酵母细胞中的牛瘤胃木糖异构酶活性的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2013年3月11日提交的美国国内申请13/792308的权益，并且该申 请全文W引用方式并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及酵母的基因工程领域。更具体地，鉴定一组木糖异构酶，其在被工程化 W进行其表达的酵母细胞中是活性的。
【背景技术】
[0003] 当前，通常利用酵母，具体地讲酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)，使用由谷 物或麦芽浆作为碳水化合物源获得的己糖来发酵制备乙醇。期望使用由纤维素类生物质 制得的水解产物作为发酵的碳水化合物源，因为运是不与食物供应竞争的易于可再生的资 源。继葡萄糖之后，纤维素类生物质中的第二最丰富的糖为木糖，木糖为一种戊糖。酿酒酵 母本身不能代谢木糖，但其能够被工程化W利用将木糖转化成木酬糖的木糖异构酶活性的 表达W及附加的途径工程化来代谢木糖。
[0004] 已经限制了在酵母中是活性的异源木糖异构酶，并且具体地讲来源于细菌源的那 些的成功表达。已经报导一些特定的细菌木糖异构酶序列为酵母中木糖利用途径提供木糖 异构酶活性。例如，118 7,622,284公开了表达从厌气性瘤胃真菌任;[1'01]17〇68 3口.）中分离 的木糖异构酶的酵母细胞，其能够使用木糖作为底物。US2012/0184020公开了表达从生黄 瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens)中分离的木糖异构酶的真核细胞。W02011078262 公开了得自黄胸散白蚁和澳白蚁中的每一种的多种木糖异构酶，W及与运些木糖异构酶具 有高序列同一性的蛋白质，W及它们在真核细胞中的表达。W0212009272公开了包含得自软 弱贫养菌（Abio化ophiadefectiva)的木糖异构酶的构建体和真菌细胞。
[0005] 仍然需要附加的工程化酵母细胞，所述酵母细胞表达木糖异构酶活性W成功利用 木糖，从而允许在发酵期间有效利用得自纤维素类生物质的糖。
【发明内容】
[0006] 本发明提供重组酵母细胞，所述重组酵母细胞被工程化W表达具有木糖异构酶活 性的多肤。
[0007] 因此，本发明提供包含异源核酸分子的重组酵母细胞，所述异源核酸分子编码多 肤，所述多肤具有木糖异构酶活性和氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO: 1的氨基酸 序列具有大于85%的序列同一性，或者与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有大于86%的序列 同一性，其中所述多肤在酵母细胞中具有木糖异构酶活性。
[0008] 在另一方面，本发明提供用于制备具有木糖异构酶活性的酵母细胞的方法，所述 方法包括：
[0009] a)提供酵母细胞；
[0010] b)导入编码多肤的异源核酸分子，所述多肤具有木糖异构酶活性的和氨基酸序 列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%的序列同一性，或者与SEQ IDNO: 3的氨基酸序列具有大于86 %的序列同一性，
[0011] 其中制备具有木糖异构酶活性的酵母细胞。 序列描沐
[0013] 根据下面的详细描述和附带的序列描述可更充分地理解本发明，下面的详细描述 和附带的序列描述形成了本专利申请的一部分。
[0014] 下列序列符合37C.F.R. 1. 821-1. 825 ("对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开 的专利申请的要求一序列规则"）并且符合世界知识产权组织（WIP0)标准ST. 25(2009)和 EP0和PCT的序列表要求（规则5. 2和49. 5 (a-bis)，W及行政性指示的208节和附录C)。 用于核巧酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R. § 1. 822中列出的规定。 W巧]表1 :太糖择构酶《化的沈QIDN0,Pi及经密码子优化W在酿酒酵母中表武的编 ME
[0016]
[00化]*nd=未设计
[0019] SEQIDNO:13是包含IL化-巧1A(R蝴-ILV5t嵌合基因的抑R81载体的核巧酸序 列。
[0020] SEQIDNO: 14是P5整合载体的核巧酸序列。 阳02USEQIDNO: 15是URA3缺失序列特异性扩增区域的核巧酸序列。
[0022] 沈QIDNO: 16是上游ura3A后缺失区的核巧酸序列。
[0023] 沈QIDNO: 17是下游ura3A后缺失区的核巧酸序列。
[0024] 沈QIDNO:18是上游hiS3A后缺失区的核巧酸序列。 阳02引 SEQIDN0:19是下游his3A后缺失区的核巧酸序列。 阳0%] 沈QIDNO:20是PJT254的核巧酸序列。
【具体实施方式】
[0027] 可使用下列定义阐释权利要求和说明书：
[002引如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"或"含有"，或者其任何其它变型旨在包 括非排它的包括。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限 于那些元素，但可W包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品 或设备固有的元素。此外，除非明确指明相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的"或"。 例如，条件A或B满足下列任一项：A为真实的（或存在的）且B为虚假的（或不存在的）， A为虚假的（或不存在的）且B为真实的（或存在的），W及A和B均为真实的（或存在 的）。
[0029] 此外，设及元素或组分例子（即出现）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在为非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少 一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0030] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的 任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
[0031] 如本文所用，用术语"约"修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变 化，它们可能发生在例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序 中；运些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的 差异中；等。术语"约"还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而 不同的量。无论是否由术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术 语"约"指在报告数值10%范围内，优选地在报告数值5%范围内。
[0032] 术语"木糖异构酶"是指催化D-木糖和D-木酬糖的互变的酶。木糖异构酶狂I) 属于被分类为EC5. 3. 1. 5的酶的组。
[0033] 术语"木糖利用途径"是指代谢途径，其包含编码足W将木糖转化成目标化学制品 的酶的基因。在目标化学制品为乙醇的情况下，此类途径通常包含编码W下酶的基因：木 酬糖激酶狂KS1)、转醒醇酶灯AL1)、转酬醇酶1灯化1)、D-核酬糖-5-憐酸-3-表异构酶 (RPE1)W及核糖5-憐酸酬醇异构酶（服11)。该途径的元件对宿主细胞可W是天然的或异 源的。
[0034] 术语"基因"是指表达特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段，其可任选地包含 位于编码序列之前的调控序列巧'非编码序列）和位于编码序列之后的调控序列（3'非 编码序列）。"天然基因"或"野生型基因"指具有其自身调控序列的天然存在的基因。"嵌 合基因"指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码 序列。因此，嵌合基因可包含来源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包含来源于同一 来源但W不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。"内源性基因"是指在生物体 基因组中处于其天然位置的天然基因。"外来基因"指正常情况下不存在于宿主生物体内的 基因，它通过基因转移被导入宿主生物体内。外来基因可W包括插入到非天然生物体内的 天然基因，或嵌合基因。
[0035] 术语"启动子"或"启动控制区"是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA 序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个来源于天然基因，或者 由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域 内的技术人员应当理解，不同的启动子可W在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发 育阶段，或者响应于不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大 多数情况下引起基因表达的启动子称为"组成型启动子"。
[0036] 如本文所用，术语"表达"指衍生自基因的编码（mRNA)或功能性RNA的转录和稳 定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肤。"超表达"指在转基因生物体内产生的基因产物 超出在正常生物体或未转化生物体内产生的基因产物的水平。
[0037] 如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定 遗传。经转移的核酸可W是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些经转移的核酸可W被整 合到宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为"转基因"或"重组"或"转 化"生物体。
[003引如本文所用，术语"质粒"和"载体"是指通常携带有不属于细胞中屯、代谢的部分 的基因的染色体外元件，并且通常是环状双链DNA分子的形式。运类元件可W是来源于任 何来源的自主复制序列、基因组整合序列、隧菌体、或者单链或双链DNA或RNA的核巧酸序 列（线性或环状），其中多个核巧酸序列已连接或重组到一种独特构建体中，该独特构建体 能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3'末端非翻译序列一起导入细胞 中。
[0039] 术语"可操作地连接"指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序 列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该编 码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列 可W按有义或反义的取向可操作