的土样)，加至含100 mL无菌生理盐水及玻璃珠的三角瓶中，在30°C下，150 r/min振荡打散30 min ；样品悬液用无菌生理盐水进行系列稀释，将稀释倍数为10_7的稀释液涂布于YEPD平板，30°C培养5 7 d，观察菌落生长情况， 并将新长出的形态上有差异的单菌落挑出。从分离得到的单菌落中挑取典型的酵母菌落分别接种于以乳酸调节PH值至4的YEPD液体培养基中，30°C培养48 h。选择生长较好的酵母菌株依次接入含有93. 5g/L乳酸的筛选培养基中，培养48 h，选择出长势最好一株耐酸酵母，命名为C4。实施例2 耐酸酵母菌株C4的鉴定 1)形态特征
细胞形态学观察取耐酸菌株培养至平衡期后分别移接于YEPD培养基中，25°C下培养 3天后进行其细胞形态特征和繁殖方式观察。酵母群体形态观察取待鉴定菌株培养至平衡期后分别移接于YEPD培养基中，25°C下培养3天后进行平板菌落形态观察。耐酸酵母的菌落形态特征为单菌落直径2 mm，呈白色不透明乳脂状，饱满，边缘光滑，有光泽，表面凸起，较粘稠，菌落颜色和质地都比较均一；细胞形态特征为细胞呈卵形或球形，多边芽殖。2)分子生物学鉴定
酵母DNA的提取方法参照分子克隆实验手册，所用引物为真菌ITS通用引物， 上游 ITS1:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘， 下游 ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘； PCR扩增产物经电泳检测后测序，测序结果如下
AACCTGCGGA AGGATCATTT CTGAACAACC TTTGCATAGT GAACAACCTC TACGGGGGTG 60 AATGCTTCCG GTTCGCCGGA CAACAACTAG TAATTTTGAA TCTGATACGT TAAAGAAAAA 120 CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTCGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA GCGCGATAGG 180TAATGCGAAT TGCAGACGTG AGTCATTGAA TCTTTGAACG CACATTGCGC CAGTTTACTG 240 GCATACTGCG TTGAGCGTCG GCCTTCCTCC ACAGGTATTG CTGTTTGCAA CAGTCAAAGG 300 CATGGAAGCG CACCCGTTAG TAAAACGGTG CAAAACCACA340
将所得序列在核酸序列数据(GenBank)中进行同源序列搜索，将相关酵母菌种的ITS 区域序列与待测菌株序列一起，绘制同源树(homology trees)，显示供试菌株与序列数据库中已知酵母菌的亲源关系，如附图1所示。3)生理生化鉴定
同化氮(碳)源试验将新鲜的待测酵母菌株用无菌水洗涤后，涂布于同化氮(碳)源固体培养基上，28°C培养2-3 d，观察菌落生长情况，结果如表1所示。表1菌株C4的生理生化特征
权利要求
1.一株能够在以乳酸调节PH到2. 5的培养环境中生长但不利用乳酸的菌株，命名为木兰假丝酵母C4 {Candida magnoliae C4)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC NO :M2010362。
2.一株木兰假丝酵母magnoliae C42)，其特征在于对权利要求1所述的木兰假丝酵母C4进行基因重组，获得木兰假丝酵母C42具有在低pH条件下发酵生产L-乳酸的性能。
3.权利要求2所述的木兰假丝酵母C42，其特征在于将来源于米根霉As3.819的乳酸脱氢酶编码基因7^/似插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体，构建了重组质粒 p^(212-h/7MX-A/AA，并电转化入木兰假丝酵母C4中，得到木兰假丝酵母C42。
全文摘要
一株耐酸酵母及其代谢工程构建产L-乳酸重组菌的方法，属于基因工程技术领域。本发明筛选分离得到一株能在pH2.5条件下生长且不利用乳酸的酵母，鉴定为木兰假丝酵母C4(CandidamagnoliaeC4)，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNOM2010362；将来源于米根霉As3.819的乳酸脱氢酶编码基因(ldhA)插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体，构建了重组质粒pYX212-kanMX-ldhA；电转化入木兰假丝酵母C4中，得到一株具有产L-乳酸能力的重组菌株木兰假丝酵母C42，其产乳酸量达到42g/L。本发明所构建的木兰假丝酵母C42具有耐乳酸的明显优势，在生产中可以大幅度降低中和剂CaCO3的用量，减少环境污染。
文档编号C12N15/81GK102199553SQ20111011678
公开日2011年9月28日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者丁重阳, 张勤, 张梁, 李由然, 王正祥, 石贵阳, 顾正华 申请人:江南大学