异性序列使用了距离靶基因的多聚A末尾的109±8碱基上游部分的20±5个碱基，这是为了在后续的通过IVT进行的扩增工序中将扩增产物大小统一为约200碱基。通过使PCR产物大小统一，能够省去复杂的大小分级纯化工序(电泳一切胶一PCR产物的提取、纯化)，具有能够直接用于从I分子进行的平行扩增(乳液PCR等)的效果。然后，将T7RNA聚合酶导入到细孔中，合成CRNA83 (图8(e))。通过该过程，合成约1000拷贝左右的cRNA。进而，为了合成用于emPCR的双链DNA，以扩增的cRNA为模板，与添加有PCR扩增用共有序列(Reverse)的多个(?100种)靶基因特异性序列引物91杂交(图9(f))，合成cDNA(图9(g))。进而，与前面的实施例同样地使用酶使cRNA分解后，使用Forward公共引物合成第二链92，从而合成了 emPCR用双链DNA93(图9(h))。该扩增产物长度一致，可直接进行emPCR、第二代测序。在该工序中，即使在基因间或分子间发生扩增偏好，也能够在取得第二代测序数据后，利用分子识别标签对扩增偏好进行校正，因此能够获得高精度的定量数据，这与前面的实施例是同样的。
[0122]接下来，以具有图7记载的核酸提取器件的单元结构的图10所示的装置构成，记述一系列的工序的具体情况。图10(b)是图10(a)的A-A’截面，图10(c)是对应于图10(a)的B-B’截面的剖面图。从细胞入口 308导入细胞I并将细胞捕捉于细胞捕获部2，合成第一cDNA链，至此，与实施例1是同样的。合成第一 cDNA链后，在85°C保温1.5分钟使逆转录酶失活，冷却至 4°C后，将 10mT,含有 RNase 和 0.1 % Tween20 的 1mM Tris Buffer (pH =8.0)从入口 305注入并从出口 306、307排出，从而使RNA分解，使等量的碱性改性剂同样地流动，对细孔内的残留物和分解物进行除去、洗涤。然后，将灭菌水690 μ L、10x Ex TaqBuffer (TaKaRa B1 公司)100 μ L、2.5mM dNTP Mix 100 μ L、各 10 μ M 的添加有 PCR 扩增用共有序列(Reverse)的20种基因特异性序列引物MixlOO μ L以及Ex Taq Hot startvers1n (TaKaRa B1公司)10 μ L混合，将充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口 306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口 305注入。然后，进行95°C 3分钟一44°C 2分钟一72°C 6分钟的反应，使引物的基因特异性序列以第一 cDNA链为模板进行退火后，进行互补链延伸反应，合成第二 cDNA链。
[0123]然后，使1mL含有 0.l%Tween20 的 1mM Tris Buffer (pH = 8.0)从入口 305 注入并从出口 306、307排出，从而对细孔内的残留物和分解物进行除去、洗涤。进而，将灭菌水340 μ L、AmpliScribe 1X React1n Buffer (EPICENTRE 公司)100 μ L、10mM dATP 90 μ L、10mM dCTP 90 μ L、100mM dGTP 90 μ L、100mM dUTP 90 μ L、100mM DTT 以及 AmpliScribeT7Enzyme Solut1n (EPICENTRE公司)100 μ L混合，使充满上部反应区域7和下部反应区域8的溶液从出口 306和307排出，立即将含有逆转录酶的上述溶液从入口 305注入。然后，使溶液的温度提高至37°C，保温180分钟，从而完成逆转录反应，进行cRNA扩增。由此，20种靶基因的目的部分被扩增，cRNA扩增产物大小大体均匀，均为200 ±8碱基。回收膜的细孔内部和外部的溶液中蓄积的cRNA扩增产物溶液。以将该溶液中所含的酶等残留试剂除去为目的，使用PCR Purificat1nKit (QIAGEN公司)纯化，悬浮于50 μ L灭菌水。将1mM dNTP mix 10 μ L和50ng/ μ L的随机引物30 μ L与该溶液混合，94°C加热10秒后，以0.20C /秒的速度使温度降低至30°C，30°C加热5分钟，进一步降低至4°C。然后，与5xRTBuffer (Invitrogen 公司)20 μ L、0.1M DTT 5 μ L、RNase OUT 5 μ L 以及 SuperScript III5 μ L混合，30°C加热5分钟，以0.20C /秒使温度上升至40°C。以将该溶液中所含的酶等残留试剂除去为目的，使用PCR Purificat1nKit (QIAGEN公司)纯化，应用于emPCR扩增后，应用于各公司(Life Technologies、Illumina, Roche)的第二代测序进行分析。
[0124](实施例3)
[0125]利用实现了按单个细胞进行的基因分析的核酸提取器件，能够对细胞的个性/状态进行识别。另一方面，在非侵入式显微镜观察中，能够以活细胞状态对细胞的形态、化学组成进行测定。然而，仅通过来自显微镜图像的信息对细胞的状态进行识别时，细胞的个性/状态多样且不稳定，因此是极为困难的。本实施例中，显示了用于组合通过按单个细胞进行的基因分析来识别细胞个性与非侵入成像的器件和装置构成。当以使用具有图3(a)、图7(a)那样的器件结构的设备捕捉了细胞的状态进行显微镜观察时，即使珠子、细孔片是由透明的材料制成的，其材料的折射率一般也与溶液的折射率不同，因此，激发光、照射光发生散射，产生解析度的降低、背景光水平的上升的问题。在本实施例中，显示组合了以图2的构成为典型例的核酸提取器件和光学显微镜的例子。
[0126]图11显示本实施例中的核酸提取器件的结构和装置。图11(b)是图11(a)的A_A’截面，图11(c)是对应于图11(a)的B-B’截面的剖面图。在本例中，研究了 PDMS制的基板6的形状，虽然核酸捕获部在细胞的下方，但并非配置于正下方，设置周围为环状的区域并将磁珠12填装于该部分。通过在垂直于基板平面的方向上施加电场，从而mRNA等核酸通过电泳被导入填装成环状的珠子部分，被珠子表面的DNA探针捕捉。以下的工艺与实施例1的情况是同样的。用PDMS制作的细胞捕获部的直径设为16 μm，细胞捕获部的正下方的显微镜窗1101的直径设为25 μ m、高度设为15 μ m。此外，关于细孔阵列片35，也以对应于细胞捕获部正下方的部分未形成细孔的方式，在阳极氧化时利用抗蚀剂掩模进行保护。这里，未进行阳极氧化的图案化，使显微镜窗1101的厚度比垂直于显微镜光学系统的器件面的方向的焦点深度厚，从而也能够减小细孔阵列片导致的散射的影响。
[0127]此外，如图12所示，还可以不将核酸捕获部配置于细胞的周围，而是配置于旁边。图12(b)是图12(a)的A-A’截面，图12(c)是对应于图12(a)的B-B’截面的剖面图。在该例子中，1201为核酸捕获部。这种情况也是将DNA探针固定于珠子上并捕捉mRNA。其他器件的构成和样品制备方法与实施例1是同样的。
[0128]此外，图11、12中，将填装有珠子的区域作为核酸捕获部，毋庸置疑，通过与将细孔阵列片作为核酸捕获部的实施例2同样地对形成细孔的部分进行限制，能够不使用珠子来制作与图11和12所示构成同样的构成。
[0129]使用这样的核酸提取器件，为了进行基因表达分析而将细胞破碎并进行详细的基因表达分析，在此基础上，进行高解析度的活细胞状态下的形状、通过荧光染色进行的基因、蛋白质的定量或拉曼成像，能够使这些成像数据与基因表达分析数据相对应。以下对用于实现上述目的的系统构成进行说明。
[0130]首先，图13显示，对于为了构成核酸提取器件而配置于平面状的器件(细胞阵列1320和细孔阵列片1321等)上的细胞样品，将利用光学显微镜进行的测定与使用上述器件得到的基因表达分析结果针对各个细胞的数据相对应，从而用于详细地测定细胞的动态的最小的系统构成。
[0131]1200表示核酸提取器件和配置于该器件上的细胞样品。1201是图11所代表的用于从细胞提取mRNA和进行核酸扩增的流通系统。该流通系统中，通过对来自细胞的mRNA进行处理，获得为利用第二代(大规模)DNA测序仪1205来确定序列所需的量、且具有一定长度、末端包含记录了核酸处理前的信息的标签序列的扩增产物。这里，箭头1211也表示扩增产物的移动。另一方面，器件上的细胞以事先确定了细胞在器件上的位置的形式利用光学显微镜1203进行观察。这里，细箭头表示信息的移动。作为光学显微镜1203，包括相位差显微镜、微分干涉显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦荧光显微镜、拉曼显微镜、非线性拉曼显微镜(CARS显微镜、SRS显微镜、RIKE显微镜)、IR显微镜等。利用这些光学显微镜获得的信息仅与基因信息相关，获得的信息少。然而，基本上，能够进行活细胞状态下的测定，能够测定细胞的经时变化，能够实时测定细胞对刺激的应答。通过利用保存有器件上的位置信息的器件，能够使有关基因表达的详细信息与通过显微镜获得的包括时间变化的信息相对应。为了实现上述目的，需要在系统内设置对来自第二代(大规模)DNA测序仪的序列信息1212、光学显微图像的信息1213以及对应于标签序列的位置信息1214进行整合的信息系统1206。本发明中，对上述说明的细胞的测定信息进行整合的系统的最小构成是第二代(大规模)DNA测序仪1205以外的部分的系统1207，是具有DNA测序仪的信息的输入和样品(核酸扩增产物)的输出的系统。
[0132]图13显不组合有焚光显微镜作为光学显微镜的系统构成例。1203是焚光显微镜。细胞I中，在欲测定的蛋白质(例如P53)中表达GFP，或者通过免疫染色在特定蛋白中导入荧光体。如此操作获得的各个细胞中的表达蛋白质量的数据，通过在细胞破碎后在核酸提取器件中对样品进行处理、DNA测序进行定量而获得的基因表达数据可与各个细胞相关。此时，为了对细胞进行识别，通过利用DAPI对核酸进行染色从而对细胞核进行识别，利用荧光显微镜来识别细胞位置。蛋白质的量通过GFP的表达来测定，因此能够追踪经时变化，能够同时测定的蛋白质的种类为数种左右。另一方面，利用测序进行的基因表达分析可以为一次100种左右，如果准备了探针，则能够进行1000种的分析。因此，可针对各个细胞获得细胞内的详细的基因表达控制的相关信息。然而，其并不能获得经时变化。然而，如果通过将两者组合，事先获得何种蛋白质表达时是何种基因表达的数据，则能够仅从蛋白质的表达数据推测基因控制相关信息。这样，利用信息系统1206，进行荧光显微镜数据与基因表达数据的比对以及基因控制相关信息的推测。
[0133]接下来，显示荧光显微镜1203的构成的详细情况。1300是光源，在这里，是水银灯。1301是决定激发波长的激发滤光片，1302是分光镜，1303是选择接收光波长的发射滤光片。当在细胞中导入多种荧光体并同时进行测定时，用控制器1304对1301、