专利名称：含有高生物量的富铬酵母及其生产方法
技术领域：
本发明涉及发酵工业技术领域，特指一种含有高生物量的富铬酵母及其生产方法。
众所周知，铬作为人和动物体内的必需微量元素，在体内与蛋白质、核酸以及各种低分子量配体相结合，参与机体的正常糖、脂代谢，促进生物机体的生长与发育。铬在生物机体内的主要生物学功能是作为胰岛素的加强剂。在糖尿病、高血脂症的预防、控制和治疗研究中，发现补铬能明显改变糖尿病患者的糖耐量和降低血脂和胆固醇。因此铬对于改善葡萄糖耐量，预防和治疗糖尿病和其它疾病有着非常重要的意义。但是，口服实验充分证明无机铬在机体内的吸收率很，仅为0.6％，而口服有机铬，其吸收率达20％左右。此外，酵母细胞还含有丰富的蛋白质、核酸、维生素及机体必需的14种微量元素，对机体的健康有益。
近年来，尽管已有称做“富铬酵母”的生产，但这些生产存在明显的缺陷和不足其一是对酵母菌种没有进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，由于不同酵母菌种对铬的抗性有较大差异，从而对铬离子的吸收转化能力差异也很大。
其二是这些技术对发酵培养富铬酵母的培养基的铬离子浓度、培养条件未进行优化，因此培养的酵母细胞的铬含量较低、细胞生物量也较低。
其三有的专利及现有技术技术仅采用混合处理方法，将一定量的醋酸铬与酵母细胞混合，根本未将无机铬转化成为有机铬，这种将醋酸铬与酵母细胞混合在一起的称做“富铬酵母”，其吸收率很低，其生物作用较低，不是真正的富铬酵母。
其四有的专利及现有技术技术仅采用简单的吸附方法，将市场上的面包酵母悬浮于含有醋酸铬的水溶液中处理一定时间，使铬离子吸附于酵母细胞表面，这种处理仍然不能将无机铬转化成为有机铬，这种吸附有醋酸铬的酵母细胞与将醋酸铬与酵母细胞混合在一起的方法没有本质的区别，其吸收率及生物作用仍然较低，同样不是真正的富铬酵母。
其五有的专利及现有技术技术虽然采用在含有铬离子的培养基中培养酵母细胞，但是对酵母菌种没有进行任何筛选和育种，随机用一种酵母菌种，由于不同酵母菌种对铬的抗性有较大差异，从而对铬离子的吸收转化能力差异也很大。此外，这些技术对培养基的铬离子浓度、培养条件未进行优化，仅按照常规培养酵母的条件培养，因此培养的酵母细胞的铬含量较低一般每克干酵母细胞的有机铬含量在2000微克以下、细胞生物量也低、从而经济效益必然也较低。
本发明的目的在于提供一种含有高生物量的富铬酵母及其生产方法，通过现代高新生物技术，依据不同酵母菌种的生理生化特性，通过筛选，获得生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种，然后采用原生质体融合育种技术，选育出高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，在优化的发酵条件下发酵培养，生产高生物量和高铬含量的富铬酵母。
本发明的目的是这样实现的一种含有高生物量的富铬酵母，其特征在于它是通过筛选，获得生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种，然后采用原生质体融合育种技术，选育出高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，在优化的培养条件下发酵培养获得含有高生物量的富硒铬母，每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。
一种含有高生物量的富铬酵母的生产方法，其特征在于它包括如下步骤(一)制备高生物量的富铬酵母菌种通过分子育种的手段获得高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，采用的具体方法是1)依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有一定铬浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，测定交配型；3)将分离到的生物量高的酵母菌单倍体菌株以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌单倍体菌株，经培养后，制备原生质体，以聚乙二醇为助融剂，进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高铬含量的二倍体融合菌株，即高生物量的富铬酵母菌种。
(二)发酵制备高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种其发酵培养基配方及发酵培养优化条件为麦芽汁培养基，总糖含量为10～20％，培养基中醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升，培养基的pH为4.5-7.0，种子液的接种量为5～20％，在25～32℃搅拌培养20～40小时(三)生产高生物量和高铬含量的富铬酵母其生产工艺包括包括如下步骤斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母；该各生产工艺条件为1)斜面菌种富铬酵母菌种接种于含有总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25～32℃培养48小时后，放入4℃冰箱中保存；2)液体菌种将保存的富铬酵母活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃摇床振荡，培养16～24小时，制成为液体菌种；
3)一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃条件下摇床振荡培养16～24小时，即为一级液体种子培养物；4)二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为二级液体种子培养物；5)三级液体种子培养将二级种子培养液按5～20％的接种量接入装有450升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为三级液体种子培养物；6)发酵罐发酵培养将三级种子培养液按5～30％的接种量接入装有2250升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐中，在25℃～32℃条件下，培养20～40小时，即为发酵罐发酵培养物；7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富铬酵母细胞，在45～85℃条件下风干，干燥为水分小于10％；8)粉碎用粉碎机将风干的富铬酵母细胞粉碎；9)包装用不透气的包装袋包装，即为本发明的含有高生物量和高铬含量的富铬酵母产品，每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。
该发酵培养基配方和培养条件是以淀粉水解糖为培养基，其配方如下总糖量为12％的淀粉水解糖，1％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，1000微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为5.0，种子液的接种量为20％，28-30℃搅拌培养25小时；该生产工艺为斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母。该发酵培养基配方和培养条件是以蔗糖糖蜜或甜菜糖蜜为培养基，其配方如下16％总糖量的糖蜜、0.8％的玉米水解液，0.6％硫酸铵，0.1％磷酸，1200微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为6.0，种子液的接种量为15％，27-31℃搅拌培养30小时；该生产工艺为液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。该高生物量和高铬含量的富铬酵母的生产工艺包括四级液体种子培养。该高生物量和高铬含量的富铬酵母的生产工艺包括随实际生产条件做适当的增加或减少工艺的变化。
本发明的主要优点如下1)本发明使用的富铬酵母菌种不仅具有高生物量，而且细胞的有机铬含量高，每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。而现有技术产品为每克干酵母细胞含有机铬在2000微克以下。
2)本发明使用的发酵底物为普通的麦芽汁，或用淀粉水解糖或糖蜜作发酵底物，只需调节其总糖含量，添加醋酸铬及少量的辅料，原料便宜，成本低廉。
3)本发明对发酵设备及条件没有特殊要求，一般发酵厂的设备和条件均可生产，不需要特殊设备投资。
4)本发明生产的富铬酵母安全无毒，投资少、见效快、效益高。
5)本发明的生产方法实用性强，操作简便，易于大引比量生产或因陋就简普遍推广。
6)本发明生产的富铬酵母产品的生物量高，酵母细胞的有机铬含量高，质量好。
下面结合较佳实施例和附图进一步说明。
图1是本发明的生产工艺示意图。
实施例1参阅
图1，本发明的生产工艺包括如下步骤(一)制备高生物量的富铬酵母菌种因为自然界中没有生物量和细胞铬含量同时都高的酵母菌种，只能通过分子育种的手段才能获得高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，采用的具体方法是1)依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有一定铬浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，测定交配型；3)将分离到的生物量高的酵母菌单倍体菌株以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌单倍体菌株，经培养后，制备原生质体，以聚乙二醇为助融剂，进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高铬含量高的二倍体融合菌株，即高生物量的富铬酵母菌种。
(二)发酵制备高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种其培养基配方及发酵培养优化条件为麦芽汁培养基，总糖含量为10～20％，培养基中醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升，培养基的pH为4.5-7.0，接种量为5～20％，在25～32℃搅拌培养20～40小时(三)生产高生物量和高铬含量的富铬酵母其生产工艺包括如下步骤斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母。下面详细说明各生产工艺1)斜面菌种富铬酵母菌种接种于含有总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25～32℃培养48小时后，放入4℃冰箱中保存；2)液体菌种将保存的富铬酵母活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃摇床振荡，培养16～24小时，制成为液体菌种；3)一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃条件下摇床振荡培养16～24小时，即为一级液体种子培养物；4)二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为二级液体种子培养物；5)三级液体种子培养将二级种子培养液按5～20％的接种量接入装有450升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为三级液体种子培养物；6)发酵罐发酵培养将三级种子培养液按5～30％的接种量接入装有2250升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐中，在25℃～32℃条件下，培养20～40小时；7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富铬酵母细胞，在45～85℃条件下风干，干燥为水分小于10％；8)粉碎用粉碎机将风干的富铬酵母细胞粉碎；9)包装用不透气的包装袋包装，即为本发明的含有高生物量和高铬含量的富铬酵母产品，每克干酵母细胞的有机铬含量达3200微克。
当然，本发明的方法可根据厂家的发酵设备及条件对以上工艺作适当增加或减少的调整变动。
实施例2本实施例中，是以淀粉水解糖为培养基，其配方如下总糖量为12％的淀粉水解糖，1％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，1000微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为5.0，种子液的接种量为20％，28-30℃搅拌培养25～40小时。
生产工艺为斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母，每克干酵母细胞的有机铬含量达2800微克。
其他条件同实施例1，故不重述。
实施例3本实施例中，是以蔗糖糖蜜或甜菜糖蜜为培养基，其配方如下16％总糖量的糖蜜、0.8％的玉米水解液，0.6％硫酸铵，0.1％磷酸，1200微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为6.0，种子液的接种量为15％，27～33℃搅拌培养30～38小时。
生产工艺为液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母，每克干酵母细胞的有机铬含量达3000微克。
其他条件同实施例1，故不重述。
综上所述，本发明的技术是充分利用微生物分子遗传与育种的专业优势，依据不同酵母菌种的生理生化特性，通过筛选，获得高生物量的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种，然后采用原生质体融合育种技术选育出高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，在优化的培养基中发酵培养获得高生物量和高铬含量的富铬酵母产品。这种高生物量和高铬含量的富铬酵母的生产技术具有成本低、原料广泛、操作简便、发酵周期短的特点，适合广泛地推广应用；其酵母产品细胞的生物量高和有机铬含量高的特点，因此具有重大的社会效益和巨大的经济效益。
权利要求
1.一种含有高生物量的富铬酵母，其特征在于它是通过筛选，获得生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种，然后采用原生质体融合育种技术，选育出高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，在优化的发酵培养基和发酵条件下发酵培养，生产含有高生物量的富铬酵母，每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。
2.一种含有高生物量的富铬酵母的生产方法，其特征在于它包括如下步骤(一)制备高生物量的富铬酵母菌种通过分子育种的手段获得高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种，采用的具体方法是1)依据不同酵母菌种的生理生化特性，在含有一定铬浓度的培养基中分别筛选生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种；2)对生物量高的酵母菌种以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种进行生孢、单倍体分离，测定交配型；3)将分离到的生物量高的酵母菌单倍体菌株以及抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌单倍体菌株，经培养后，制备原生质体，以聚乙二醇为助融剂，进行原生质体融合；4)在选择培养基上筛选高生物量和高铬含量的二倍体融合菌株，即高生物量的富铬酵母菌种。(二)发酵制备高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种其培养基配方及发酵培养优化条件为麦芽汁培养基，总糖含量为10～20％，培养基中醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升，培养基的pH为4.5-7.0，接种量为5～20％，在25～32℃搅拌培养20～40小时(三)生产高生物量和高铬含量的富铬酵母其生产工艺包括如下步骤斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母，下面详细说明各生产工艺1)斜面菌种富铬酵母菌种接种于含有总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁固体斜面上，在25～32℃培养48小时后，放入4℃冰箱中保存；2)液体菌种将保存的富铬酵母活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃摇床振荡，培养16～24小时，制成为液体菌种；3)一级液体种子培养将液体菌种按5～20％的接种量接入30个装有150毫升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的三角瓶中，在25～32℃条件下摇床振荡培养16～24小时，即为一级液体种子培养物；4)二级液体种子培养将一级种子培养液按5～20％的接种量接入装有45升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的小卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为二级液体种子培养物；5)三级液体种子培养将二级种子培养液按5～20％的接种量接入装有450升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的大卡氏发酵罐中，在25～32℃条件下，振荡培养16～24小时，即为三级液体种子培养物；6)发酵罐发酵培养将三级种子培养液按5～30％的接种量接入装有2250升总糖含量为10～20％、醋酸铬浓度为800～1600微克/毫升的麦芽汁培养基的发酵罐中，在25℃～32℃条件下，培养20～40小时，即为发酵罐发酵培养物；7)收集酵母细胞及干燥采用板框压榨或离心收集富铬酵母细胞，在45～85℃条件下风干，干燥为水分小于10％；8)粉碎用粉碎机将风干的富铬酵母细胞粉碎；9)包装用不透气的包装袋包装，即为本发明的含有高生物量和高铬含量的富铬酵母产品，每克干酵母细胞的有机铬含量达2000-4000微克。
3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该发酵培养基配方和培养条件是以淀粉水解糖为培养基，其配方如下总糖量为12％的淀粉水解糖，1％的玉米水解液，0.5％硫酸铵，1000微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为5.0，种子液的接种量为20％，在28-30℃的条件下，搅拌培养25小时；该生产工艺为斜面菌种→液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母。
4.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该发酵培养基配方和培养条件是以蔗糖糖蜜或甜菜糖蜜为培养基，其配方如下16％总糖量的糖蜜、0.8％的玉米水解液，0.6％硫酸铵，0.1％磷酸，1200微克/毫升的醋酸铬，培养基的pH为6.0，种子液的接种量为15％，27-31℃搅拌培养30小时；该生产工艺为液体菌种→一级液体种子培养→二级液体种子培养→三级液体种子培养→四级液体种子培养→发酵罐发酵培养→收集酵母细胞及干燥→粉碎→高生物量高铬含量的富铬酵母。
5.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该高生物量和高铬含量的富铬酵母的生产工艺包括四级液体种子培养。
6.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于该高生物量和高铬含量的富铬酵母的生产工艺包括随实际生产条件做适当的增加或减少工艺的变化。
全文摘要
一种含有高生物量的富铬酵母及其生产方法,它是通过筛选,获得生物量高的酵母菌种和抗铬能力强及细胞铬含量高的酵母菌种,然后采用原生质体融合育种技术,选育出高生物量和高铬含量的富铬酵母菌种,在发酵培养基和优化的发酵条件下发酵培养,制得含有高生物量的富铬酵母,每克干酵母细胞的有机铬含量达2000－4000微克。本发明生产的富铬酵母安全无毒,投资少、见效快、效益高。其生产方法实用性强,操作简便,易于大批量生产或因陋就简普遍推广应用。
文档编号C12N15/02GK1366037SQ0110220
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月17日 优先权日2001年1月17日
发明者张博润, 何秀萍, 铁翠娟 申请人:中国科学院微生物研究所