专利名称：重组人血管内皮细胞抑制素在毕赤酵母系统中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及人血管内皮细胞抑制素基因的克隆，含有该基因的酵母表达载体的构建以及将该基因产物在含有表达质粒的毕赤酵母中的可溶性分泌型蛋白的生产及其在肿瘤治疗中的应用。
自1997年，Folkman实验室报导了人血管内皮细胞抑制素(endostatin)能通过抑制新生血管的形成、切断肿瘤的血供、从而能抑制几乎所有实体肿瘤的生长以来，世界各国科学家及制药企业争相采用各种表达系统生产重组人血管内皮细胞抑制素以满足科研及临床前期实验之需。目前报导最多的大肠杆菌表达系统虽具有产量高、成本低的优点，所表达的重组人血管内皮细胞抑制素几乎都属不溶性的，虽在实验动物中具有抗肿瘤生长之活性，但在人体上的应用将由于它的不溶性而受到限制。另一方面，已有的哺乳细胞表达系统或昆虫细胞烟草病毒表达系统虽然产生与天然类似的重组人血管内皮细胞抑制素，但由于产量低、成本高，亦不能满足临床前期实验所需，中国专利97107112.8和99116065.7描述了基本相同的两种重组人血管内皮细胞抑制素的克隆方法和大肠杆菌表达体系，虽然后者也公开了使用不同的几种酵母作为表达体系，但对其应用未作详细描述，也未能就其特点进行说明。
本发明所采作的毕赤酵母表达系统与上述专利中描述的表达系统不同，既具备大肠杆菌表达系统的产量高、易扩大生产和成本低的优点，又具有其他真核表达系统的优越性，包括蛋白质翻译后的化学修饰及高级结构的折叠形成。而且由于人血管内皮细胞抑制素在本系统中是以一种与酵母α因子信号短肽形成的融合蛋白表达。这样，人血管内皮细胞抑制素在酵母中表达后被分泌到培养液中。这一分泌过程，不仅使人内皮细胞抑制素进行结构上的修饰，折叠使其在构象上与天然重组人血管内皮细胞抑制素接近，而且大大地简化了纯化过程。
本发明的目的在于提供一个高级的酵母表达系统以生产可溶性的具有生物活性的重组人血管内皮细胞抑制素，该产品可作为一种生物制品药物应用于人类肿瘤病的治疗。
本发明的目的是通过以下措施来达到的1、克隆编码人血管内皮细胞抑制素的基因本发明的人血管内皮细胞抑制素的编码序列是用PCR法从人乳腺cDNA文库中克隆得到的。它的序列相当于人胶原蛋白ⅩⅧ cDNA第1501至2055核苷酸片断(Genomics 19:494-499,1994)。全长555碱基对。其DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列1(SEQID NO.1)2、构建含有人血管内皮细胞抑制素基因的酵母表达质粒。
按常规分子克隆方法，将PCR扩增的人血管内皮细胞抑制素编码基因片断，经一定的酶切之后，插入酵母表达载体，pPICZαA(Invitrogen)，使其与α-因子信号短肽表达成融合蛋白，所得表达质粒称为pPICZαA-Endo。其构建过程见
图1。3、用pPICZαA-Endo表达质粒转化毕赤酵母GS115并筛选高效表达株，CS115/pPICZαA-Endo。4、高效表达株GS115/pPICZαA-Endo的培养与甲醇诱导表达。
将单菌落接种于BMGH培养液，30℃振摇培养过夜。次日转接种于较大体积的同种培养液，30℃继续培养至O.D600=16-20。离心收集细胞，将细胞悬浮于BMMH诱导培养液，30℃，振荡培养，每24小时加入甲醇，使其最终浓度为1％。4天后离心收集上清。5、重组人血管内皮细胞抑制素的纯化上述收集的上清经超滤浓缩至一定体积后，用肝素sepharose亲和层析拴纯化。用SDS-PAGE检测其分子量大小及相对纯度，冻干，-70℃保存。SDS-PAGE电泳图谱见图2。6、本发明所生产的人血管内皮细胞抑制素对人血管内皮细胞HUV-EC和HMEC生长的抑制作用。
将所纯化的重组人血管内皮细胞抑制素加入含有人血管内皮细胞HUV-EC或HMEC的培养液中，三天后，用3H-胸腺嘧啶掺入法或用磺酰罗丹明B(SRB)蛋白染色法，测量人血管内皮细胞抑制素对血管内皮细胞增殖的抑制活性。如图3所示，本发明所生产的人血管内皮细胞抑制素对HUV-EC(图3A)和HMEC(图3B)呈剂量依赖性抑制，其IC50分别为1μg/ml(HUV-EC)和10μg/ml(HMEC)。这一结果与文献报导的结果十分相似(cancerRes.60:2190-2196,2000)；cancer Res.59:189-197,1999)7、本发明所纯化的重组人血管内皮细胞抑制素对小鼠S-180肉瘤的生长具有明显的抑制作用(表1)。
如表1所示，此重组人血管内皮细胞抑制素以6mg/kg体重注射于S-180肉瘤小鼠，三天后，肿瘤生长被抑制48％。以12mg/kg体重注射三天，肿瘤生长抑制率为53％。此结果与文献报导结果相当(cancer Res.59:189-197,1999)。
以下为图表说明
图1本发明克隆的人血管内皮细胞抑制素的DAN序列及由它所编码的氨基酸序列。
图2酵母表达质粒构建过程示意图。
图3本发明表达纯化的人血管内皮细胞抑制素的聚丙烯酰胺电泳图。
图4A、图4B本发明生产的重组人血管内皮细胞抑制素对人血管内皮细胞生长的抑制作用。
表1本发明生产的重组人血管内皮细胞抑制素对小鼠S-180肉瘤的实验治疗作用。
CAG-3＇3＇端引物5＇-GCC AGC GGC CGC CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAAGCT-3＇在5＇端引物上的同源序列之前加上EcoR1酶切位点，在3＇端引物的同源序列和终止密码之后加上Not1酶切位点。b．PCR反应以人乳腺cDNA文库为模板，用上述两个引物经PCR反应从文库中扩增出555碱基对长的人血管内皮细胞抑制素cDNA片断。PCR反应的条件为人乳腺cDNA文库，2微克，上述两种引物各0.5微克，10mmdNTPS 2微升，10×PCR缓冲液，10微升，TaqDNA聚合酶1微升，加水至最终体积100微升。PCR反应在PCR仪上按以下温度循环条件第一循环95℃2分钟，第二至第29循环94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 2分钟，最后一个循环94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 8分钟。将经Qiaqen PCR纯化试剂盒所纯化的PCR产物先次级克隆至TA克隆载体PCR2.1(美国Invitrogen公司产品)，经酶切和测序筛选后得到的含有人血管内皮细胞抑制素正确序列的克隆命名为PCR2.1/Endo。本发明所克隆得到的人血管内皮细胞抑制素的DNA序列及其编码的氨基酸序列见序列表1(SEQID NO.1)2、人血管内皮细胞抑制素酵母表达载体的构建如
图1所示，用限制性内切酶EcoR1和Not1将人血管内皮细胞抑制素cDNA从PCR2.1/Endo中切出，经凝胶电泳分离纯化后，再与经EcoR1和Not1消化后的酵母表达载体，pPICZαA(Invitrogen)连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选具有Zeocin耐药性的转化株，从这些耐药株中提取质粒，用酶切和测序分析筛选得到含有人血管内皮细胞抑制素正确序列并与α-因子在同一阅读框内的质粒。将这种质粒命名为pPICZαA/Endo。3、高效表达人血管内皮细胞抑制素的毕赤酵母重组株(GS115/pPICZαA/Endo的构建与筛选用限制性核酸内切酶Sac1切开环形表达质粒pPICZαA/Endo使之线型化。将线型化了的pPICZαA/Endo表达质粒转化毕赤酵母株GS115，筛选具有Zeoein耐药性的转化体。将所有的耐Zeoein转化体分别接种于少量培养液并用甲醇诱导表达(具体方法详见实例4)。离心收集上清，用SDS-PAGE电泳检测上清中所表达的人血管内皮细胞抑制素的量，从中筛选高表达株。4、人血管内皮细胞抑制素的表达与纯化a．菌种的培养与甲醇诱导将单个新鲜的毕赤酵母工程菌GS115(pPICZαA/Endo)接种于BMGH培养液，36℃，继续培养至0.D600 16-20。离心收集细胞，将细胞悬浮于1/5原体体积的BMMH诱导液中，30℃，振荡培养，每24小时加入甲醇使甲醇最终浓度为1％，四天后离心收集上清。取少量上清用15％SDS-PAGE电泳分析。如图2中的“crude”即粗制品中所出，未经纯化的上清中有明显的分子量为20KDa左右的蛋白带，此为酵母表达后分泌至上清中的可溶性人血管内皮细胞抑制素。b．重组人血管内皮细胞抑制素的纯化将离心收集的上清经centracon plus 80(Millpore)超滤浓缩至一定体积后，加样于肝素-sepharose亲和层析柱，用含50mm Nacl的50mm磷酸盐缓冲液洗柱后，先后用含0.2M Nacl,0.5M Nacl和1M Nacl的50mm磷酸盐缓冲液洗脱，分别收集洗脱样品，从各收集管中取出少许样品进行电泳分析，结果见图2。绝大部分重组人血管内皮细胞抑制素可被1M Nacl洗脱。经一步柱层析法所得到的重组人血管内皮细胞抑制素在SDS-PAGE上呈单一的分子量为20kd的蛋白带(图2)。将柱层析所收集的含人血管内皮细胞抑制素的蛋白溶液经PBS透析脱盐后，冻干，干燥，-70℃保存。此为纯化的重组人血管内皮细胞抑制素。
为测定用本系统重组生产的人血管内皮细胞抑制素的生物活性，采用3H-胸腺嘧啶掺入法和SRB染色结合细胞计数分别检测重组人血管内皮细胞抑制素对两种人血管内皮细胞HUV-EC和HMEC生长的抑制作用。将不同浓度的重组人血管内皮细胞抑制素加入含HUV-EC或HMEC细胞的培养液中，共同培养三天后，检测3H-胸腺嘧啶掺入量或SRB染色细胞计数，结果见图3。如图3所示，重组人血管内皮细胞抑制素对HUV-EC(图3A)和HMEC(图3B)均呈剂量依赖性抑制，其IC50分别为1μg/ml(HUV-EC)和10μg/ml(HMEC)，此结果与文献的结果十分类似(cancer Res,60:2190-2196,2000及cancerRes,59:189-197,1999)
测定结果还进一步证明，重组人血管内皮细胞抑制素对人血管内皮细胞生长的抑制是特异的，它对其他细胞及各种癌细胞包括P388小鼠白血病细胞、A-549人肺癌细胞、HL-60人白血病血液细胞以及BEL-7402人肺癌细胞的生长无效或仅呈极弱的抑制作用，重组人血管内皮细胞抑制素对血管内皮细胞作用的特异与天然的或其他表达系统所生产的人血管内皮细胞抑制素的作用特点相同。
权利要求
1．一种酵母表达载体pPICZαA-Endo。
2．权利要求1的酵母表达载体，其特征是该载体含有人血管内皮细胞抑制素基因并且该基因与α因子信号序列融合。
3．由权利要求2所述的表达载体转化的能表达人血管内皮细胞抑制素的毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-Endo。
4．用权利要求3所述的毕赤酵母菌株GS115/pPICZαA-Endo生产人血管内皮细胞抑制素的方法步骤为(1)菌种培养将单个新鲜菌落接种于培养液中，培养过夜，接种于较大体积培养液，连续振荡培养直至O.D600=16-20；(2)甲醇诱导离心收集上述菌种，将其悬浮于一定体积的诱导液中，振荡培养3-4天，每日加入新鲜甲醇使其最终浓度为1％；(3)表达产物纯化离心收集上清，浓缩至一定体积后，进行亲和层析纯化。
5．权利要求4的方法，其中的培养液是BMGH培养液。
6．权利要求4的方法，其中的培养温度为25-35℃。
7．权利要求4的方法，其中纯化层析柱采用肝素sepharose 4B进行亲和层析。
全文摘要
本发明用PCR法从人乳腺cDNA库中克隆得到人血管内皮细胞抑制素的基因,构建了含有该基因的酵母表达质粒pPICZaA—Endo及其转化的毕赤酵母工程菌株GS115/pPICZaA—Endo。并利用此重组菌株表达生产重组人血管内皮细胞抑制素。本表达系统既具有E.coli表达水平高、易扩大生产和成本低的特点,又具有真核表达系统的优越性如:蛋白质成熟过程、折叠和翻译后修饰机制。由本发明所生产的重组人血管内皮细胞抑制素经体外细胞培养实验和动物实验证明具有与天然重组人血管内皮细胞抑制素类似的抑制血管内皮细胞增殖和抑制肿瘤生长的生物活性,可以作为一种抗癌药用于实体肿瘤的治疗。
文档编号C12N15/62GK1305004SQ0110222
公开日2001年7月25日 申请日期2001年1月18日 优先权日2001年1月18日
发明者周益群 申请人:重庆康尔威科技开发有限公司